CN103212093A - 一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用。所述磁性纳米材料能够特异性地结合组织细胞表面高表达的铁蛋白受体，能够进入细胞内。这种材料能够广谱、特异性地结合各种高表达铁蛋白受体的组织细胞，在动物模型上能够实现高效的细胞靶向性。不仅能够作为一种磁共振造影剂和荧光分子探针用于疾病诊断，而且可以作为药物的载体，用于疾病的治疗。

Description

一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用
技术领域
本发明属于仿生合成、纳米技术、分子影像、生物医药的交叉领域。具体地说，本发明涉及一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用。
背景技术
磁共振成像（MRI）具有无伤害性、分辨率高的独特优势，因而是一个非常好的影像工具来用于疾病的早期诊断。但是其灵敏度低，无法很好地与区分病变组织与正常组织，检测没有特异性，这些都是MRI固有的一些缺点[Terreno et al.,2010]。为了克服灵敏度低的这个缺点，研究人员尝试合成各种MRI造影剂（contrast agent，又称对比剂）来缩短纵向弛豫时间（longitudinalrelaxation time,T1）或者横向弛豫时间（transverse relaxation time，T2）来增强磁共振的灵敏度和组织对比度。MRI造影剂弛豫时间可以划分为T1造影剂和T2造影剂。T1造影剂通过缩短T1来增强信号强度，在T1加权图像上使得目标区域变亮。这类造影剂大多是利用镧系金属元素钆（Gd）或者其衍生的材料，它们是现在临床上应用最为广泛的MRI造影剂，但是经过近30年的临床使用，钆基造影剂出现了诸多缺陷，如灵敏度低、半衰期短和副作用大。例如，2007年和2010年美国FDA相继发出通告，钆基造影剂给特定肾病患者导致致命的肾源系统性纤维化（FDA news release，FDA Requests Boxed Warning forContrast Agents Used to Improve MRI Images，5/23/2007;FDA news release，FDA:New warnings required on use of gadolinium-based contrast agents，9/9/2010）。
T2造影剂主要是超顺磁铁氧化物（SPIO）颗粒，当磁共振成像仪采用T2和T2 *加权成像序列时，使得SPIO所在的区域质子信号降低，在图像上表现为暗信号。与传统的Gd基造影剂相比，SPIO颗粒具有以下优点：（1）灵敏度高：每个金属单元都可以最大程度地改变MRI信号强度，尤其是在T2 *加权图像上，可显著地提高信噪比（SNR）；（2）体内可代谢清除：铁在生物体内是可以代谢的，超顺磁性磁铁矿的铁可用于机体的铁循环；（3）易于进行表面修饰，可以连接不同的功能团和配体；（4）进入生物体内，它还可以通过光学显微镜以及电子显微镜进行观察；（5）它们能够通过化学合成条件去改变粒径、形状等因素来调控它们的磁学性质和弛豫效能，因而SPIO颗粒是一种很有发展前途的MRI造影剂[Bulte and Kraitchman,2004]。
另外，磁性纳米材料具有比表面积大、装载效率高和磁化率高等特性，因而是优良的药物载体，它可延长药物作用时间，增强药物效应，减轻毒副反应，提高药物的稳定性，防止不稳定药物降解。因此，磁性纳米材料已经成为高效药物运载系统的一个理想选择，有望克服传统的化学治疗药物给药方式剂量大、毒副作用强、效率低、稳定性差等缺陷。
然而，传统的磁性纳米材料都是通过物理化学方法合成，尽管合成方法已经发展多年，但是迄今为止没有任何一种方法能够同时合成具有粒径形状均一、高分散性、亲水性和高生物相容性这些特性为一体的磁性纳米材料，通常的磁性纳米材料合成需要剧烈的物理化学条件（高温、高压、高pH），合成后需要昂贵、繁琐复杂的表面修饰，才能保证磁性纳米材料的高分散性、亲水性和生物相容性。另外，在磁性纳米材料的生物医学应用方面，物理化学合成的磁性纳米材料对细胞没有特异的靶向性，进入体内后容易被网状内皮系统（reticuloendothelia system,RES）吞噬，为了实现体内的特定细胞靶向性，传统的磁性纳米材料必须通过复杂的表面修饰和连接对特定细胞（如肿瘤细胞）有特异性的配体，如抗体、肽段、靶向性小分子等[Harisinghani et al.,2003;Linet al.,2010;McCarthy et al.,2007]。然而，传统的依靠化学表面修饰和偶联靶向配体的磁性纳米材料存在着诸多不足；（1）修饰和连接靶向配体步骤复杂，且很难定量和保证均匀性；（2）磁性纳米材料经过修饰后，往往会改变其粒径和表面特性等特征；（3）对病灶组织的靶向亲和性低，仍然大量被网状内皮系统吞噬（这类材料的最大缺点）；（4）另外进入体内后往往还存在稳定性的问题，如磁性纳米材料表面连接的靶向多肽进入体内后，容易产生非特异性吸附，被蛋白酶降解，通常需要在其表面连接多个靶向分子或者加入D-氨基酸来防止降解，因而无法实现疾病的早期诊断和治疗[Byrne et al.,2008;Lee etal.,2007;McCarthy et al.,2010]。
当磁性纳米材料的传统物理化学合成遇到高耗能、难修饰等问题时，自然界的生物矿化作用和生物仿生合成为磁性纳米材料的合成提供了另外一条思路。生物矿化作用是指通过基因或生物大分子的调控在生理条件下形成无机矿物的过程。生物仿生合成是指在理解生物矿化机理的基础上，模仿生物矿化中无机物在有机物调制下形成过程的无机材料合成，使得其所形成的材料具有均一的尺寸、特定的组装结构和特定的生物大分子膜所包被。生物仿生合成只需简单步骤、绿色低耗能就能够同时合成具有粒径形状均一、高分散性、亲水性和高生物相容性的磁性纳米材料。其中铁蛋白和趋磁细菌Mms6蛋白仿生合成超顺磁磁性材料是典型代表。
铁蛋白，是参与和维持生物有机体铁代谢的重要铁储存蛋白，广泛存在于动植物及微生物细胞中。它们具有典型的核－壳型纳米结构：内核为水合氧化铁颗粒（6-8nm），外壳由24个蛋白亚基自组装构成的笼状蛋白壳（12nm）。铁蛋白壳的形成受生物体基因高度控制，粒径、形状极其均一，为仿生制备超细SPIO颗粒提供了天然的生物纳米反应器[Harrison and Arosio,1996;Uchidaet al.2007]。更为重要的是，许多快速生长的细胞(如肿瘤细胞)，需要大量的铁元素营养，都高表达铁蛋白受体。Fargion等人用人白血病癌细胞K562、HL-60细胞系和小细胞肺癌细胞NCI-417对人的全重链（H）亚基铁蛋白、全轻链（L）亚基铁蛋白以及它们的杂合体铁蛋白进行了结合实验研究，结果表明K562细胞能特异性地结合人H亚基铁蛋白和人H、L杂合体铁蛋白。结合人铁蛋白的结合常数Ka高达3×108M-1[Fargion et al.,1988]。Moss等对高度增殖的肿瘤细胞和正常细胞上的人H亚基铁蛋白特异性受体进行了研究，发现肿瘤细胞上高度表达人H亚基铁蛋白特异性受体，而正常细胞几乎检测不到这种受体的表达[Moss et al.,1992]。最近，Li等的实验研究发现：人转铁蛋白受体1（TfR1）是一个人H亚基铁蛋白和转铁蛋白的共受体，能够特异性地结合人H亚基铁蛋白，并将其内吞进入内含体和溶酶体[Li et al.,2010]。当机体处于炎症过程中，会分泌大量的炎症因子，从而刺激炎症细胞高表达铁蛋白受体，以维持大量的铁源需要[Fahmy and Young,1993;Byrd and Horwitz,2007]。
天然铁蛋白的内核是磁化率低（弱磁性）、弛豫效能低的水合氧化铁，严重地限制了其直接作为磁性纳米材料在生物医学中的应用，如何将弱磁性的内核转变为强磁性的内核（如磁铁矿和/或磁赤铁矿）是解决铁蛋白应用的关键。具有强磁性的磁铁矿内核的磁性铁蛋白于1992年首次被Meldrum等人合成，但是由于合成工艺不成熟，许多的铁沉积在蛋白壳表面，这种磁性铁蛋白不仅容易聚集，而且进入体内不具有肿瘤靶向性，易被网状内皮系统吞噬[Meldrumet al.,1992;Moskowitz et al.,1997;Bulte et al.,1995]。目前国外最新的进展是，Uchida等人用基因工程表达的人H亚基铁蛋白或融合RGD的人H亚基铁蛋白为模板，仿生合成了具有磁铁矿或者磁赤铁矿内核的磁性铁蛋白，但是其磁滞回线的数据表明，他们合成的磁性铁蛋白在80000高斯（8T）都未饱和（正常亚铁磁性的磁铁矿或者磁赤铁矿在<1 T就能饱和），从而表明由于合成的工艺限制，所合成的磁性铁蛋白成分复杂，并不仅仅含有亚铁磁性的磁铁矿或者磁赤铁矿，而且含有反铁磁性或顺磁性的成分[Uchida et al.,2006,Figure 7]。而且体内外实验表明，该材料在体内的应用仍然与普通化学合成的磁性纳米材料一样，应用于巨噬细胞增多的疾病诊断。如Terashima等用该磁性铁蛋白进行动脉粥样硬化动物模型的实验，发现该材料可以被血管的巨噬细胞吞噬，作为磁共振造影剂用于动脉粥样硬化的诊断[Uchida et al.,2008;Tetashima et al.,2011]。迄今为止，尚未有关于磁性铁蛋白用于靶向诊断肿瘤的报道。我们实验室于2010年在改进前人磁性铁蛋白合成方法的基础上，直接应用基因工程表达的空壳人H亚基铁蛋白为纳米反应器，只需一步仿生矿化反应即可形成具有完整铁蛋白壳包裹的核-壳型磁性纳米材料，具有粒径和形状均一、单分散性、水溶性等材料特性。这种人源磁性铁蛋白的合成为铁蛋白仿生磁性纳米材料的体内应用带来新思路[Cao et al.,2010；中国发明专利：200910244505.1；201010541069.7]。
趋磁细菌是一类能够沿着磁场方向定向运动的微生物，发现于上世纪60-70年代，广泛分布在湖泊、海洋甚至湿土中，目前仅在我国沉积物中就已发现了10余种趋磁细菌新类群[lin et al.,2011]。趋磁细菌形态多样，主要包括球菌、弧菌、螺旋菌、杆菌和多细胞聚集体等，在系统发育上属于变形菌门和硝化螺旋菌门。这类微生物的共同特征是在体内合成链状排列、化学纯度高、由生物膜包裹的纳米级磁铁矿（30-120nm）磁小体。不同种类趋磁细菌合成的磁小体具有特定的晶体形状，立方八面体、假六棱柱和子弹头形。作为由天然生物膜包被的单磁畴磁性纳米材料，磁小体在生物医学和材料学等领域具有广阔的开发应用前景[Arakaki et al.,2008]。趋磁细菌的磁小体表面存在大量的膜蛋白，这些蛋白调控着纳米磁铁矿的形成。Mms6蛋白是趋磁细菌的一个重要膜蛋白，它紧密地吸附在磁小体的表面，体外和体内实验都证明Mms6蛋白能够调控磁铁矿的形状和大小。然而过去的仿生合成仍然过多地依靠剧烈的对于蛋白变性不利的化学条件（温度达到90°C或者加入聚合凝胶来控制粒径），并没有发挥出趋磁细菌在常温常压就能高效控制粒径、形状和结晶度的优势，因而如何改进仿生合成工艺，实现趋磁细菌膜蛋白仿生合成是急需解决的科学问题[Arakaki et al.,2003;Arakaki et al.,2007;Prozorov et al.,2007;Arakaki et al.,2010]。
由于生物蛋白质仿生合成磁性纳米材料往往是在低耗能（低温、低压、低pH）条件下进行，仿生过程具有高效、有序、自组装等特点，其所得到的材料具有粒径均一、形状一致、高分散性和亲水性等诸多的材料学优势，本领域需要解决的核心问题是，如何优化和运用这些生物矿化蛋白合成蛋白包裹的新型磁性纳米材料。利用铁蛋白外壳具有天然的细胞靶向性，能跟高度增殖的细胞表面高表达的铁蛋白受体结合，改进合成方法，实现蛋白仿生磁性纳米材料对高表达铁蛋白受体的细胞靶向性，尤其是体内靶向性，作为一种新型磁共振造影剂和荧光分子探针用于疾病的早期诊断，作为一种新型的药物载体实现高效的药物输送，进行靶向治疗。从而实现蛋白包裹的磁性纳米颗粒的三重功能：(1)蛋白的高度均一的笼形结构使得磁性纳米颗粒粒径和形状高度均一、高分散性、水溶性以及生物相容性；（2）外面包被的铁蛋白壳同时实现了靶向性，这种靶向性不同于传统的靶向性磁性纳米材料，不需要连接和修饰靶向配体，是一种天然固有的细胞靶向性；（3）高比表面积的磁性纳米颗粒和蛋白壳的核壳型结构成为高效的药物输送载体。本发明就是基于上述研究思路开展的。
