CN105588936A - 一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘胆酸测定试剂及其制备方法,属于生化手段测试技术领域。包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样,所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由还原型辅酶溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将本发明应用于甘胆酸测定,具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法,属于生化手段测试技术领域。
背景技术
血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一,在肝细胞内,胆固醇经过极其复杂的酶促反应,转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12),侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合,分子量为462u。
CG在肝细胞合成,经胆管排入胆囊贮存,餐后胆囊收缩,随同胆汁排入小肠,参与脂肪的消化吸收,95%的胆酸由小肠粘膜重吸收入血,经门静脉输送至肝脏由肝细胞摄取。正常情况下,肝脏能有效摄取门静脉血中99%以上的CG重新泌入胆汁,仅有1%CG溢入体循环。当肝细胞受损时,肝细胞不能有效摄取经肠肝循环达肝脏的CG,致使血中CG含量增高;胆汁淤滞时,肝脏排泄胆酸发生障碍而返流入血循环中,也可使血中CG含量增高。
临床证明:肝损伤的生化指标中CG比谷丙转氨酶、胆红素等试验更敏感,具体如下:
(1)在急性肝炎、慢性活动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化及慢性迁延性肝炎等病症中,其血清CG的水平均高于正常对照组,升高阳性率按上述顺序递减,尤其在临床鉴别慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎方面,慢活肝CG升高的幅度和频率均高于慢迁肝,CG可作为一项有价值的指标,对判断慢性活动性肝炎的进展和缓解,预测疗效和复发均有很好价值。
(2)血清甘胆酸含量升高程度与肝硬化的病理发展进程呈正相关,是临床判断肝硬化程度和预后的很好的指标。
(3)血清甘胆酸水平在胆结石患者显著升高,可高达50倍。
(4)梗阻性肝病时,CG水平增高10-20倍,药物性胆汁郁积症血清胆酸也增高。
(5)孕妇在怀孕的中后期,由于婴儿的增大,会压迫肝脏,使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致CG的偏高,严重者可能会导致死胎。
(6)妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)又称妊娠迟发性胆汁淤积,属高危妊娠之一。本病虽然无孕妇死亡,但对胎儿有严重影响,易发生早产,胎儿宫内窘迫甚至围产儿死亡。
目前国内测定甘胆酸的方法主要有:
(1)乳胶增强免疫比浊法,该方法灵敏度较低,易出现前带现象。
(2)化学发光法,该方法虽然灵敏度高,但不稳定,重复性较差。
(3)酶联免疫法,该方法定量准确性差,操作时间长,自动化程度低,一般只用于定性检测。
基于此,做出本申请。
发明内容
为了克服现有甘胆酸在测试过程中存在的上述缺陷,本发明首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、操作简便,适用于临床全自动或半自动生化分析的甘胆酸测定试剂。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种甘胆酸测定试剂,包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样,所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。
进一步的,作为优选:
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷,更优选的,所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.0,浓度为0.65mol/L。
所述的硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD),其浓度为1g/L。
所述的还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型(NADH),其浓度为6g/L。
所述的甘胆酸脱氢酶浓度≥5000U/L。
所述的叠氮钠浓度为0.6mol/L。
同时,本发明还提供了一种具有上述特征甘胆酸测定试剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)R1试剂配制:向纯化水中加入缓冲液,搅拌至完全溶解;加入硫代氧化型辅酶I搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(2)R2试剂配制:向纯化水中加入缓冲液,搅拌至完全溶解;加入甘胆酸脱氢酶,搅拌至溶解;添加叠氮钠搅拌至溶解,加入还原型辅酶I搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(3)甘胆酸标准样配制:向纯化水中加入甘胆酸钠水合物,搅拌至完全溶解;加入缓冲液搅拌至溶解,加入叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(4)对上述制备的R1试剂、R2试剂及甘胆酸标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。
进一步的,作为优选:
所述的搅拌速度为450转/分。
步骤(1)中,所述的纯化水为1500ml,定容体积为1600ml。
步骤(2)中,所述的纯化水为300ml,定容体积为400ml。
步骤(3)中,所述的纯化水为80ml,定容体积为100ml。
本发明的工作原理如下:
甘胆酸标准样中的甘胆酸被甘胆酸脱氢酶(GCDH)及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)特异性地氧化,生成类固醇以及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原Thio-NADH;而生成的类固醇在GCDH和β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型(NADH)作用下,又生成甘胆酸及β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(NAD)。通过上述的循环,血清中微量的胆汁酸量得到了放大,Thio-NADH也同比的扩增,于是通过测定Thio-NADH在405nm特异性的吸光度变化,即可计算得到标本中甘胆酸的含量。
上述工作原理中,其反应过程具体如下:
(1)灵敏度评价试验
根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求,以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变,换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果:分析灵敏度2.7mg/L吸光度变化率(ΔA/min)≥0.00405ABS/min。
(2)线性范围评价试验
根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议,对试剂线性范围进行验证时,在待验证线性范围内选择5个浓度水平,每个浓度水平重复测定3次。
(3)精密度评价试验
精密度评价包括重复性和批间差,且至少评估二个浓度水平样本的精密度,其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此,重复性评价采用在重复性条件下,用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试,每个浓度重复测试10次;批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒,每个批号测试3次。
(4)准确度评价试验
用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品,以指定的分析系统作为比对方法,每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。
评估结果:三批试剂的重复性变异系数CV≤6%;批间差≤10%;相对偏差≤15%,试剂线性可达80mg/L,分析灵敏度2.7mg/L吸光度变化率(ΔA/min)≥0.00405ABS/min。
本发明利用酶循环法测定甘胆酸的方法,其优点是快速灵敏,准确性好,特异性高,稳定性好,操作简便,可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
具体实施方式
本实施例所用主要试剂:磷酸盐缓冲液:pH7.0,0.65mmol/L;Thio-NAD(硫代氧化型辅酶I):1g/L;甘胆酸脱氢酶(GCDH):≥5000U/L:叠氮钠:0.6mmol/L;NADH(还原型辅酶I):6g/L;均购自Enzymaker公司。
