CN106442496A - 游离脂肪酸检测试剂盒 - Google Patents

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袁凤凤
李基�
王会
陈汉艳
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    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种游离脂肪酸检测试剂盒。该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中，R1试剂包含：三磷酸腺苷、金属离子、脂酰辅酶A合成酶以及4‑氨基安替比林；R2试剂包含：辅酶A、Trinder’s色原以及脂酰辅酶A氧化酶。本发明的实施方式中，通过在R1试剂中加入金属离子，使得金属离子能够与辅酶A(与游离脂肪酸反应之后游离的辅酶A)上的巯基发生了离子交换和配位反应形成稳定的螯合物，消除了辅酶A上的巯基对过氧化氢产生的影响。从而实现了提高游离脂肪酸检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。

Description

游离脂肪酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒。
背景技术
游离脂肪酸即非酯化脂肪酸(non-estesterfied fatty acid，NEFA)，是人体内脂肪的水解产物，反映人体脂肪代谢情况及血脂水平。其含量升高的症状多见于肥胖、糖尿病、心肌梗塞、甲状腺机能亢进、肢端肥大症、严重的肝病以及饥饿；其含量降低的症状可见于甲状腺机能减退、脑垂体功能不全以及阿狄森氏病。
目前临床上对人体血清游离脂肪酸的检测主要是通过游离脂肪酸检测试剂盒来检测，而市场上售卖的游离脂肪酸检测试剂盒通常使用的是酶法测定，游离脂肪酸试剂盒的主要反应原理大都基于Trinder反应模式，具体反应过程如下：
游离脂肪酸+ATP+CoA→Acyl-CoA+AMP+PPi
Acyl-CoA+O2→Enoyl-CoA+H2O2
H2O2+4-氨基安替比林+TOPS→醌亚胺+H2O
样本中的游离脂肪酸(NEFA)与ATP、辅酶A(CoA)在脂酰辅酶A合成酶的催化下反应生成脂酰辅酶A(Acyl-CoA)、AMP和磷酸(PPi)。Acyl-CoA在脂酰辅酶A氧化酶的催化下，氧化成烯脂酰辅酶A(Enoyl-CoA)和过氧化氢，最后过氧化氢在过氧化物酶的催化下与4-氨基安替比林和TOPS反应生成红色醌亚胺化合物。但是酶法测定游离脂肪酸的试剂盒存在以下问题：生成的H2O2会与R2试剂中辅酶A上的巯基(-SH)结构迅速发生反应，消耗一部分H2O2，这样就导致H2O2在过氧化物酶的催化下与4-氨基安替比林和TOPS反应生成红色醌亚胺化合物减少，而红色醌亚胺化合物的生成量与样本中的游离脂肪酸的含量呈正比，通过测定红色醌亚胺化合物的吸光度即可得到样品中游离脂肪酸的浓度，由此测定的游离脂肪酸浓度也相应的减少，有可能造成假阴性的结果，对病情的判断带来失误。为解决上述问题，有厂家选择在试剂盒中加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，但是该试剂本身不稳定，同时会与脂酰辅酶A氧化酶发生反应，导致Trinder反应中脂酰辅酶A氧化酶的量难以控制，造成检测结果发生误差。
综上所述，提供一种准确度高、稳定性好的游离脂肪酸检测试剂盒是目前我们亟需解决的问题。
发明内容
本发明实施方式的目的在于提供一种游离脂肪酸检测试剂盒，使得游离脂肪酸检测试剂盒的准确性有所提高，且试剂盒稳定性好。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种游离脂肪酸检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中，R1试剂包含：三磷酸腺苷、金属离子、脂酰辅酶A合成酶、过氧化物酶以及4-氨基安替比林；R2试剂包含：辅酶A、Trinder’s色原以及脂酰辅酶A氧化酶。
本发明实施方式相对于现有技术而言，通过在R1试剂中加入金属离子，使得金属离子能够与辅酶A上的巯基发生了离子交换和配位反应形成稳定的螯合物，消除了辅酶A上的巯基对过氧化氢产生的影响。从而实现了提高游离脂肪酸检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。
另外，金属离子为铅离子、银离子、汞离子以及铬离子中的一种或几种。
另外，金属离子为铅离子。
另外，铅离子、银离子、汞离子、铬离子分别由Pb(NO3)2、AgNO3、Hg(NO3)2或Cr(NO3)3提供。
另外，R1试剂中各物质的浓度如下：
另外，R2试剂中各物质的浓度如下：
辅酶A 0.4～6g/L；
Trinder’s色原 0.5～5g/L；
脂酰辅酶A氧化酶 5～30KU/L。
另外，R1试剂与R2试剂中还分别包含缓冲液和防腐剂。
另外，R1试剂与R2试剂中的防腐剂的体积浓度为1～20％。
另外，R1试剂中的缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
另外，R1试剂与R2试剂的体积比为4:1。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中，R1试剂包含：三磷酸腺苷(ATP)、金属离子、脂酰辅酶A合成酶、过氧化物酶以及4-氨基安替比林；R2试剂包含：辅酶A(CoA)、Trinder’s色原以及脂酰辅酶A氧化酶。
需要说明的是，金属离子可以为铅离子、银离子、汞离子以及铬离子中的一种或几种。具体地，铅离子、银离子、汞离子、铬离子可以由Pb(NO3)2、AgNO3、Hg(NO3)2或Cr(NO3)3提供。在本实施方式中，金属离子可以为铅离子，且该铅离子可以由Pb(NO3)2提供。但是本实施方式不应以此为限。本领域技术人员可以根据需要灵活选择。
值得注意的是，R1试剂中各物质的浓度如下：
R2试剂中各物质的浓度如下：
辅酶A 0.4～6g/L；
Trinder’s色原 0.5～5g/L；
脂酰辅酶A氧化酶 5～30KU/L。
另外，R1试剂与R2试剂中还可以分别包含缓冲液和防腐剂。其中，R1试剂与R2试剂中的防腐剂的浓度为1～20％。R1试剂中的缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
值得一提的是，R1试剂与R2试剂的体积比为4:1。
具体地，本实施方式游离脂肪酸检测试剂盒中各个物质的反应参数如下所示：
R1试剂:
R2试剂:
其中，试剂盒中R1和R2试剂的体积比是4:1。
需要说明的是，上述试剂的配制方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
本发明实施方式相对于现有技术而言，本实施方式在原有未加金属离子的酶法测定试剂盒R1试剂基础上加入Pb(NO3)2，虽然金属离子对过氧化氢的分解具有催化作用，但是其反应是一个非常缓慢的过程。与过氧化氢反应的速度：巯基≥Trinder’s色原＞金属离子，即生成的过氧化氢与Trinder’s色原反应生成红色醌亚胺化合物的速度及辅酶A中的巯基与过氧化氢的反应速度远远快于金属离子对过氧化氢的分解速度，所以完全可以忽略加入的金属离子对过氧化氢的影响。辅酶A中的巯基是典型的软碱性配位基团，能与软酸离子形成稳定螯合物，金属离子的“软度”较高，能够很好的被巯基吸附。所以选择在R1试剂中加入Pb(NO3)2，铅离子能够与巯基发生了离子交换和配位反应，化学吸附起支配作用，最后辅酶A中的巯基与Pb2+形成稳定的螯合物。通过上述内容，不难发现：样本中的游离脂肪酸(NEFA)与ATP、辅酶A(CoA)在脂酰辅酶A合成酶的催化下反应生成脂酰辅酶A(Acyl-CoA)后，游离的辅酶A与金属离子发生离子交换和配位反应生成稳定的螯合物，这样便消除巯基对过氧化氢的影响，使得试剂盒最终的显色反应不受影响，从而实现了提高游离脂肪酸检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。
具体地，使用本实施方式中的试剂盒检测样品中游离脂肪酸的步骤如下：
其中，在检测的过程中以全自动日立生化分析仪7100为例。
主波长为546nm(或附近)；副波长660nm(或附近)；比色杯光径为1.0cm；两点终点法；上升反应。
试剂加样比见表1：
本试剂盒默认单位为：mmol/L。
校准曲线的绘制：采用Linear 2点校准曲线定标法。以空白样本定值为0.00mmol/L，对校准品测定相应的△A，以△A为Y轴，浓度为X轴。在自动分析仪上，采用Linear 2点建立校准曲线。计算时根据样本的△A值在校准曲线上找到相应的浓度。
样品中游离脂肪酸浓度按下述公式计算：
需要说明的是，由于上述检测游离脂肪酸浓度的方法是常规方法，故本实施方式并没有对校准品中游离脂肪酸浓度、校准曲线进行详细说明，本领域技术人员可以根据需要测定的游离脂肪酸浓度灵活选择。
为了验证发明的试剂盒与市售的游离脂肪酸测定试剂盒假阴性测定的概率，最好的方法是使用第三方试剂盒进行验证，而选择的该第三方试剂盒是德赛酶法游离脂肪酸测定试剂盒，原因是：德赛酶法游离脂肪酸测定试剂盒是德国研发生产的体外诊断试剂盒，常被选用为参比试剂，具有较好抗干扰能力和检测限，线性和精密度好，临床检测性能良好，由此选择德赛酶法游离脂肪酸试剂盒作为假阴性验证的金标准试剂盒。
其中，三种试剂盒分别为：市售的未加金属离子的酶法测定试剂盒、本实施方式中加金属离子的酶法测定试剂盒以及德赛酶法测定试剂盒。德赛试剂盒的参考范围是0.10-0.60mmol/L，市售的未加金属离子的酶法试剂盒的参考范围是0.10-0.60mmol/L，本实施方式中试剂盒的参考范围是0.1-0.6mmol/L。
标本来源：选取100名常规体检的男性作为研究对象，空腹状态下采集静脉血5ml，将样本在低温条件下离心5min后得到相应血清随即用于以下分析。选择的样本血清无明显溶血、黄疸或脂血。
三组试剂盒同时对100例人血清样本中游离脂肪酸的进行检测，检测结果如表2所示：
通过对表2中检测结果的统计分析，未加金属离子的酶法游离脂肪酸测定试剂盒测定结果
以德赛酶法游离脂肪酸试剂盒的检测结果为金标准，不难发现，市售的未加金属离子的试剂盒与德赛的试剂盒及本实施方式中的酶法游离脂肪酸测定试剂盒相比，所测的游离脂肪酸的浓度都偏低，由此可以说明未加金属离子的试剂盒中在检测反应的过程中产生的过氧化氢与辅酶A中的巯基反应被消耗，使得过氧化氢与4-氨基安替比林和TOPS反应生成的红色醌亚胺化合物的量减少，导致结果偏低而造成假阴性，假阴性率＝诊断假阴性人数/金标准的有病人数＝5/45＝0.11；加入金属离子之后，金属离子与辅酶A中的巯基反应生成稳定的螯合物，消除了辅酶A中的巯基对过氧化氢产生的影响，假阴性率明显降低，从而实现了提高游离脂肪酸检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。
本发明的第二实施方式涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中，
R1试剂:
R2试剂:
其中，试剂盒中R1和R2试剂的体积比是4:1。
本发明的第三实施方式涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中，
R1试剂:
R2试剂:
其中，试剂盒中R1和R2试剂的体积比是4:1。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂，其中，
所述R1试剂包含：三磷酸腺苷、金属离子、脂酰辅酶A合成酶、过氧化物酶以及4-氨基安替比林；
所述R2试剂包含：辅酶A、Trinder’s色原以及脂酰辅酶A氧化酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金属离子为铅离子、银离子、汞离子以及铬离子中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述金属离子为铅离子。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述铅离子、银离子、汞离子、铬离子分别由Pb(NO3)2、AgNO3、Hg(NO3)2或Cr(NO3)3提供。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中各物质的浓度如下：
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中各物质的浓度如下：
辅酶A 0.4～6g/L；
Trinder’s色原 0.5～5g/L；
脂酰辅酶A氧化酶 5～30KU/L。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂与所述R2试剂中还分别包含缓冲液和防腐剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂与所述R2试剂中的防腐剂的体积浓度为1～20％。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中的缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂与所述R2试剂的体积比为4:1。
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