发明内容
本发明旨在提供具有细胞靶向性的磁性纳米材料在疾病的诊断和治疗方面的新用途。
在本发明的第一方面，提供了一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备成像定位诊断试剂和治疗物质中的应用。
在另一优选例中，所述成像定位诊断试剂选自磁共振造影剂或分子探针。
在另一优选例中，所述的磁共振造影剂或分子探针含有所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或衍生物。
在另一优选例中，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分为含有金属元素的化合物，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
在另一优选例中，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的蛋白壳可以特异性地与组织或细胞表面表达的受体结合；较佳地，所述蛋白壳选自铁蛋白（ferritin）、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白或具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳；较佳地所述铁蛋白包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（L）链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物通过下述步骤制备得到：
(a)以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到pET11b质粒上；
(b)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细胞BL21(DE3)plysS，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷激活T7启动子，诱导表达；
(c)表达结束后进行超声破碎释放蛋白；
(d)对蛋白进行分离和纯化；
(e)将形成内核成分的金属盐类和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为7-11，控制温度为25-80℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；形成内核成分的盐类的浓度为每次加入的金属元素原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，使每个蛋白分子加入的金属元素原子数可在100-15000之间；氧化剂的浓度为每次加入氧化剂的分子数与加入金属元素离子的原子数之比为2∶1或3∶1；蛋白浓度>0.25mg/ml；和
(f)排阻或离子交换层析进行分离，离心和分子筛或阴离子交换层析纯化后得到所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物。
在另一优选例中，步骤(e)控制pH值为8-9。
在另一优选例中，步骤(e)控制温度为35-70℃。
在另一优选例中，所述形成内核成分的金属盐类选自亚铁盐、铁盐、钆盐、锰盐、钴盐和/或镍盐。
在另一优选例中，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
在另一优选例中，所述氧化剂选自过氧化氢、氧气以及通过反应可以产生过氧化氢或氧气的物质。
在另一优选例中，每个蛋白分子加入的金属元素原子数在140-10000之间。
在另一优选例中，每个蛋白分子加入的钆原子数在100－200，和/或每个蛋白分子加入的铁原子数在500-10000之间。
在另一优选例中，所述治疗物质为治疗表达铁蛋白受体的疾病的物质；较佳地，所述物质连接有包裹磁性纳米颗粒的蛋白壳；更佳地，所述物质选自化疗药物、放射性同位素、细胞因子、核酸、抗癌或抗炎症药物。
在另一优选例中，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤和/或炎症；较佳地，所述的肿瘤选自肝癌、白血癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。
在本发明的第二方面，提供了一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备用于诊断表达铁蛋白受体的疾病的磁性造影剂和分子探针中的应用。
在另一优选例中，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤、和/或炎症；较佳地，所述的肿瘤选自乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血癌、或前列腺癌。
在本发明的第三方面，提供了一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分为含有金属元素的化合物，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
在另一优选例中，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素的化合物。
在另一优选例中，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有钆元素的化合物。
在另一优选例中，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素和锰元素的化合物。
在另一优选例中，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素和钆元素的化合物。
在另一优选例中，所述蛋白壳选自铁蛋白（ferritin）、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白或具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳；所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的蛋白壳可以特异性地与组织或细胞表面表达的受体结合；较佳地，所述铁蛋白包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（L）链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。
在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的制备方法，所述方法包括步骤：
(a)以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到质粒pET11b上；
(b)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细胞BL21(DE3)plysS，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷激活T7启动子，诱导表达；
(c)表达结束后进行超声破碎释放蛋白；
(d)对蛋白进行分离和纯化；
(e)将形成内核成分的盐类和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为7-11，控制温度为25-80℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；形成内核成分的盐类的浓度为每次加入的金属元素原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，使每个蛋白分子加入的金属元素原子数在100-11000之间；氧化剂的浓度为每次加入氧化剂的分子数与加入金属元素离子的原子数之比为2∶1或3∶1；蛋白浓度>0.25mg/ml；和
(f)排阻或离子交换层析进行分离，离心和分子筛或阴离子交换层析纯化后得到所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物。
在另一优选例中，步骤(e)控制pH值为8-9。
在另一优选例中，步骤(e)控制温度为35-70℃。
在另一优选例中，所述形成内核成分的盐类选自亚铁盐、铁盐、钆盐、锰盐、钴盐和/或镍盐。
在另一优选例中，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
在另一优选例中，所述金属元素是铁元素。
在另一优选例中，所述金属元素是锰元素。
在另一优选例中，所述金属元素是钆元素。
在另一优选例中，所述金属元素是锰元素和铁元素。
在另一优选例中，所述金属元素是钆元素和铁元素。
在另一优选例中，所述氧化剂选自过氧化氢、氧气以及通过反应可以产生过氧化氢或氧气的物质。
在另一优选例中，每个蛋白分子加入的金属元素原子数在140-10000之间。
在另一优选例中，每个蛋白分子加入的钆原子数在100-200，和/或每个蛋白分子加入的铁原子数在500-10000之间。
据此，本发明提供具有细胞靶向性的磁性纳米材料在疾病的诊断和治疗方面的新用途。
附图说明
图1是按实施例1制备的含有磁铁矿（Fe3O4）内核的人H亚基磁性铁蛋白的结构分析；其中
a，电镜负染照片；b，核的电镜照片；c，核的粒度分布图；d，核的选区电子衍射（SAED）图；e，圆二色光谱分析蛋白构象.
图2是按实施例2制备的铁蛋白壳包裹的锰铁氧化物核的磁性纳米材料；其中，图2a,锰铁氧化物核的电镜照片；b，核的粒度分布图；c,锰铁氧化物的磁滞回线（与单纯含有磁铁矿（Fe3O4）内核的人H亚基磁性铁蛋白相比较）；d,铁蛋白壳包裹的锰铁氧化物核的能谱元素分析图。
图3是按实施例3应用趋磁细菌膜蛋白Mms6仿生合成的磁性纳米材料；其中图3a,带His标签的Mms6蛋白的原核表达和纯化图；b，利用His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的电镜照片；c,His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的高分辨电镜照片（晶格条纹）；d,His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的X射线电子衍射（XRD）图。
图4流式分析人H亚基磁性铁蛋白能与多种高表达铁蛋白受体的细胞特异性结合。
图5流式分析表达铁蛋白受体的细胞和人H亚基磁性铁蛋白的特异性结合和竞争性抑制；其中a-b，应用Western免疫印记和荧光定量PCR检测和筛选高表达铁蛋白受体的MDA-MB-231细胞和不表达铁蛋白受体的MX-1细胞；c,流式分析MDA-MB-231细胞与人H亚基磁性铁蛋白的特异性结合和蛋白壳与铁蛋白受体抗体的竞争性抑制；d，流式分析MX-1细胞与人H亚基磁性铁蛋白的结合。
图6人H亚基磁性铁蛋白作为磁共振造影剂的弛豫效能测定；其中a，人H亚基磁性铁蛋白在不同铁浓度条件下的T2加权图像；b，不同铁浓度计算得到的横向弛豫率(R2)的拟合曲线。
图7人H亚基磁性铁蛋白作为磁共振造影剂应用于体外表达铁蛋白受体的细胞磁共振成像检测；其中a，不加材料的对照MDA-MB-231细胞（高表达铁蛋白受体）磁共振图像；b，加材料孵育5.5h后的MDA-MB-231细胞磁共振图像；c，对照MDA-MB-231细胞的普鲁士蓝染色图；d，加材料孵育5.5h后的MDA-MB-231细胞的普鲁士蓝染色图;e，不加材料的对照MX-1细胞（不表达铁蛋白受体）磁共振图像；f，加材料孵育5.5h后的MX-1细胞磁共振图像；g，对照MX-1细胞的普鲁士蓝染色图；h，加材料孵育5.5h后的MX-1细胞的普鲁士蓝染色图。
图8磁共振成像（MRI）分析人H亚基磁性铁蛋白能够在体内特异性地靶向铁蛋白受体表达的组织，引起MRI图像信号强度的明显变化；该材料在组织内的特异性富集得到组织学铁染色结果的验证；其中
图8a-c是表达铁蛋白受体的MDA-MB-231荷瘤小鼠、铁蛋白壳竞争性抑制MDA-MB-231荷瘤小鼠、低表达铁蛋白受体的MX-1荷瘤小鼠的T2 *MRI图像，d，对T2 *MRI图像的肿瘤部位的定量结果；e，MDA-MB-231荷瘤小鼠、铁蛋白壳竞争性抑制MDA-MB-231荷瘤小鼠、低表达铁蛋白受体的MX-1荷瘤小鼠的肿瘤组织铁染色结果，比例尺是20μm。
图9荧光示踪实验分析人H亚基磁性铁蛋白能够在体内特异性地靶向性的机理是通过结合肿瘤细胞表面高表达的TfR1；其中a,高表达铁蛋白受体的MDA-MB-231肿瘤组织的材料与TfR1的荧光共定位图；b，低表达铁蛋白受体的MX-1肿瘤组织的材料与TfR1的荧光共定位图,比例尺是50μm。
图10人H亚基磁性铁蛋白作为肿瘤靶向性磁共振造影剂用于约1mm大小的MDA-MB-231人乳腺癌的早期诊断；其中
图10a，b是荷MDA-MB-231微小癌灶裸鼠的T2 *加权磁共振图像；图8c是经过对T2 *加权图像的定量分析以及统计分析结果；图8d-f是T2加权磁共振图像上，对其信噪比（SNR）进行定量分析的结果；图8g是癌灶的石蜡组织切片经过DAB增强的普鲁士蓝铁染色结果,比例尺是20μm；图8h是MDA-MB-231微小癌灶部位的解剖出来后的照片。
图11连接Cy5.5的人H亚基磁性铁蛋白作为荧光分子探针用于约3mm的MDA-MB-231人乳腺癌的早期诊断。
图12人H亚基磁性铁蛋白用于微小肝癌的早期诊断；图中比例尺为1mm，右下角为肿瘤部位放大图像。
图13人H亚基磁性铁蛋白用于微小肺癌的早期诊断；图中比例尺为2mm。
图14人H亚基磁性铁蛋白在裸鼠体内的组织器官分布,比例尺是20μm。
图15肿瘤组织透射电镜超薄切片结果显示连药物后的材料特异性地富集在肿瘤细胞内，是一种肿瘤细胞内化型磁性纳米材料；其中，图15a,肿瘤组织内的肿瘤细胞电镜照片；b，肿瘤细胞和淋巴细胞的电镜照片；c，巨噬细胞的电镜照片。
图16人H亚基磁性铁蛋白携带化疗药物盐酸阿霉素（doxorubicin）对多种肿瘤细胞的细胞毒性试验（MTT法测定）：其中，图16a是材料连接药物后的颜色变化图；b是MTT测定连阿霉素后的材料对肝癌细胞、白血癌细胞、神经胶质瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞的存活率的影响。
图17携带阿霉素的人H亚基磁性铁蛋白对体内肺癌的治疗实验初步结果：其中图17a,肿瘤的体积随着注射药物后天数的变化；b，不同治疗组解剖取出肿瘤后的实际重量；c，不同治疗组解剖取出肿瘤的实物照片。
图18a,18b,18c，18d分别是反应过程中平均每个蛋白分子加入1000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线；图18e,18f，18g，18h分别是反应过程中平均每个蛋白分子加入3000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图，横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线；图18i,18j,18k，18l分别是反应过程中平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线；图18m,18n,18o，18p分别是反应过程中平均每个蛋白分子加入7000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图和横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线;图18q,18r，18s分别是反应过程中平均每个蛋白分子加入10000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图和低温（5K）磁滞回线；图18t用平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白（平均粒径5.2nm）所做的电子能量损失谱（EELS）。
图19a-19d分别是肿瘤大小约3mm的乳腺癌裸鼠模型的T2加权MRI图像，图19e-19h分别是肿瘤大小约3mm的裸鼠的T2 *加权MRI图像(比例尺：5mm；肿瘤部位用红圈标记)；图19i和19j分别是肿瘤原位观察的体视显微镜照片(比例尺：3mm)；图19k和19l分别是对T2加权图像和T2 *加权图像分别进行的定量分析结果（4只模型统计）；图19m和19n是磁共振扫描后的肿瘤的免疫组化图（图中N代表正常组织，T代表肿瘤组织；比例尺：50μm）。
图20a-20d分别是肿瘤大小约1mm的乳腺癌裸鼠模型的T2加权MRI图像，图20e-20h分别是肿瘤大小约1mm的裸鼠的T2 *加权MRI图像（比例尺：1mm；肿瘤部位用红圈标记）；图20i和20j分别是对T2加权MRI图像和T2 *加权像的定量结果（4只模型统计）；图20k是皮下移植乳腺癌的原位体视显微镜照片（比例尺：1mm）；图20l是磁共振扫描后的肿瘤的免疫组化图（图中N代表正常组织，T代表肿瘤组织；比例尺：50μm）。
图21a-21d分别是肿瘤大小约1mm的乳腺癌裸鼠模型注射Cy5.5-铁蛋白前和注射后1.5h、3h和6h的荧光成像后的照片（肿瘤部位用红圈标记）；图21e和图21f分别是将微小MX-1肿瘤、MDA-MB-231肿瘤及其肿瘤周围的正常肌肉组织解剖出来后的白光照片和近红外荧光成像照片。
图22是肿瘤大小约3mm的胰腺癌裸鼠模型注射Cy5.5铁蛋白的近红外活体荧光成像图（肿瘤部位用红圈标记），以及96h后解剖出来的各个组织器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、骨头、肿瘤、肌肉）的荧光成像图。
图23a-23c分别是肿瘤大小约1-2mm的原位神经胶质瘤裸鼠模型注射Gd-DTPA前后的T1加权磁共振扫描图；图23d-f是注射磁性铁蛋白前后的T2加权磁共振成像(回波时间32ms)。图23g-23i是T2 *加权磁共振成像（回波时间4.5ms）。图23j-23l是第二个回波的T2 *加权磁共振成像（回波时间12ms）。（比例尺：2mm；肿瘤部位用红圈标记）。
图24a-24d分别是原位胰腺癌裸鼠模型在注射磁性铁蛋白前后的T2加权和T2 *加权磁共振成像图（比例尺：2mm；肿瘤部位用红圈标记）。图24e是磁共振扫描后裸鼠仰卧位解剖出来的腹腔器官的原位观察图（胰腺中的肿瘤部位用蓝圈标记）。
图25a是对不同钆浓度（0-1mM）的商品化Gd-DTPA(马根维显，拜耳公司生产)的T1加权磁共振成像图（回波时间为TE=8.5ms,反转时间TR=300ms）；图25b是对不同Gd浓度Gd-DTPA所测得的纵向弛豫时间的倒数（R1=1/T1）的线性关系图；图25c是对不同钆浓度（0-1mM）的铁蛋白-钆-铁复合物的T1加权成像图（TE=8.5ms，TR=300ms）；图25d是对不同Gd浓度的铁蛋白-钆-铁复合物所测得的纵向弛豫时间的倒数（R1=1/T1）的线性关系图；图25e是对不同钆浓度（0-1mM）的铁蛋白-钆-铁复合物的T2加权成像图（TE=8.5ms）;图25f是对不同铁浓度的铁蛋白-钆-铁复合物所测得的横向弛豫时间的倒数（R2=1/T2）的线性关系图。
图26a-26b分别是原位肝癌裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后的T1加权磁共振成像图；图26c、26d和图26e、26f分别是原位肝癌裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后的T2加权和T2 *加权磁共振成像图（比例尺：5mm；肿瘤部位用红圈标记）。
图27a-27b分别是原位神经胶质瘤裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁造影剂前后的T1加权磁共振成像图;27c-27d注射铁蛋白-钆-铁造影剂前后的T2 *加权磁共振成像图（比例尺：2mm；肿瘤部位用红圈标记）。
图28a是利用人H亚基铁蛋白包裹Gd-DTPA的流程示意图。图28b-28d是原位神经胶质瘤裸鼠移植模型在注射铁蛋白包裹Gd-DTPA复合物前后的T1加权磁共振成像图（比例尺：2mm；肿瘤部位用红圈标记）。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，在中国发明专利申请200910244505.1和201010034208.7的基础上，将利用基因工程重组表达的人H亚基铁蛋白仿生合成的人源磁性铁蛋白用于高表达铁蛋白受体的疾病的诊断和治疗。在此基础上，完成了本发明。
疾病的诊断包括基于磁性纳米材料或其衍生物的活体成像诊断和体外组织、细胞诊断。疾病的治疗包括基于磁性纳米材料或其衍生物的被动靶向治疗和主动靶向治疗。
如本文所用，“内核成分”是指“强磁性的纳米颗粒”或“磁性纳米材料”。
如本文所用，“磁性纳米材料”是通过中国发明专利申请200910244505.1提供的制备方法以及本发明制备得到的具有蛋白壳包裹的磁性纳米材料，该磁性纳米材料具有细胞靶向性；所述细胞靶向性是固有的细胞靶向性，不需要经过表面包被、化学修饰或基因工程修饰连接上靶向配体（如抗体、多肽、靶向小分子等），材料直接就可以与高表达铁蛋白受体的细胞特异性结合。
铁蛋白和融合铁蛋白外壳为材料提供了天然的靶向配体。所述铁蛋白，包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（L）链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白的铁蛋白本身和其他铁蛋白仿生合成磁性材料或非磁性材料的细胞靶向性。
所述细胞靶向性具有体内外细胞靶向性，能特异性地结合高表达铁蛋白受体的细胞并内吞进入肿瘤细胞内部；本发明的磁性纳米材料通过结合细胞表面高表达的铁蛋白受体而实现体内外细胞靶向性。
本发明提供的磁性纳米材料或其衍生物具有完整的人H亚基铁蛋白壳和磁铁矿和/或磁赤铁矿、锰铁氧化物、钆-铁复合物、Gd-DTPA内核。其蛋白壳外直径为12-15nm，尺寸高度均一，呈球形。其核的粒径可随着控制每个蛋白分子加入的铁原子数能够合成不同粒径的磁性铁蛋白，其平均粒径分布范围窄，2-8nm，形状近似球形，呈现良好的单分散性，水溶性。该材料的横向弛豫效能（r2）可随着合成不同粒度的磁性铁蛋白而改变，r2可控制在约20-350mM-1·s-1范围内。
本发明进一步通过对内核的改造，合成铁蛋白壳包裹的锰铁氧化物磁性纳米材料，该材料与原来具有磁铁矿内核的磁性铁蛋白具有相似的粒径（4.7±0.8nm），但是饱和磁化强度得到了提高，矫顽力降低。
本发明进一步通过对内核的改造，合成铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂磁性纳米材料，既具有T1磁共振造影剂的功能，可用于磁共振T1加权成像，使得靶向部位变亮；又具有T2磁共振造影剂的功能，可用于磁共振T2加权成像，使得靶向部位变暗。
本发明进一步利用铁蛋白壳的自组装功能，将Gd-DTPA包裹在铁蛋白空腔中，形成铁蛋白包被的Gd-DTPA复合物，作为T1磁共振造影剂。
本发明利用具有矿化功能的趋磁细菌的膜蛋白Mms6蛋白进行原核表达和纯化，利用纯化的Mms6蛋白仿生合成形状近似球形、粒径大约为20nm的磁铁矿材料。
本发明用流式细胞技术验证了高表达铁蛋白受体的乳腺癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌细胞能结合大量人H亚基磁性铁蛋白，表明了该材料可以广谱地靶向结合高表达铁蛋白受体的细胞。
通过细胞与材料的特异性结合和竞争性抑制实验证明材料与细胞的结合是特异性的结合，通过抗人转铁蛋白受体1（TfR1）抗体的竞争性抑制实验表明，人H亚基磁性铁蛋白特异性靶向结合的铁蛋白受体是肿瘤细胞表面高表达的TfR1。通过细胞磁共振成像实验表明，人H亚基磁性铁蛋白作为造影剂能够明显地检测出106细胞/mL浓度的TfR1阳性高表达的MDA-MB-231细胞。
利用裸鼠肿瘤移植模型、磁共振成像（MRI）技术和荧光示踪技术，从体内验证了人H亚基磁性铁蛋白可以大量地富集在肿瘤组织，应用荧光共定位证明了这种体内肿瘤组织的富集的机理是特异性地靶向肿瘤细胞表面高表达的TfR1。人H亚基磁性铁蛋白富集在肿瘤后，可引起肿瘤部位的MRI图像信号强度的明显改变。
本发明将人H亚基磁性铁蛋白作为肿瘤靶向性磁共振造影剂，在裸鼠人乳腺癌、肝癌和肺癌模型上，实现约1mm大小的肿瘤的早期诊断。
本发明将人H亚基磁性铁蛋白、铁蛋白-钆-铁复合物和铁蛋白包被的Gd-DTPA复合物作为肿瘤靶向性磁共振造影剂，在裸鼠原位人肝癌、原位人神经胶质瘤和原位人胰腺癌异体移植模型上实现肝癌、神经胶质瘤和胰腺癌的早期诊断，神经胶质瘤和胰腺癌在1mm大小能够清晰成像，与周围正常组织具有强的组织对比度。
本发明将人H亚基磁性铁蛋白连接上荧光分子，作为荧光分子探针用于近红外荧光成像，可在裸鼠模型上明显检测出约3mm大小的人乳腺癌。
本发明将人H亚基铁蛋白连接上荧光分子，作为荧光分子探针用于近红外荧光成像，可在裸鼠模型上明显检测出约1mm大小的人乳腺癌。
利用透射电子显微镜超薄切片直接观察，静脉注射的人H亚基磁性铁蛋白可以进入到高表达TfR1的肿瘤细胞内，是一种肿瘤细胞内化型磁性纳米材料。
本发明将人H亚基磁性铁蛋白连接上化疗药物盐酸阿霉素，细胞毒性MTT实验表明连阿霉素的材料对肝癌细胞、白血癌细胞、神经胶质瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞等肿瘤细胞具有广谱的抑制作用。
本发明将连接化疗药物的材料进行肺癌裸鼠移植模型的体内治疗，静脉注射后，可以显著地抑制肿瘤的生长。
具体地，本发明涉及一种肿瘤靶向性磁性纳米材料及生物医学应用，其特征是以具有蛋白壳包裹磁性纳米内核的一种新型仿生合成材料，这种新型仿生材料具有固有的肿瘤靶向性，可将其作为肿瘤靶向性磁共振造影剂、分子探针和药物载体应用于肿瘤的早期诊断和治疗。
其中所述蛋白壳包裹磁性纳米颗粒优选通过特定的方法制备得到，所述特定方法在中国专利申请200910244505.1中公开，将该公开的专利申请中的相关内容并入本申请中。
其中所述蛋白壳可选自铁蛋白（ferritin）、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白和具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳。
其中所述铁蛋白壳包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（H）链亚基铁蛋白、重组人铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。优选地，其中所述铁蛋白壳为基因工程重组的人全重链亚基铁蛋白。
其中所述的人H亚基铁蛋白的氨基酸序列为MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES包含的氨基酸序列。
其中所述的铁蛋白的特征由12个或是24个重链亚基和轻链亚基任意比例自组装形成笼形结构。
其中所述的磁性纳米内核的成分包括但不限于：含有钆、锰、铁、钴和/或镍类元素的磁性纳米材料。优选地，磁性纳米内核的成分为磁铁矿和/或磁赤铁矿、锰铁氧化物、钆-铁复合物、Gd-DTPA。
其中细胞靶向性是指不需要经过表面包被、化学修饰或基因工程修饰连接上靶向配体（如抗体、多肽、靶向小分子等），直接能够靶向细胞的固有靶向性。
其中固有细胞靶向性包括铁蛋白壳具有的固有细胞靶向性，也包括基于铁蛋白壳合成的所有磁性材料和非磁性材料的固有细胞靶向性。
其中固有细胞靶向性是指铁蛋白壳能够特异性地靶向结合高表达铁蛋白受体的细胞。
其中铁蛋白受体包括TfR1、H亚基铁蛋白受体、L亚基铁蛋白受体及其乳铁蛋白受体。
其中固有的细胞靶向性能特异性地结合高表达铁蛋白受体的细胞并内吞进入细胞内部。
其中生物医学应用，包括所有基于铁蛋白壳和铁蛋白壳合成材料的固有肿瘤靶向性而开发的肿瘤诊断和治疗试剂。
其中肿瘤诊断试剂，包括体外和体内肿瘤诊断试剂。
其中体外肿瘤诊断试剂包括应用于组织、细胞、血液、尿液、粪便以及其它一些分泌物的肿瘤诊断试剂。
其中体内肿瘤诊断试剂涉及到应用于靶向铁蛋白受体的人体肿瘤的成像定位诊断，包括所有基于铁蛋白壳合成的MRI造影剂、荧光探针、同位素探针等。
其中肿瘤治疗试剂，还涉及到用蛋白壳包裹的磁性纳米材料连接的药用载体，还涉及到基于铁蛋白壳包裹的化疗药物、放射性同位素、细胞因子、核酸、抗癌、或抗炎症药物。
用于本文时，药用载体包括生理适合的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于静脉内的、肌肉的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的使用。
本发明的创新点在于：（1）利用人H亚基铁蛋白仿生合成了具有原始蛋白构象的磁性铁蛋白，材料合成没有破坏蛋白的结构和功能。（2）利用重组趋磁细菌膜蛋白Mms6蛋白，改进合成工艺使得在常温常压条件下就能合成晶型类似于趋磁细菌磁小体的立方八面体晶型、粒径均一的磁铁矿；（3）揭示了本发明合成的磁性铁蛋白与原来合成的磁性铁蛋白最大的区别在于，①保证了矿物相的纯度，使得蛋白壳内部形成的均为亚铁磁性的磁铁矿，磁化率高，磁滞回线在很低的磁场条件下就能达到饱和；②首次发现和证明了本发明合成的磁性铁蛋白在不需要任何修饰的条件下就具备了体内外的固有细胞靶向性，并且证明材料的细胞靶向性是由于其蛋白壳能够特异性地结合细胞表面高表达的铁蛋白受体TfR1；（4）与传统化学合成后修饰靶向配体的磁性纳米材料相比，这种材料固有的细胞靶向性不需要复杂的表面包被、靶向分子化学修饰、靶向肽段基因工程修饰；（5）以蛋白壳包裹的磁性纳米材料作为细胞靶向性磁共振造影剂，在裸鼠模型上实现了约1mm大小肿瘤的磁共振成像诊断，这是目前国际上报道的最好肿瘤早期诊断结果；（6）证实了材料可以进入肿瘤细胞内，为肿瘤细胞内治疗奠定了基础；并且将其修饰上肿瘤化疗药物，在体外细胞模型上发现其对肿瘤细胞具有广谱的抑制和细胞毒性，对体内的肺癌具有明显的治疗作用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、这类材料是基于蛋白生物矿化仿生合成的磁性纳米材料，具有粒径和形状均一、完整的蛋白外壳、单分散性、水溶性、高生物相容性等独特材料学优势；
2、这类材料与原来仿生合成材料以及化学合成材料的最大区别在于，不需要像普通磁性纳米材料需要复杂的表面包被和靶向分子化学修饰或者基因工程修饰就已经具备细胞主动靶向性，因此这种主动靶向性是材料天然固有的靶向性；
3、这类材料能够体内外特异性地靶向细胞表面高表达的铁蛋白受体，这是一类在各种高度增殖的细胞（如肿瘤细胞）都高表达的肿瘤标志物，因而这种细胞靶向性具有广谱性，能够应用于多种肿瘤的靶向早期诊断和治疗；
4、这类材料不仅可以结合高表达铁蛋白受体的细胞，而且可以通过细胞内吞作用进入到细胞内部，是一种细胞内化型磁性纳米材料；
5、这类材料可作为细胞靶向性磁共振成像造影剂、荧光分子探针、同位素标记物应用于肿瘤的活体显影早期诊断，将其作为磁共振成像造影剂，本发明在动物模型上实现了约1mm大小的肿瘤的早期诊断。
6.这类材料可作为药物载体用于肿瘤的靶向治疗，实现细胞内的药物输送，在体外能够广谱地杀死肿瘤细胞，在体内具有明显的肿瘤抑制效果。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
具有完整蛋白壳构象的人H亚基磁性铁蛋白的仿生合成
以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基的全长cDNA分别克隆和构建到pET11b质粒（购自于Novagen公司）上；将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细菌BL21(DE3)pLysS（购自于Novagen公司），加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活T7启动子，诱导表达；表达结束后进行超声破碎释放蛋白；对蛋白进行分离和纯化；利用纯化的人H亚基铁蛋白为模板，将亚铁盐和氧化剂H2O2加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为8.5，控制温度为65℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；亚铁盐的浓度为每次加入的亚铁原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，最终每个蛋白分子加入的铁原子数为5000；反应完毕后，进行排阻层析分离，离心和分子筛纯化后得到蛋白结构完整的单分散人H亚基磁性铁蛋白颗粒。图1a为所得的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）的负染照片，每个磁性纳米内核都由完整的重组人H亚基铁蛋白包裹。图1b是所得磁性人铁蛋白核的透射电镜照片，粒径均匀、形状相似、呈现单分散性。图1c是磁性人铁蛋白的粒径分布柱状图，可知磁性纳米内核粒径分布窄，平均粒径为4.6±0.9nm。图1d是人H亚基磁性铁蛋白的选区电子衍射图，可知其矿物相成分为磁铁矿。图1e是材料的圆二色（CD）光谱，可知材料仿生合成后没有破坏铁蛋白壳的原始构象。
材料所具有的人H亚基铁蛋白壳氨基酸序列如下：
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESG LAEYLFDKHTLGDSDNES
实施例2
合成铁蛋白壳包裹的锰铁氧化物核的磁性纳米材料
利用纯化的人H亚基铁蛋白为模板，将亚铁盐、锰盐（铁与锰的比例为11.5，相当于掺入8%的锰）和氧化剂H2O2加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为8.5，控制温度为65℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；最终每个蛋白分子加入的铁原子数为4600，锰原子数为400；反应完毕后，进行排阻层析分离，离心和分子筛纯化后得到蛋白结构完整的磁性颗粒。图2a是锰铁氧化物核的电镜照片，可见形成的核是近似球形，呈现良好的单分散性；图2b是核的粒度分布图，其平均粒径为4.7±0.8nm；图2c是锰铁氧化物在2K测量的磁滞回线，与单纯含有磁铁矿（Fe3O4）内核的人H亚基磁性铁蛋白相比较，其饱和磁化强度为23emu/g大于原来的人H亚基磁性铁蛋白（20emu/g）,其矫顽力为20mT，而原来的人H亚基磁性铁蛋白在2K条件下矫顽力为37mT；图2是铁蛋白壳包裹的锰铁氧化物核的能谱元素分析图，由图可知内核含有锰、铁和氧元素，说明锰已经掺入到核中，形成锰铁氧化物类磁性纳米材料（Mn0.24Fe2.76O4）。
实施例3
利用原核表达的趋磁细菌膜蛋白Mms6仿生合成纳米磁性材料