1)R1试剂的配制
①将1500ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③称取Tris1g加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④称取1g硫代氧化型辅酶I加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑤搅拌十分钟以上。
⑥定容至1600ml。
2)R2试剂的配制
①将300ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③称取0.3gTris加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④称取2g甘胆酸脱氢酶加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑤称取1.2g叠氮钠加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑥称取12g还原型辅酶I加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑦搅拌十分钟以上。
⑧定容至400ml。
3)标准品的配制
①将80ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③称取0.8mg甘胆酸钠水合物加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④称取5mgTris加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
⑤称取6.7mg叠氮钠加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑥搅拌十分钟以上。
⑦定容至100ml。
4)试剂检验
①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。
测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定,基本测定参数如下:
方法:终点法,反应方向:向上;波长:600nm,温度37℃。
比色杯光径:1cm;R1试剂:200μl,R2试剂:50μl,甘胆酸标准样:6μl。
第一测光点:在R2加入后1分钟读取;第二测光点:在R2加入后5分钟读取。
②试剂外观检查:目测检查。
③装量检查:用通用量具测量。
④试剂空白测定:
用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒,在测试主波长下,记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂),A2即为工作试剂的空白吸光度。
⑤线性范围测定:
取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。
表1样本稀释表
实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
生理盐水(ml) | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
高值标本H(ml) | 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
稀释比例 | 原倍 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
表中:实施例1样本的浓度为已知定值CH,实施例2-5样本浓度按公式:样本浓度=CH×稀释比例,计算作为预期值,将稀释好的样本系列充分混匀,在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次,均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测)。
统计学分析:以预期值为横坐标,样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析,确定线性区间计算出直线方程y=a+bx及相关系数,当相关系数r≥0.990时为线性良好。
数据分析处理采用MicrosoftExcel软件。
相关公式如下:
式中,C:浓度;V:容积;b:回归线的斜率;∣a∣:回归线截距的绝对值;r:相关系数;Xi:各管预期值;Yi:各管测定值;i:1、2、3.……、n;n:测定样本数。
⑥精密度测定:
a.重复性测定:
用临床标本或质控血清测试试剂盒,重复测试10次,计算测量值的平均值
和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。
与变异系数CV(%)
CV=
式中:——待测血清样本的均值;
Xi——测定血清样本的测定结果;
n——测定次数
CV——变异系数
b.批间差测定
取三个批号送检试剂,每个批号取3瓶,分别测定1份临床样本或质控血清,可选用罗氏质控品,分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用MicrosoftExcel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。
相关公式如下:
式中:
中的最大值;
中的最小值;
——总均值。
⑦准确性测定:
取校准品(有证参考物质,CRM)对试剂盒进行测试,重复检测3次,取测试结果均值(M),按公式(7)计算相对偏差(B)。
相对偏差(B)=(M-T)/T×100%…………………………………(7)
式中:T——有证参考物质(CRM)标示值;M——样品测定结果均值;
⑧分析灵敏度:
用已知浓度或活性的样品测试试剂盒,记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变,换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明,不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明,对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明创造的保护范围。
Claims (10)
1.一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样,所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。
2.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷。
3.如权利要求2所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.0,浓度为0.65mol/L。
4.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型,其浓度为1g/L。
5.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型,其浓度为6g/L。
6.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的甘胆酸脱氢酶浓度≥5000U/L。
7.如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂,其特征在于:所述的叠氮钠浓度为0.6mol/L。
8.一种权利要求1-7任一项所述甘胆酸测定试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)R1试剂配制:向纯化水中加入缓冲液,搅拌至完全溶解;加入硫代氧化型辅酶I搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(2)R2试剂配制:向纯化水中加入缓冲液,搅拌至完全溶解;加入甘胆酸脱氢酶,搅拌至溶解;添加叠氮钠搅拌至溶解,加入还原型辅酶I搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(3)甘胆酸标准样配制:向纯化水中加入甘胆酸钠水合物,搅拌至完全溶解;加入缓冲液搅拌至溶解,加入叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(4)对上述制备的R1试剂、R2试剂及甘胆酸标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。
9.如权利要求8所述的甘胆酸测定试剂的制备方法,其特征在于:所述的搅拌速度为450转/分。
10.如权利要求8所述的甘胆酸测定试剂的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述的纯化水为1500ml,定容体积为1600ml;步骤(2)中,所述的纯化水为300ml,定容体积为400ml;步骤(3)中,所述的纯化水为80ml,定容体积为100ml。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160518 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |