CN113533409B - 一种用于定量检测液体生物样本中特定组分的弛豫核磁共振方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于定量检测液体生物样本中特定组分含量的弛豫核磁共振方法，所述组合物包括：山梨醇、亚铁盐、氧化酶类。具体过程包括步骤a)：通过特异性的一步或几步酶分解反应使液体生物样本中的微量目标组分生成与其含量相关的过氧化氢；步骤b)：产物过氧化氢在组合物影响下高灵敏度地氧化亚铁离子并导致样本溶液测得的1H‑NMR弛豫时间降低；步骤c)：与已知浓度的标准管样本比较并计算出被测样本中目标组分的含量。通过本发明方法及组合物，可以高灵敏度、高特异性、高抗干扰性地检测液体生物样本中的多种组分含量，有助于进一步拓展核磁共振技术在生物检测方向的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学方法分析检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测液体生物样本中特定组分的弛豫核磁共振方法及提升检测性能的组合物与反应液。
背景技术
弛豫核磁共振技术因其快速、易操作的特点在食品科学、生物检测等领域具有极大的应用前景，但受限于弛豫核磁共振分辨率较低，时域上无法很好的区分多种组分的信号叠加，因此应用于复杂样本中的小分子定量检测仍具有很大局限。尤其是应用于生物样本中微量成分的检测时，易受到样本基质中不同水平的干扰物影响，导致检测误差或无法检出，因此对弛豫核磁共振方法在具体应用中的特异性、灵敏度、抗干扰性具有较高要求。
在本领域中已知的一种弛豫核磁共振检测方法是顺磁离子介导的磁传感器，通过目标诱导的Fe2+/Fe3+弛豫转换，将目标组分的微弱信号放大为液体样本整体的弛豫变化。但它们的灵敏度仍相对较低，无法满足微量组分检测的应用需求。同时在实际的临床应用中，顺磁离子的氧化还原过程易受到左旋多巴、尿酸、vit-C、胆红素、谷胱甘肽等物质的干扰造成假性测量结果，严重影响测定的准确性。在提升弛豫核磁共振方法的抗干扰性方面，本领域已提出的一种解决方法是通过物理化学手段对生物样本进行预处理，尽可能除去其中的干扰蛋白，但在实际应用中，样本中存在的一些具有氧化还原性质的小分子化合物并不能被简单除尽，还易引入多余的干扰组分。在提升弛豫核磁共振方法的灵敏性方面，本领域已提出的一种解决方法是利用硫氰化钾与铁离子的螯合物来增强弛豫信号对比度，但形成的络合物不溶于水，易造成检测时取样不均匀，影响测定结果。同时硫氰化钾具有一定毒性，对环境亦有危害。
在弛豫核磁共振检测领域，目前尚缺乏一种简单、安全、有效的方案，能够在针对液体生物样本的定量检测中同时提升检测性能的多个方面，包括但不限于针对葡萄糖、胆固醇、甘油三酯的微量检测灵敏度、抗干扰能力以及检测特异性等。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于进一步拓展弛豫核磁共振技术在生物检测方向上的应用，提出一种用于定量检测液体生物样本中特定组分含量的弛豫核磁共振方法，并涉及一系列用于提升弛豫检测灵敏度、特异性以及抗干扰性的组合物及配制形成的反应液，更具体地，是经由酶反应方法将目标组分转换为对产物过氧化氢的定量检测，并通过所述组合物增强微量过氧化氢引起的1H-NMR弛豫信号差异，检测反应液弛豫时间变化并与标准管结果比较计算出目标组分的含量。
技术方案：一种用于定量检测液体生物样本中特定组分含量的弛豫核磁共振方法，具体步骤为：
a)通过特异性的酶分解反应使液体生物样本中的微量特定组分即目标组分生成与其含量相关的过氧化氢产物；所述的液体生物样本为来源于生物体且质地为液体的样本；所述的特异性的酶分解反应中的缓冲液里添加有提升检测性能的组合物，所述提升检测性能的组合物由特定种类酶、山梨醇、亚铁盐组成；
b)过氧化氢产物在组合物影响下高灵敏度地氧化亚铁离子并导致样本溶液测得的1H-NMR弛豫时间降低；