提取趋磁细菌AMB-1的全基因组，用PCR扩增出mms6基因，克隆到pET15b质粒上（购自于Novagen公司）选用EcoR I,BamH I酶切位点，转化细菌BL21(DE3)pLysS（购自于Novagen公司）进行原核表达。通过镍柱亲和层析的方法纯化出带有His标签的Mms6蛋白。将His-Mms6蛋白与铁盐溶液进行混合，用NaOH调节pH至7-9，在常温下反应24小时，生成水合氧化铁化合物（ferrihydrite），然后加入亚铁盐溶液（使得亚铁离子与铁离子的比例为1:2），继续反应24小时，直至溶液颜色完全变黑。将得到的磁性颗粒用磁铁进行收集，除氧水洗涤三次，冷冻干燥进行电镜观测和磁学测量。图3a是带His标签的Mms6蛋白的原核表达和纯化图，由泳道2可知，加入IPTG后，大肠杆菌能够表达His-Mms6蛋白，其分子量大约为10kD，通过镍柱亲和层析后可获得电泳纯的His-Mms6蛋白（泳道3）；图3b是利用His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的电镜照片，合成的磁性纳米颗粒粒径均一，形状相似，近似球形；图3c是His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的高分辨电镜照片（晶格条纹），表明即使在常温常压条件下，通过His-Mms6仿生合成的磁性纳米颗粒仍然具有优良的晶型，没有晶格缺陷，其晶型类似于趋磁细菌磁小体的立方八面体晶型；图3d是His-Mms6仿生合成磁性纳米颗粒的X射线电子衍射（XRD）图，与标准磁铁矿的XRD峰图进行对比，表明合成的磁性纳米颗粒的成分为磁铁矿。
材料所具有的Mms6蛋白壳氨基酸序列如下：
MGEMEREGAAAKAGAAKTGAAKTGTVAKTGIAAKTGVATAVAAPAAPANVAAAQGAGTKVALGAGKAAAGAKVVGGTIWTGKGLGLGLGLGLGAWGPIILGVVGAGAVYAYMKSRDIESAQSDEEVELRDALA
实施例4
人H亚基磁性铁蛋白对多种表达铁蛋白受体的细胞靶向性
首先用荧光染料Cy5.5对人H亚基磁性铁蛋白进行荧光标记（即通过共价键将Cy5.5连接在人H亚基磁性铁蛋白上），通过脱盐柱除去未结合蛋白的荧光分子。待细胞在培养瓶中处于对数生长期时（约铺满60%的细胞培养瓶），用含EDTA的0.25%的胰酶进行消化。消化后的细胞用磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7.4）洗三次，然后再加入适量的PBS进行悬浮（细胞浓度约为约1×106cell/ml）。取100μL PBS悬浮的细胞放入1.5ml离心管内，用2μL Cy5.5新标记好的人H亚基磁性铁蛋白（1mg/mL）与细胞在冰浴中避光孵育40min，每个细胞的对照加入同样体积的PBS，孵育完后用PBS洗三次洗去未结合细胞的材料，最后用500μL PBS悬浮细胞，用流式细胞仪BD FACS CantoTM FlowCytometer来进行细胞的荧光定量分析。图4是各种表达铁蛋白受体的细胞的流式分析图，结果表明，11株细胞有10株能够与人H亚基磁性铁蛋白特异性结合，分别属于乳腺癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌，表明该材料能够广谱地结合各种肿瘤细胞（细胞购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）。
实施例5
人H亚基磁性铁蛋白与体外表达铁蛋白受体的细胞的靶向性机理
为了研究材料与细胞的作用机理，选用材料高结合的MDA-MB-231细胞和材料进行特异性结合和竞争性抑制实验。在加入Cy5.5新标记好的人H亚基磁性铁蛋白之前用100倍量的铁蛋白壳提前孵育30min，然后观察结合材料的情况。用500μg/mL鼠抗人TfR1单克隆抗体提前孵育30min，然后观察结合材料的情况，用流式细胞仪BD FACS CantoTMFlow Cytometer来进行细胞的荧光定量分析。图5是流式分析结果，结果表明，材料与MDA-MB-231的结合50%以上能够被100倍量的铁蛋白壳进行抑制，说明材料与细胞的结合是依赖于其蛋白壳的。另外结合50%以上也能被抗TfR1的抗体进行抑制，说明这种结合是受TfR1介导，另外与材料结合极低的MX-1细胞，TfR1表达呈阴性，进一步证明人H亚基磁性铁蛋白与表达铁蛋白受体的细胞的特异性、靶向性相互作用。
实施例6
人H亚基磁性铁蛋白的横向弛豫率（r2）的测定
首先用融化的1%的低熔点琼脂糖凝胶（上海生工）将材料稀释至铁终浓度为0-0.4mM，然后迅速放入-20℃冰箱中冷却凝固后放入MRI系统（Bruker,Biospin MRI PharmaScan 7.0T,300MHz,1H model）中进行测定。材料R2值的测定使用multi-slice multi-echo(MSME)序列进行T2加权成像，具体参数为：field of view:3.5cm,matrix:256×256,repetition time:5000ms,1echoes,TE:11ms,1 slice,slice thickness:1mm。R2=1/T2值的计算用机器自带的BrukerParavision 5.0软件进行计算，然后将不同铁浓度的R2值线性拟合即可求出样品的横向弛豫率r2值。图6是不同铁浓度的人H亚基磁性铁蛋白的横向弛豫（R2）的测定值及其拟合曲线，通过拟合可得到该材料在1%的低熔点琼脂糖凝胶中，7T MRI条件下测得的横向弛豫率r2值为54mM-1S-1。
实施例7
体外表达铁蛋白受体的细胞靶向性磁共振成像
首先取约106铁蛋白受体高表达的MDA-MB-231细胞、低表达的MX-1细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）放入6孔板中的血清培养基培养24h，待细胞几乎完全贴壁后，吸去旧培养基，用新鲜的血清培养基1.5ml加入人H亚基磁性铁蛋白至铁终浓度为165μg/mL，培养5.5h后，PBS洗三次，然后用含EDTA的0.25%的胰酶进行消化后再次用PBS洗三次。将各个细胞在96孔板中用PBS稀释至终浓度为1×106cell/ml至PBS终体积为100μL，然后再加入100μL 1%的低熔点琼脂糖凝胶（上海生工），迅速放入-20℃冰箱中冷却凝固。将细胞放入小动物专用的7T MRI系统（Bruker,Biospin MRI PharmaScan 7.0T,300MHz,1H model）中使用大鼠体线圈进行细胞磁共振成像。图7是体外细胞磁共振成象，可见与材料孵育后，TfR1表达阳性的MDA-MB-231细胞MRI图像信号强度发生了明显降低，而TfR1表达阴性的MX-1细胞MRI图像信号强度没有明显改变，结果表明这种成像是一种分子靶向性磁共振成像。
实施例8
体内实验中，人H亚基磁性铁蛋白对表达铁蛋白受体组织靶向性的证明
体内存在许多的屏障系统，所以体内的情况比体外远远要复杂，为了验证人H亚基磁性铁蛋白能否体内靶向肿瘤，选用人Ｈ亚基磁性铁蛋白高结合和TfR1表达阳性的MDA-MB-231乳腺癌细胞，以及磁性铁蛋白低结合和TfR1表达阴性的MX-1乳腺癌细胞建立裸鼠移植模型。待肿瘤长到2-3mm时，尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：10mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（Pre），注射后1.5h，3.5h，5.5h四个时间点，T2-加权成像用多层多自旋回波序列（multi-slice multi-echo(MSME)sequence）。使用的参数如下：field of view(FOV)=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,repetition time(TR)=3,000ms,6echoes with echo time(TE)=15,30,45,60,75,90ms,20层，层厚为0.80mm。T2 *加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence）。使用的参数如下：FOV=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,TR=900ms,6 echoes with TE=4,10,16,22,28,34ms,20层，层厚为0.80mm。MRI的图像处理用机器附带的Bruker Paravision5.0软件来进行。组织部位的信号强度用信噪比（signalt-to-noise ratio,SNR）来定量。信噪比的公式是SNR=SI肿瘤/SD肌肉，SI肿瘤是癌灶部位的平均信号强度，SD肌肉是癌灶附近肌肉部位平均信号强度的标准差。注射人H亚基磁性铁蛋白之后的某个时间t的组织相对对比度增强（CE）用下面公式计算：CE(%)=(SNRpre–SNRt)/SNRpre[Buerke et al.,2008;Tsurusaki et al.,2008]。图8a-c是MDA-MB-231荷瘤小鼠、铁蛋白壳竞争性抑制MDA-MB-231荷瘤小鼠、MX-1荷瘤小鼠的T2 *MRI图像，结果表明，TfR1高表达的MDA-MB-231肿瘤（n=5）注射人H亚基磁性铁蛋白之后信号强度发生明显改变，而用铁蛋白壳进行受体饱和后的MDA-MB-231肿瘤（n=4）信号强度只有少量变化，TfR低表达的MX-1肿瘤信号强度也只有少量变化（n=5）。从而表明人H亚基磁性铁蛋白这种体内的组织靶向性是一种特异的、是依赖于TfR1表达的组织主动靶向性MRI造影剂。图8d是对T2 *加权图像进行定量分析，MDA-MB-231癌灶在注射前（Pre）、1.5h、3.5h、5.5h的相对对比度改变值分别为41.4±11.8%（平均值±标准差）,59.0±5.5%,56.6±5.5%。图8e是将MRI扫描后的荷癌裸鼠处死后，其肿瘤石蜡切片组织学结果表明，经过DAB增强的普鲁士蓝染色，MDA-MB-231癌灶组织呈现出明显的染色阳性（棕色颗粒），表明有大量的铁颗粒富集在MDA-MB-231癌灶内。而人H亚基铁蛋白竞争性抑制的MDA-MB-231癌灶和MX-1癌灶组织没有特异性的阳性染色，表明其可能没有富集或者富集较少的材料。组织学上的铁染色结果与MRI结果高度一致。
表1在静脉注射人Ｈ亚基磁性铁蛋白之前和之后的TfR1表达阳性的MDA-MB-231乳腺癌细胞(n=5)，人铁蛋白壳抑制MDA-MB-231肿瘤(n=4)和MX-1乳腺癌细胞(n=5)的
T2和T2 *MRI图像的信噪比
注：信噪比取自平均数±s.d.，使用Wilcoxon试验检验信噪比的差异的显著性。P<0.05表示有显著差异。
实施例9
人H亚基磁性铁蛋白体内肿瘤靶向性分子机理
为了研究人H亚基磁性铁蛋白对组织的特异性、靶向性机理，我们进行了体内荧光示踪实验和体外免疫荧光实验。首先用荧光染料罗丹明B将人H亚基磁性铁蛋白进行荧光标记（即通过共价键将罗丹明连接在人H亚基磁性铁蛋白上），然后将罗丹明B标记的材料分别尾静脉注射入荷MDA-MB-231肿瘤裸鼠（n=3），荷MX-1肿瘤裸鼠（n=3）体内，在避光的暗室条件下培养3h后用PBS进行心脏灌注，然后迅速取出癌灶组织，用锡箔纸包好，避光液氮保存过夜。组织切片用OCT（optimum cutting temperature compound，Sakura）包埋，在Leica冰冻切片机上避光进行切片（厚度5μm）。切片干燥至OCT消除后，避光放入丙酮中固定15min，待切片干燥后放入-80°C冰箱中进行储存。为了进行荧光观察，将切片用PBS洗三次，加入10%的牛血清白蛋白（BSA）37°C孵育30min防止荧光非特异性吸附，再用FITC标记的抗转铁蛋白受体1的抗体（anti-TfR1）进行染色（37°C,1.5h），用PBS洗去非特异性吸附的anti-TfR1，用抗淬灭的封片剂进行封片。图9是体内荧光示踪实验和体外免疫荧光的染色结果。结果表明，人H亚基磁性铁蛋白的红色荧光和TfR1抗体的绿色荧光很好地重叠在一起，表明人H亚基磁性铁蛋白体内组织特异性、靶向性分子机理是依靠其结合组织上表达的TfR1。
实施例10
人H亚基磁性铁蛋白用于微小乳腺癌的早期诊断
待MDA-MB-231肿瘤在裸鼠上长到约1mm时，尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：10mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（Pre），注射后5.5h，T2-加权成像用多层多自旋回波序列（multi-slice multi-echo(MSME)sequence）。使用的参数如下：field of view(FOV)=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,repetition time(TR)=3,000ms,6echoes with echo time(TE)=15,30,45,60,75,90ms,20层，层厚为0.80mm。T2 *加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence）。使用的参数如下：FOV=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,TR=900ms,6echoes with TE=4,10,16,22,28,34ms,20层，层厚为0.80mm。MRI的图像处理用机器附带的Bruker Paravision 5.0软件来进行。
图10a，b是荷MDA-MB-231微小癌灶裸鼠的T2 *加权磁共振图像，图中可以明显地看出在注射人H亚基磁性铁蛋白前后，癌灶部位的信号强度具有明显的变化，注射后要比注射前的信号强度低得多，在图像上亮度变暗。经过对T2 *加权图像的定量分析以及统计分析，注射人H亚基磁性铁蛋白前后的信噪比值具有显著性的差异（图10c）。在T2加权磁共振图像上，信号强度变化不是很明显，但是对其信噪比进行进行定量分析可看出注射材料前后的明显差异（图10d-f）。癌灶的石蜡组织切片经过DAB增强的普鲁士蓝铁染色后具有明显的棕色颗粒阳性结果，表明人H亚基磁性铁蛋白已经富集于微小癌灶内(图10g)。图10h是MDA-MB-231微小癌灶部位的解剖出来后的照片，可以看出所检测的癌灶直径大约为1mm，对其进行天平称量，重量大约为2mg。
实施例11
人H亚基磁性铁蛋白作为荧光分子探针用于肿瘤的早期诊断
将人H亚基磁性铁蛋白利用近红外荧光染料Cy5.5标记（即通过共价键将Cy5.5连接在人H亚基磁性铁蛋白上）后，就成为了一种肿瘤靶向性的荧光分子探针。待MDA-MB-231肿瘤长到约3mm大小，尾静脉注射100μg Cy5.5标记的人H亚基磁性铁蛋白，用活体荧光成像系统CRI MetroTM进行扫描观察在生物体内的相对分布。图11是注射人H亚基磁性铁蛋白3h后的活体荧光成像图片，除了在肝脏膀胱外有很强的荧光强度分布，在肿瘤部位有明显的较强荧光强度分布。
实施例12
人H亚基磁性铁蛋白用于微小肝癌的早期诊断
将TfR1表达阳性的QGY7701肝癌细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）建立裸鼠人肝癌移植模型，待肿瘤长到约1mm大小时，尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：10mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（Pre），注射后5.5h两个时间点，T2-加权成像用多层多自旋回波序列（multi-slice multi-echo(MSME)sequence）。使用的参数如下：field of view(FOV)=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,repetition time(TR)=3,000ms,6echoes with echo time(TE)=15,30,45,60,75,90ms,20层，层厚为0.80mm。T2 *加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence）。使用的参数如下：FOV=3.5cm×3.5cm,matrix=256×256,TR=900ms,6echoes with TE=4,10,16,22,28,34ms,20层，层厚为0.80mm。MRI的图像处理用机器附带的Bruker Paravision 5.0软件来进行。癌灶部位的信号强度用信噪比（signalt-to-noise ratio,SNR）来定量。结果见图12。结果表明，在T2 *图像上，肿瘤部位（红色圆圈部分）的信号强度与注射前相比发生了明显的改变。
实施例13
人H亚基磁性铁蛋白用于微小肺癌的早期诊断
将TfR1表达阳性的NCI-H460人肺癌细胞（（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）建立裸鼠人肺癌移植模型，尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：10mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（Pre），注射后5.5h两个时间点。T2 *加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence）。使用的参数如下：FOV=3.50cm,matrix=256×256,TR=900ms,6 echoes with TE=4,10,16,22,28,34ms,20层，层厚为0.80mm。MRI的图像处理用机器附带的BrukerParavision 5.0软件来进行。癌灶部位的信号强度用信噪比（signalt-to-noise ratio,SNR）来定量。结果见图13。结果表明，在T2 *图像上，肿瘤部位（红色圆圈部分）的信号强度与注射前相比发生了明显的改变。
实施例14
人H亚基磁性铁蛋白在裸鼠体内的组织器官分布
将注射材料（10mg Fe/Kg）体重的荷MDA-MB-231（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）裸鼠在注射材料6h后进行处死，取出肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、大脑、腋下淋巴结、肿瘤进行石蜡切片，利用DAB增强的普鲁士蓝铁染色检测人H亚基磁性铁蛋白在体内组织器官内的分布。首先将石蜡切片在60°C烘箱中烘1h，并在37°C的二甲苯中浸泡2次（每次15min）进行脱蜡，然后分别放入100%酒精进行脱水两次（每次5min），在80%酒精、去离子水中进行复水（每次2min）。为了去除内在过氧化物酶，将切片复水后放入含3% H2O2的甲醇溶液中处理30min，用去离子水洗三次。铁染色的过程为：首先用普鲁士蓝染液（10%亚铁氰化钾和20%盐酸新鲜配制）染色20min，去离子水洗三次（每次5min），然后用含0.05% DAB的PBS溶液（pH7.4）染色10min，再用含0.033% H202和0.05% DAB的PBS溶液染色15min。最后用苏木素、伊红染液分别进行细胞核和细胞质的染色。图14是经注射人H亚基磁性铁蛋白之后的小鼠的肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织、腋下淋巴结和肿瘤组织的铁染色照片，从图中可以看出肿瘤具有明显的阳性染色，组织内染色后呈现大量的棕色颗粒，表明有大量的材料的铁颗粒分布。肝脏有一定的阳性染色，在枯否氏细胞内有铁颗粒的分布。淋巴结在皮质和髓质之间具有明显的铁颗粒的存在。而脾脏、心脏、肺脏、肾脏、脑和肌肉组织的铁染色结果为阴性，表明在这些组织中材料分布极少。
实施例15
材料在肿瘤组织和细胞内的生物分布
为了观察人H亚基磁性铁蛋白在癌组织和细胞内的分布，将荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠静脉注射人H亚基磁性铁蛋白，24h后将裸鼠进行处死，快速取出癌灶组织并将其切成1mm3大小，放入2.5%的戊二醛中4°C进行固定。透射电镜超薄切片的制作程序如下：取出戊二醛固定好的组织用PBS（0.01M,pH7.4）清洗三次（10min/次），再用1%锇酸固定25min（固定过程中在20min左右要看组织是否变黑），PBS清洗一次，重蒸水洗2次（10min/次），用1%的乙酸双氧铀染色1h，再用50%、70%、85%、95%乙醇脱水，每次12min，再用100%乙醇脱水三次，每次15min。用乙醇与环氧树脂包埋液（乙醇和包埋液的比例为1:1）进行浸透三次，每次2h，再用纯的环氧树脂包埋液浸透过夜，换一次新的纯包埋液2h后进行包埋（烘箱60°C，24h）。超薄切片的观察使用JEM-1400型透射电镜，加速电压是120kV。图15是注射材料后的肿瘤组织的透射电镜超薄切片图，可见癌细胞内出现大量的电子高密度铁颗粒，这表明癌细胞内已经进入大量的人H亚基磁性铁蛋白，而癌组织内的淋巴细胞和巨噬细胞未见有大量电子高密度物质的铁颗粒出现。材料在肿瘤细胞内的分布为肿瘤的治疗带来了契机。
实施例16
连阿霉素的人H亚基磁性铁蛋白对肿瘤细胞的细胞毒性实验
将盐酸阿霉素与人H亚基磁性铁蛋白利用戊二醛进行交联，利用G50脱盐柱除去没有连接到蛋白上面的盐酸阿霉素。然后用分光光度计分别测量人H亚基磁性铁蛋白的蛋白浓度（BCA法测定），和阿霉素的浓度（485nm），确定每个材料上连接的阿霉素量大约为48个分子。图16a是连接阿霉素后材料的颜色变化图，可见连接阿霉素后，材料由原来的棕黑色转变为黑红色。
待肿瘤细胞长到对数生长期后，加入100μL到96孔板中，浓度为5000细胞每孔，边缘孔用无菌PBS填充。将连接阿霉素的材料按照不同阿霉素的浓度（1-20000nM,十一个梯度）与细胞在37℃,5% CO2细胞培养箱中培养72小时。加入0.5% MTT 20μL，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。图16b是MTT测定连阿霉素的材料对肝癌细胞QGY7701，白血癌细胞K562，神经胶质瘤细胞U87MG，肺癌细胞NCI-H460，结肠癌细胞HT-29，乳腺癌细胞MDA-MB-231（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）的细胞毒性的实验结果，发现连阿霉素材料对这些细胞都具有明显的细胞毒性。
实施例17
连阿霉素的人H亚基磁性铁蛋白对体内肺癌的初步治疗实验
选用高表达铁蛋白受体的NCI-H460肺癌细胞，在裸鼠腋下进行皮下移植。待肿瘤长到长度约为1cm左右进行给药治疗，将裸鼠分为三组：PBS对照组、盐酸阿霉素治疗组、连阿霉素的材料治疗组，每组为3只荷瘤裸鼠。每三天进行一次尾静脉给药，给药阿霉素浓度为3mg/Kg体重，每次给药前用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，待给药15天后，将小鼠进行脱颈处死，解剖取出肿瘤，称取重量，记录照片。图17a是肿瘤体积随着给药天数的变化图，肿瘤在给药8天后，连阿霉素的材料治疗组与对照组具有明显的差异，能够显著抑制肿瘤的生长，而阿霉素治疗组与对照组只有少量的差异，抑制效果不明显。图17b是将肿瘤取出后的重量称量结果，连阿霉素的材料治疗组平均抑瘤率为39%，而单纯阿霉素的平均抑瘤率约为23%，从图17c的肿瘤实物照片，与PBS对照组相比，连阿霉素的材料具有明显的抑瘤效果。
实施例18
不同粒径和不同横向弛豫率（r2）磁性铁蛋白的仿生合成
利用纯化的人H亚基铁蛋白为模板（蛋白浓度0.5-1mg/ml），将亚铁盐和氧化剂H2O2加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为8-9，控制温度为60-80℃，精确控制亚铁离子和蛋白的配比关系，精确控制温度和pH值的恒定，最终每个蛋白分子加入的铁原子数分别为1000,3000，5000，7000，10000；反应完毕后，进行排阻层析分离，离心和分子筛纯化后得到蛋白结构完整的单分散磁性铁蛋白颗粒。弛豫时间的测定在4.7 T MRI系统（Bruker），PBS溶液，常温条件下测得，使用多层多自旋回波序列(multi-slice multi-echo(MSME)sequence)，使用的参数如下：field of view(FOV)=5cm×5cm,matrix=196×196,repetition time(TR)=3000ms,10 echoes with echo time(TE)=8.5,17,25.5,34,42.5,51,59.5,68,76.5,85ms.
图18a,18b,18c，18d为反应过程中平均每个蛋白分子加入1000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线，由图可知其平均粒径为2.7±0.6nm，其r2值为23mM-1.s-1。图18e,18f，18g，18h为反应过程中平均每个蛋白分子加入3000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图和低温（5K）磁滞回线，由图可知其平均粒径为3.3±0.8nm，其r2值为63mM-1.s-1。图18i,18j,18k,18l为反应过程中平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图低温（5K）磁滞回线，由图可知其平均粒径为5.2±1.0nm，其r2值为224mM-1.s-1。图18m,18n,18o，18p为反应过程中平均每个蛋白分子加入7000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图、横向弛豫率（r2）的测定图低温（5K）磁滞回线，由图可知其平均粒径为5.4±1.1nm，其r2值为321mM-1.s-1。图18q,18r,18s为反应过程中平均每个蛋白分子加入10000个铁原子所合成的磁性铁蛋白的透射电镜（TEM）照片、粒径分布柱状图低温（5K）磁滞回线，由图可知其平均粒径为7.1±1.4nm。从18d，18h，18l，18p，18s所测得的不同粒度磁性铁蛋白的低温（5K）的磁滞回线结果可以看出，随着核粒径的增加，其饱和磁化强度Ms明显地得到了提高，分别为5.9Am2/Kg总质量（1000），15.2Am2/Kg（3000），28.6Am2/Kg（5000），37.1Am2/Kg（7000），51.8Am2/Kg(10000),所有核粒径的磁滞回线都在<1T就能达到饱和，表明其为软磁性的亚铁磁性矿物，这种性质与原来所报道的磁性铁蛋白（Uchida et al.,2006，Figure 7）在8T（80000 Oe）条件下都不能饱和（表明其核含有反铁磁性的矿物）是完全不同的性质。在同等核粒径条件下，其饱和磁化强度是原来报道的磁性颗粒的饱和磁化强度的4倍，其横向弛豫率r2是原来报道磁性颗粒的弛豫率3倍多（Uchida et al.,2006;2008）。图18t用平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白（平均粒径5.2nm）所做的电子能量损失谱（EELS），其L2峰位于708ev,L3峰位于722ev，与磁铁矿的标准谱相对比，是标准化学计量的磁铁矿颗粒。而是先前报道的铁蛋白合成磁性纳米粒子的电子能量损失谱（EELS）其L2峰位于704ev，L3峰位于715ev（Uchida et al.,2006）。因此，综合横向弛豫率测量、低温磁滞回线以及电子能量损失谱等材料学鉴定的结果，表明本发明合成的磁性铁蛋白与原先报道的磁性铁蛋白纳米粒子具有不同的矿物相，其磁学性质和磁共振弛豫效能具有典型的区别。
实施例19
高弛豫率（r2）磁性铁蛋白在乳腺癌分子影像中的应用
利用反应过程中平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白（平均粒径为5.2±1.0nm，r2值为224mM-1.s-1）作为造影剂，选用TfR1表达阳性的MDA-MB-231乳腺癌细胞（荷瘤于后背部的右侧）和TfR1表达阴性的MX-1乳腺癌细胞（荷瘤于后背部的左侧）建立裸鼠移植模型。待肿瘤长到2-3mm时，将裸鼠进行呼吸麻醉，尾静脉进行静脉针滞留，放入4.7 T MRI系统中以保证在磁共振扫描过程中，裸鼠始终处于静止状态，保证磁共振扫描图片的匹配。尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：20mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（0h），注射后连续扫描6个小时，T2-加权成像用多层多自旋回波序列(multi-slice multi-echo(MSME)sequence,26min)，使用的参数如下：FOV=4cm×4cm,matrix=256×256,TR=3,000ms,TE=16,32,48,64,80,96ms,20层，层厚为0.80mm.T2 *-加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence）。使用的参数如下：FOV=4cm×4cm,matrix=256×256,TR=950ms,6 echoes with TE=4.5,11.95,19.4,26.85,34.3,41.75ms,20层，层厚为0.80mm。MR图像处理用机器自带的Bruker Paravision 4.0进行处理.肿瘤的MR信号改变利用肿瘤与周围正常肌肉的信号强度比值（TNR）进行定量分析，TNR=SItumor/SImuscle,SItumor是肿瘤部位的平均信号强度,SImuscle是正常肌肉的平均信号强度.相对TNR的降低值用以下公式进行计算:TNR reduction(%)=(TNRpre–TNRt)/(TNRpre)。
图19a-d是肿瘤大小约3mm的裸鼠的T2加权MRI图像，图19e-h是肿瘤大小约3mm的裸鼠的T2 *加权MRI图像，结果表明，TfR1高表达的MDA-MB-231肿瘤注射人H亚基磁性铁蛋白之后信号强度发生明显改变，而TfR1表达阴性的MX-1肿瘤信号强度没有明显的改变，从而表明人H亚基磁性铁蛋白这种体内的组织靶向性是一种特异的、是依赖于TfR1表达的组织主动靶向性MRI造影剂。图19i和19j是肿瘤原位观察的体视显微镜照片，由图可知其肿瘤大小约为3mm。图19k和19l是对T2加权图像和T2 *加权图像进行定量分析（4只模型统计），MDA-MB-231肿瘤的TNR降低值与MX-1肿瘤的TNR降低值具有明显的差异（P=0.029）。图19m和19n是磁共振扫描后的肿瘤的免疫组化图，由图可知经过DAB增强的普鲁士蓝染色，MDA-MB-231肿瘤组织呈现出明显的染色阳性（棕色颗粒），表明有大量的铁颗粒富集在MDA-MB-231肿瘤内，铁富集的组织区域与TfR1高表达的肿瘤组织高度对应，表明磁性铁蛋白是一种特异性的分子靶向性磁共振造影剂。而MX-1肿瘤组织没有特异性的阳性染色，表明其可能没有富集或者富集较少的材料。组织学上的铁染色结果与MRI结果高度一致，表明磁性铁蛋白是一类具有靶向性的分子探针，可用于监测TfR1在体内表达情况的分子影像学。
实施例20
高横向弛豫率（r2）磁性铁蛋白应用于微小乳腺癌的早期MRI诊断
利用实施例18反应过程中平均每个蛋白分子加入5000个铁原子所合成的磁性铁蛋白作为造影剂，选用TfR1表达阳性的MDA-MB-231乳腺癌细胞建立裸鼠移植模型，当肿瘤长到大约1mm左右，将裸鼠进行呼吸麻醉，尾静脉进行静脉针滞留，放入4.7T MRI系统中以保证在磁共振扫描过程中，裸鼠始终处于静止状态，保证磁共振扫描图片的匹配。尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：20mg Fe/Kg小鼠体重）。扫描时间分别是注射人H亚基磁性铁蛋白之前（0h），注射后连续扫描6个小时，T2-加权成像用多层多自旋回波序列(multi-slice multi-echo(MSME)sequence,26min)，T2 *-加权成像用的是多梯度自旋回波序列（multi-gradient echo(MGE)sequence），序列参数与实施例19相同。MR图像处理用机器自带的Bruker Paravision 4.0进行处理.肿瘤的MR信号改变利用肿瘤与周围正常肌肉的信号强度比值（TNR）进行定量分析，TNR=SItumor/SImuscle,SItumor是肿瘤部位的平均信号强度,SImuscle是正常肌肉的平均信号强度.相对TNR的降低值用以下公式进行计算:TNR reduction(%)=(TNRpre–TNRt)/(TNR pre)。
图20a-20d是肿瘤大小约1mm的裸鼠的T2加权MRI图像，图20e-20h是肿瘤大小约1mm的裸鼠的T2 *加权MRI图像，结果表明，微小肿瘤在注射人H亚基磁性铁蛋白之后信号强度发生明显改变,尤其是T2 *加权像在肿瘤部位出现肉眼可分辨的特定黑色区域。图20i和20j是对T2加权MRI图像和T2 *加权像的定量结果，可见注射磁性铁蛋白后，微小肿瘤的TNR发生了明显的降低。图20k是皮下移植乳腺癌的原位体视显微镜照片，肿瘤的长度大约为0.6mm。图20l是磁共振扫描后的肿瘤的免疫组化图，由图可知，微小肿瘤在小于1mm没有明显的血管新生（CD31染色阴性），但是微小肿瘤能够富集大量的磁性铁蛋白颗粒（DAB增强的普鲁士蓝染色呈明显阳性），表明磁性铁蛋白颗粒可能具有穿越血管内皮细胞屏障的功能。
实施例21
铁蛋白作为荧光分子探针应用于微小乳腺癌的早期诊断
将纯化的人H亚基铁蛋白与NHs-Cy5.5荧光分子按照每个蛋白24个分子的比例进行孵育过夜，从而铁蛋白外壳连接上大约6-7个Cy5.5荧光分子（利用荧光分光光度计鉴定连接的荧光分子数），将其尾静脉注射进入肿瘤大小约1mm的裸鼠乳腺癌移植模型，裸鼠模型的左侧荷有TfR1表达阴性的MX-1肿瘤，而右侧荷有高表达TfR1的MDA-MB-231肿瘤。分别在注射前、注射后1.5h、3h和6h利用近红外荧光活体成像系统（CRI Maestro）进行成像，图像处理利用成像系统自身携带的软件进行处理，以注射Cy5.5-铁蛋白前的同一只裸鼠作为对照来处理图像。
图21a-21d是注射Cy5.5-铁蛋白注射前和注射后1.5h、3h和6h的荧光成像后的照片，图像结果明显地显示了注射Cy5.5-铁蛋白后，TfR1高表达的MDA-MB-231微小肿瘤区域（裸鼠的右侧）显示强的荧光，能够与皮肤以及肌肉背景明显地进行区分,而TfR1表达阴性的MX-1微小肿瘤的荧光成像不能与皮肤和肌肉背景进行区分。图21e是将MX-1肿瘤、MDA-MB-231肿瘤及其肿瘤周围的正常肌肉组织解剖出来后的白光照片，由比例尺可知，肿瘤大小约1mm。图21f是解剖出来组织的荧光照片，其荧光强度MDA-MB-231肿瘤明显大于MX-1肿瘤和正常的肌肉组织，表明在具有肌肉荧光背景的条件下，Cy5.5-铁蛋白荧光分子探针可应用于近红外诊断高表达TfR1的微小乳腺癌。
实施例22
铁蛋白作为荧光分子探针应用于胰腺癌的近红外荧光活体成像
将Cy5.5连接的人H亚基铁蛋白通过尾静脉注射进入肿瘤大小约3mm的裸鼠胰腺癌移植模型，所用肿瘤细胞为CFPAC-1人胰腺癌细胞系（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）。分别在注射前、注射后1.5h、6h、24h、72h、96h利用近红外荧光活体成像系统（CRI Maestro）进行成像。
图22是注射Cy5.5铁蛋白探针的近红外活体荧光成像图，以及96h后解剖出来的各个组织器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、骨头、肿瘤、肌肉）的荧光成像图，由图可知96h后人H亚基铁蛋白主要存在于肝脏和肿瘤，但是由于荧光强度受表面积大小的影响，肝脏表面积要远远大于肿瘤，其具体的分布量还需进一步测量单位重量的组织裂解液的荧光强度进行进一步证明。
实施例23
磁性铁蛋白应用于原位神经胶质瘤的早期MRI诊断
将约106个U87MG人神经胶质瘤细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）稍微偏离大脑正中线原位穿透颅骨及其鼓膜接种于裸鼠大脑的皮质，大约3-4天后开始进行磁共振成像，将裸鼠进行呼吸麻醉，尾静脉进行静脉针滞留，放入4.7 T MRI系统中以保证在磁共振扫描过程中，裸鼠始终处于静止状态。首先尾静脉注射商品化的Gd-DTPA造影剂（马根维显，拜耳公司生产）作为对照，注射剂量为0.1mmol/Kg，在磁共振腔内连续扫描2个小时，待Gd-DTPA完全代谢排出后，尾静脉注射人H亚基磁性铁蛋白（注射剂量：20mgFe/Kg小鼠体重），连续扫描3个小时，然后24小时再进行一次扫描以排除血液的干扰。注射Gd-DTPA采用MSME T1加权成像，其所用的参数如下：FOV=2cm×2cm,matrix=128×128,TR=3,000ms,TE=350ms,20层，层厚为0.80mm.注射磁性铁蛋白T2加权成像采用MSME序列，T2 *加权成像采用MGE序列，其序列参数与实施例19基本相似，matrix:128×128。
图23a-23c是注射Gd-DTPA前后的磁共振扫描图,可见注射商品化的Gd-DTPA之后神经胶质瘤区域的信号强度并没有发生明显的改变。图23d-f是注射磁性铁蛋白前后的T2加权磁共振成像(回波时间32ms)。图23g-23i是T2 *加权磁共振成像（回波时间4.5ms）。图23j-23l是第二个回波的T2 *加权磁共振成像（回波时间12ms）。无论是T2加权像还是T2 *加权像都清楚地显示了注射磁性铁蛋白之后，约1mm的神经胶质瘤区域发生了肉眼可见的明显变化。24h后，排除了血液中的干扰，肿瘤仍然能够清楚地显示低信号，与注射前相比，其信号强度明显降低，与周围正常组织拥有良好的组织对比度，能够明显地进行肿瘤组织区分。为了验证磁共振成像的检测结果，注射24h磁共振扫描后，对裸鼠进行心脏PBS和4%多聚甲醛灌注，完整地取出大脑组织，分别用10%、20%、30%的蔗糖进行脱水，用OCT进行包埋于冰冻组织切片机上进行横向切片（20μm层厚），分别进行H&E染色来病理识别肿瘤组织，DAB-增强的普鲁士蓝染色染铁颗粒，抗TfR1抗体染TfR1的表达。
实施例24
磁性铁蛋白应用于原位胰腺癌的早期MRI诊断
在裸鼠左侧胰腺部位剖开裸鼠腹腔，将约106个CFPAC-1人胰腺癌细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）原位接种于脾脏下面的裸鼠胰腺组织，大约3-4天后开始注射人H亚基磁性铁蛋白，进行T2加权和T2 *加权磁共振成像。图24a-24b和图24c-24d分别是原位胰腺癌裸鼠移植模型在注射磁性铁蛋白前后的T2加权和T2 *加权磁共振成像图，无论是T2加权像还是T2 *加权像都清楚地显示了注射磁性铁蛋白24h之后，约1mm的原位胰腺癌区域发生了肉眼可见的明显变化，能够明显地与周围正常组织区分。注射后24h和磁共振扫描后，立即脱颈处死小鼠，以俯卧位剖开小鼠腹腔，沿食管去除所有腹腔的组织器官，将脾脏和胰腺暴露，观察肿瘤在胰腺的生长部位（图24e）。为进一步验证肿瘤组织所在的部位，将脾脏和胰腺组织共同取出，4%多聚甲醛固定，分别用10%、20%、30%的蔗糖进行脱水，用OCT进行包埋于冰冻组织切片机上进行横向切片（20μm层厚），分别进行H&E染色来病理识别肿瘤组织，DAB-增强的普鲁士蓝染色染铁颗粒，抗TfR1抗体染TfR1的表达。
实施例25
仿生合成铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂复合物
临床应用的Gd类造影剂在T1加权磁共振成像过程中，能够使得病灶区域信号强度得到提高，显示出明亮区域。由于人的肉眼对亮物质更加敏感，因而这类造影剂更加符合人们肉眼观察的需要。但是临床应用的Gd类造影剂并不具有靶向性，而且其弛豫率低，无法满足疾病如肿瘤早期诊断的需要。本发明使用具有肿瘤靶向性的铁蛋白外壳，在其内腔中通过仿生矿化作用形成钆-铁氧化物纳米材料。利用纯化的人H亚基铁蛋白为模板，将亚铁盐、钆盐和氧化剂H2O2加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为8.5，控制温度为65℃，精确控制亚铁离子、钆粒子和蛋白的配比关系，精确控制温度和pH值的恒定，最终每个蛋白分子理论加入的铁原子数大约为4850个，加入钆原子数大约为150个，理论掺入钆的比例大约为3%。反应完毕后，进行排阻层析分离，离心和分子筛纯化后得到蛋白结构完整的单分散铁蛋白-钆铁氧化物纳米颗粒，，利用电感耦合等离子体质谱测定蛋白壳内的铁原子数与钆原子数，利用4.7T磁共振成像系统对材料的纵向弛豫率（r1）和横向弛豫率（r2）进行测定。
通过ICP-MS测定之后，平均每个蛋白壳内大约装入1140个铁原子和31个钆原子。