c)与已知浓度的标准管样本检测结果比较并计算出被测样本中目标组分的含量。
所述液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液、组织液。
所述微量特定组分生成与其含量相关的过氧化氢产物指的是葡萄糖与葡萄糖氧化酶，胆固醇酯与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶，甘油三酯与脂肪酶、甘油激酶及磷酸甘油氧化酶这类组合。
所述弛豫核磁共振方法是指基于1H-NMR时域信号快速检测样本至少包括横向或纵向弛豫时间在内的信息。
所述已知浓度的标准管样本是指对应当前目标组分的标准物溶液，标准物浓度已知。
所述特定种类酶根据当前目标组分选取，包括葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、磷酸甘油氧化酶中的任一种。
所述亚铁盐包括氯化亚铁、硫酸亚铁铵中的任一种。
所述特定种类酶的终浓度足以使目标组分发生特异性水解或氧化，反应过程中伴随有产物过氧化氢，且最终生成过氧化氢产物的含量与目标组分成比例关系。
所述亚铁盐产生的二价铁离子的终浓度根据目标组分的含量范围进行优化调配，使终溶液中二价铁离子不会被完全氧化。
有益效果：
本发明提供了一种通过核磁共振弛豫法检测快速检测液体生物样本中特定组分含量的方法，与现有检测液体样本的弛豫核磁共振技术相比，本发明中的组合物通过与目标组分间的生物化学反应可以提升弛豫核磁共振方法对样本中微量组分的检测灵敏度和特异性，将目标组分的含量转化为产物过氧化氢的含量，继而转化为NMR测得的弛豫时间的变化，大大提高检测差异对比度。本发明采用的NMR弛豫法高效、检出限低，涉及的组合物可以提升检测性能，更适用于生物样本中微量组分的检测。
附图说明
图1为本发明反应液及其中的组合物在针对血液中葡萄糖定量检测中的具体用途。
图2为本发明实施例1测定管中溶液的横向弛豫曲线及对应的弛豫时间T2。
图3为本发明的方法测定血清葡萄糖含量(实施例1)的结果与标准值(生化分析仪)的对比，其准确度优于市售普通电子血糖仪。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明的一种用于定量检测液体生物样本中特定组分含量的弛豫核磁共振方法及提升检测性能的组合物与反应液通过如下技术方案予以实现：
第一方面，一种用于定量检测液体生物样本中特定组分含量的弛豫核磁共振方法，具体步骤为：
a)通过特异性的一步或几步酶分解反应使液体生物样本中的微量目标组分生成与其含量相关的过氧化氢；
b)产物过氧化氢在组合物影响下高灵敏度地氧化亚铁离子并导致样本溶液测得的1H-NMR弛豫时间降低；
c)与已知浓度的标准管样本检测结果比较并计算出被测样本中目标组分的含量。
其中：
所述液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液、组织液等来源于生物体且质地为液体的样本。
所述特定组分是指可以经由一步或几步酶分解反应特异性地生成过氧化氢产物的组分，在具体的实施方案中可以是葡萄糖(葡萄糖氧化酶)，胆固醇酯(胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶)，甘油三酯(脂肪酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶)等。
所述弛豫核磁共振方法是指基于时域信号的1H-NMR快速检测样本横向或纵向弛豫时间。
所述已知浓度的标准管样本是指对应当前目标组分的标准物溶液，其标准物浓度已知。
第二方面，本发明提供一种组合物在提升弛豫核磁共振检测性能中的用途，所述组合物是指由包括特定种类酶、山梨醇、亚铁盐在内的生物化学试剂，有利地，所述提升是指灵敏度、特异性，和/或抗干扰性的性能的提升。
在本发明的定义中，术语“检测性能”主要是指灵敏度、特异性和抗干扰性。
其中：
所述特定种类酶根据当前目标组分选取，包括但不限于葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、磷酸甘油氧化酶等。
所述亚铁盐可以溶于缓冲液中产生二价铁离子，包括但不限于氯化亚铁、硫酸亚铁铵等。
本发明中组合物的用途分别通过如下生物化学反应予以体现：
在一个具体的实施方案中，胆固醇酯┄胆固醇酯酶→胆固醇+脂肪酸，胆固醇┄胆固醇氧化酶→Δ4-胆甾烯酮+H2O2，所述特定种类酶高特异性地将胆固醇酯和胆固醇的检测转化为过氧化氢的检测。
在一个具体的实施方案中，葡萄糖┄葡萄糖氧化酶→葡萄糖酸+H2O2，所述特定种类酶高特异性地将葡萄糖的检测转化为过氧化氢的检测。
在一个具体的实施方案中，甘油三酯┄脂肪酶→甘油+脂肪酸，甘油┄甘油激酶→甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸┄磷酸甘油氧化酶→磷酸二羟丙酮+H2O2，所述特定种类酶高特异性地将甘油三酯的检测转化为过氧化氢的检测。
二价铁离子+H2O2→三价铁离子，所述亚铁盐通过二价铁离子/三价铁离子不同的铁磁性质，高灵敏性地将过氧化氢含量的变化转化为样本弛豫时间的差异。
山梨醇+H2O2→过氧自由基，所述山梨醇与过氧化氢发生的链式反应提供的过氧自由基可以成倍氧化亚铁离子，极大提高反应液对过氧化氢的灵敏度。
第三方面，本发明提供一种弛豫核磁共振检测所用反应液，用于与检测样本中的目标组分发生一系列高灵敏性特异反应，其含有如上所述的组合物以及常规缓冲液，进一步包括样本。
其中：
所述特定种类酶的终浓度足以使后者发生特异性水解或氧化，反应过程中伴随有产物过氧化氢，且最终生成过氧化氢的含量与目标组分成比例关系。
所述亚铁盐产生的二价铁离子的终浓度根据目标组分的含量范围进行调配，使终溶液中二价铁离子不会被完全氧化。
本发明的弛豫核磁共振定量检测液体生物样本中特定组分的方法，与现有测定液体样本的弛豫核磁共振技术相比，通过引入本发明的组合物，将特定组分的微量核磁信号差异转化为金属离子氧化引起的更为显著的弛豫信号差异，可以高灵敏度、高特异性、高抗干扰性地检测液体生物样本中的多种组分含量。特别地，在复杂的临床检验情况下，通过调整不同的特定种类酶及对应的反应液，本方法可适用于多种指标的快速检测。
实施例1
检测人血清样本中的葡萄糖含量(检测范围3～20mmol/L)。
1.配制适用于葡萄糖定量检测的反应液：其中pH6.7磷酸盐缓冲液50mmol/L，葡萄糖氧化酶≥3ng/mL，山梨醇200mmol/L，氯化亚铁0.5mmol/L；
2.配制2只标准管样本液：其中葡萄糖浓度分别为3mmol/L以及20mmol/L，牛血清白蛋白0.2％；
3.取试管4只，按下表操作：
混匀后，37℃水浴孵育15min。
4.检测每只试管中溶液的横向弛豫时间T2，计算全血葡萄糖(mmol/L)＝3+17*(标准管1-测定管)/(标准管1-标准管2)。
实施例结果如下(斜体为计算数据)：
| 标准管1 | 标准管2 | 测定管1 | 测定管2 | 测定管3 | 测定管4 | |
| T2/ms | 2059.75 | 218.43 | 1757.53 | 1293.44 | 1595.93 | 1866.5 |
| Glucose/mM | 3 | 20 | 5.81 | 10.07 | 7.31 | 4.79 |
实施例2
检测人血清样本中的总胆固醇含量(检测范围2～10mmol/L)。
1.配制适用于总胆固醇定量检测的反应液：其中pH6.7磷酸盐缓冲液50mmol/L，胆固醇酯酶≥0.4kU/L，胆固醇氧化酶≥0.2kU/L，胆酸钠0.1％，山梨醇50mmol/L，硫酸亚铁铵0.5mmol/L；
2.配制2只标准管样本液：其中胆固醇标准物浓度分别为2mmol/L以及10mmol/L，牛血清白蛋白0.2％；
3.取试管4只，按下表操作：
混匀后，37℃水浴孵育15min。