图25a是对不同钆浓度（0-1mM）的商品化Gd-DTPA(马根维显，拜耳公司生产)的T1加权磁共振成像图（回波时间为TE=8.5ms,反转时间TR=300ms）。图25b是对不同Gd浓度Gd-DTPA所测得的纵向弛豫时间的倒数（R1=1/T1）的线性关系图，由图可求得在4.7T场强下,PBS溶液中所求得的纵向弛豫率r1大约为5.9mM-1·S-1。图25c是对不同钆浓度（0-1mM）的铁蛋白-钆-铁复合物的T1加权成像图（TE=8.5ms;TR=300ms）,图25d是对不同Gd浓度的铁蛋白-钆-铁复合物所测得的纵向弛豫时间的倒数（R1=1/T1）的线性关系图，由图可求得其纵向弛豫率r1大约为4.1mM-1·S-1。图25e是不同铁浓度的T2加权成像图，由图可见铁蛋白-钆-铁复合物不仅具有钆类T1造影剂的功能，在T1加权成像中使得信号强度增强，图像显示明亮区域，而且具有铁氧化物的T2造影剂功能，使得信号强度减弱，出现黑暗区域。图25f是对不同铁浓度的铁蛋白-钆-铁复合物所测得的横向弛豫时间的倒数（R2=1/T2）的线性关系图，由图可求得其横向弛豫率r2大约为9.0mM-1·S-1。
实施例26
铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂复合物应用于特异性地早期诊断原位肝癌
沿腹中线剖开裸鼠腹腔，将约106个QGY7701人肝癌细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）原位接种于裸鼠的左侧肝脏组织包膜内，大约3-4天后开始进行T1加权、T2加权和T2 *加权磁共振成像。图26a-26b是位肝癌裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后的T1加权磁共振成像图，可见肿瘤区域表现出信号强度增高，显示出明亮区域。图26c-26d和图26e-26f分别是原位肝癌裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后的T2加权和T2 *加权磁共振成像图，无论是T2加权像还是T2 *加权像都清楚地显示了注射磁性铁蛋白96h之后，约5mm的原位肝癌区域发生了肉眼可见的明显变化，能够明显地与周围正常组织区分。
实施例27
铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂复合物应用于特异性地早期诊断原位神经胶质瘤
将约106个U87MG人神经胶质瘤细胞（购自于ATCC，培养在南京凯基生物科技发展有限公司）稍微偏离大脑正中线原位穿透颅骨及其鼓膜接种于裸鼠大脑的皮质，大约3-4天后开始进行磁共振成像，将裸鼠进行呼吸麻醉，尾静脉进行静脉针滞留，放入4.7T MRI系统中以保证在磁共振扫描过程中，裸鼠始终处于静止状态。分别进行T1加权和T2 *加权磁共振成像。图27a-27b是位肝癌裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后的T1加权磁共振成像图，肿瘤区域只有稍微的信号强度增高，显示出明亮区域。图27c-27d是原位神经胶质瘤裸鼠移植模型在注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂前后T2 *加权磁共振成像图，T2 *加权像清楚地显示了注射铁蛋白-钆-铁双模式磁共振造影剂24h之后，约2mm的原位神经胶质瘤区域发生了肉眼可见的明显变化，信号强度明显降低，能够明显地与周围正常组织区分。
实施例28
合成铁蛋白包裹Gd-DTPA的复合物及其在原位神经胶质瘤早期诊断中的应用
将纯化的人H亚基铁蛋白使用盐酸胍（1-7M）或者尿素（2-8M）等变性剂将铁蛋白进行部分变性或全部变性，使得其亚基进行部分解聚或完全解聚，每个蛋白分子大约加入商品化的Gd-DTPA约为2000个钆原子。然后进行透析除去变性剂，使其亚基重新聚合形成笼形结构，将Gd-DTPA包裹进入蛋白空腔中，利用离心、分子筛层析或阴离子交换的方法除去未复性的铁蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，利用ICP-MS测定每个蛋白分子所包裹的Gd原子数。通过ICP-MS测定后，每个蛋白分子大约包裹18个Gd-DTPA分子。利用U87MG人神经胶质瘤细胞原位接种于裸鼠大脑的皮质建立裸鼠神经胶质瘤原位模型，大约3-4天后开始进行磁共振成像，将裸鼠进行呼吸麻醉，尾静脉进行静脉针滞留，放入4.7T MRI系统中以保证在磁共振扫描过程中，裸鼠始终处于静止状态。尾静脉注射人H亚基铁蛋白包裹Gd-DTPA的复合物（注射剂量按照Gd量进行定量，即0.1mmol/Kg），连续扫描2个小时，然后24小时再进行一次扫描以排除血液的干扰。
图28a是利用人H亚基铁蛋白包裹Gd-DTPA的流程示意图。图28b-28d是注射铁蛋白包裹Gd-DTPA复合物前后的T1加权磁共振成像,图像清楚地显示了注射磁性铁蛋白24之后，约1mm大小的神经胶质瘤区域发生了肉眼可见的明显变化,显示出高信号区域（明亮区域），与周围正常组织进行明显区分。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (43)

1.一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备成像定位诊断试剂和治疗物质中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成像定位诊断试剂选自磁共振造影剂或分子探针。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的磁共振造影剂或分子探针含有所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或衍生物。
4.如权利要求1所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分为含有金属元素的化合物，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的蛋白壳可以特异性地与组织或细胞表面表达的受体结合。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蛋白壳选自铁蛋白（ferritin）、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白或具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述铁蛋白包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（L）链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物通过下述步骤制备得到：
(a)以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到pET11b质粒上；
(b)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细胞BL21(DE3)plysS，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷激活T7启动子，诱导表达；
(c)表达结束后进行超声破碎释放蛋白；
(d)对蛋白进行分离和纯化；
(e)将形成内核成分的金属盐类和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为7-11，控制温度为25-80℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；形成内核成分的盐类的浓度为每次加入的金属元素原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，使每个蛋白分子加入的金属元素原子数可在100-15000之间；氧化剂的浓度为每次加入氧化剂的分子数与加入金属元素离子的原子数之比为2∶1或3∶1；蛋白浓度>0.25mg/ml；
(f)排阻或离子交换层析进行分离，离心和分子筛或阴离子交换层析纯化后得到所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(e)控制pH值为8-9。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(e)控制温度为35-70℃。
11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述形成内核成分的金属盐类选自亚铁盐、铁盐、钆盐、锰盐、钴盐和/或镍盐。
12.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
13.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、氧气、或通过反应可以产生过氧化氢或氧气的物质。
14.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每个蛋白分子加入的金属元素原子数在140-10000之间。
15.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每个蛋白分子加入的钆原子数在100－200，和/或每个蛋白分子加入的铁原子数在500-10000之间。
16.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗物质为治疗表达铁蛋白受体的疾病的物质。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述物质连接有包裹磁性纳米颗粒的蛋白壳。
18.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述物质选自化疗药物、放射性同位素、细胞因子、核酸、抗癌或抗炎症药物。
19.如权利要求16-18任一所述的应用，其特征在于，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤和/或炎症。
20.如权利要求19所述的应用，所述的肿瘤选自肝癌、白血癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。
21.一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备用于诊断表达铁蛋白受体的疾病的磁性造影剂和分子探针中的应用。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤、和/或炎症。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血癌、或前列腺癌。
24.一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分为含有金属元素的化合物，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
25.如权利要求24所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素的化合物。
26.如权利要求24所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有钆元素的化合物。
27.如权利要求24所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素和锰元素的化合物。
28.如权利要求24所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分是为含有铁元素和钆元素的化合物。
29.如权利要求24-28任一所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述蛋白壳选自铁蛋白（ferritin）、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白或具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳；所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的蛋白壳可以特异性地与组织或细胞表面表达的受体结合。
30.如权利要求29所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述铁蛋白包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重（H）链亚基铁蛋白、全轻（L）链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。
31.一种如权利要求24-30任一所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到质粒pET11b上；
(b)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细胞BL21(DE3)plysS，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷激活T7启动子，诱导表达；
(c)表达结束后进行超声破碎释放蛋白；
(d)对蛋白进行分离和纯化；
(e)将形成内核成分的盐类和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为7-11，控制温度为25-80℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；形成内核成分的盐类的浓度为每次加入的金属元素原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，使每个蛋白分子加入的金属元素原子数在100-11000之间；氧化剂的浓度为每次加入氧化剂的分子数与加入金属元素离子的原子数之比为2∶1或3∶1；蛋白浓度>0.25mg/ml；
(f)排阻或离子交换层析进行分离，离心和分子筛或阴离子交换层析纯化后得到所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物。
32.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)控制pH值为8-9。
33.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)控制温度为35-70℃。
34.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述形成内核成分的盐类选自亚铁盐、铁盐、钆盐、锰盐、钴盐和/或镍盐。
35.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。
36.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素是铁元素。
37.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素是锰元素。
38.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素是钆元素。
39.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素是锰元素和铁元素。
40.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述金属元素是钆元素和铁元素。
41.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、氧气、或通过反应可以产生过氧化氢或氧气的物质。
42.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，每个蛋白分子加入的金属元素原子数在140-10000之间。
43.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，每个蛋白分子加入的钆原子数在100－200，和/或每个蛋白分子加入的铁原子数在500-10000之间。
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