4.检测每只试管中溶液的纵向弛豫时间T1，计算血清总胆固醇(mmol/L)＝2+8*(标准管1-测定管)/(标准管1-标准管2)。
实施例3
检测人血清样本中的甘油三酯含量(检测范围1～5mmol/L)。
1.配制适用于甘油三酯定量检测的反应液：其中pH6.7磷酸盐缓冲液50mmol/L，脂肪酶≥3U/mL，甘油激酶≥0.2U/mL，磷酸甘油氧化酶≥2.5U/mL，ATP≥0.15mmol/L，胆酸钠0.1％，山梨醇20mmol/L，硫酸亚铁铵0.5mmol/L；
2.配制2只标准管样本液：其中甘油三酯标准物浓度分别为1mmol/L以及5mmol/L，牛血清白蛋白0.2％；
3.取试管4只，按下表操作：
混匀后，37℃水浴孵育15min。
4.检测每只试管中溶液的纵向弛豫时间T1，计算血清甘油三酯(mmol/L)＝1+4*(标准管1-测定管)/(标准管1-标准管2)。
上述实施例为本发明针对血清中常见生化指标的定量检测的几种实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，具体步骤为：
a）通过特异性的酶分解反应使液体生物样本中的目标组分生成与其含量相关的过氧化氢产物；所述的液体生物样本为来源于生物体且质地为液体的样本；所述的特异性的酶分解反应中的缓冲液里添加有提升检测性能的组合物，所述提升检测性能的组合物由酶、山梨醇、亚铁盐组成；
b）过氧化氢产物在组合物影响下高灵敏度地氧化亚铁离子并导致样本溶液测得的1H-NMR弛豫时间降低；将被测样本置于测定管中，不同浓度的标准样本分别置于标准管1和标准管2中，然后，分别测定被测样本和标准管1和标准管2中的标准样本的横向弛豫时间或纵向弛豫时间；
c）通过对被测样本与已知浓度的标准管样本弛豫时间的检测结果比较并计算出被测样本中目标组分的含量C；具体计算如下：C（mmol/L）=C标准管1+（C标准管2-C标准管1）*（T标准管1-T测定管）/（T标准管1-T标准管2），其中C标准管1为标准管1中目标组分的已知含量，单位为mmol/L，C标准管2为标准管2中目标组分的已知含量，单位为mmol/L，T标准管1为标准管1中标准样本的弛豫时间，单位为ms，T标准管2为标准管2中的标准样本弛豫时间，单位为ms，T测定管为测定管中被测样本的弛豫时间，单位为ms；
所述目标组分为葡萄糖、胆固醇酯、甘油三酯中的任一种，所述的目标组分葡萄糖对应的特异性的酶为葡萄糖氧化酶，胆固醇酯对应的特异性酶为胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶，甘油三酯对应的特异性酶为脂肪酶、甘油激酶及磷酸甘油氧化酶。
2.根据权利要求1所述的一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液、组织液。
3.根据权利要求1所述的一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述已知浓度的标准管样本是指对应当前目标组分的标准物溶液，标准物浓度已知。
4.根据权利要求1所述的一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述亚铁盐包括氯化亚铁、硫酸亚铁铵中的任一种。
5.根据权利要求1所述的一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述酶的终浓度足以使目标组分发生特异性水解或氧化，反应过程中伴随有产物过氧化氢，且最终生成过氧化氢产物的含量与目标组分成比例关系。
6.根据权利要求1所述的一种用于定量检测液体生物样本中目标组分含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述亚铁盐产生的二价铁离子的终浓度根据目标组分的含量范围进行优化调配，使终溶液中二价铁离子不会被完全氧化。
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