CN113418877A - 一种游离脂肪酸检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种游离脂肪酸检测试剂盒及方法，其包括两种独立放置的液体试剂，这两种液体试剂包括了缓冲液为50mmol/L至100mmol/L、氯化镁为50mmol/L至120mmol/L；辅酶A为1.0KU/L至3.0KU/L和脂酰辅酶A合成酶为1.0KU/L至3.0KU/L等试剂。在现有的试剂中加入了5,5'‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸)，这种试剂与辅酶A的巯基结构能够进行化学反应，并且这种化学反应为有条件的可逆反应，其在pH大于6.8的时候能够相互反应而对于巯基进行结合保护，而当pH小于6.8的时候则不会对于辅酶A的巯基进行化学反应产生结合。这样就会使得辅酶A的巯基对于过氧化氢的破坏作用减少，从而提高检测的准确度。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒及方法。
背景技术
游离脂肪酸属于有机酸类型的物质。这种脂肪酸在人体内的脂质会存在。具体的分类中，其能够划分为胆固醇、中性脂肪和磷脂质这三种。而至于游离脂肪酸而言，其应该属于中性脂肪经过分解后形成的物质。在肌肉处于运动中而需要能量的时候，特别是当肝糖消耗完毕的时候，脂肪组织就能够分解中性脂肪，从而得到游离脂肪酸，这样就能够充当能量来供人体的使用。因此，游离脂肪酸在人体的持久活动中是一种十分重要的物质。
在医学检验中，通过游离脂肪酸这种物质的检测就能够分析出一些基础性疾病。特别是能够检测得到相关的脂肪代谢类疾病，例如高胆固醇血症，高甘油三酯等疾病；另外，该物质的检测对于糖尿病的诊断和观察也具有十分重要的意义。因此，在现有技术中已经出现了多种类型的对于游离脂肪酸的检测的试剂盒等方案。
其中，对于游离脂肪酸的检测方案中，应用较为广泛的一种方法就是采用如下的方式：人体采集的血清样本中的游离脂肪酸与试剂盒中的试剂辅酶A，在脂酰辅酶A合成酶合成酶的环境下就能够反应形成脂酰辅酶A。脂酰辅酶A在脂酰辅酶A氧化酶的条件下形成过氧化氢，然后通过过氧化氢在过氧化物酶(POD)的作用下与色原底物反应形成有色的物质，这样就能够通过仪器对于有色物质的浓度进行检测，进而间接得到血清样本中的游离脂肪酸的浓度。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种能够对于辅酶A的巯基进行结合保护进而对于过氧化氢的消耗形成保护作用的试剂盒。
本发明提供一种游离脂肪酸检测试剂盒，其包括两种独立放置的液体试剂，这两种液体试剂的组成比例如下：
第一种试剂包括：缓冲液为50mmol/L至100mmol/L，所述缓冲液的pH小于6.8；氯化镁为50mmol/L至120mmol/L；辅酶A为1.0KU/L至3.0KU/L；脂酰辅酶A合成酶为1.0KU/L至3.0KU/L；腺苷三磷酸为5mmol/L至15mmol/L；4-氨基安替比林为0.5g/L至1.5g/L；5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.01mmol/L至0.1mmol/L；
第二种试剂包括：缓冲液为50mmol/L至100mmol/L；脂酰辅酶A氧化酶2.0KU/L至6.0KU/L；过氧化物酶1.0KU/L至3.0KU/L；色原为15g/L至20g/L；另外，第一种试剂和第二种试剂的基础溶剂为纯化水。
上述方案的有益效果为：在现有的试剂中加入了5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，这种试剂与辅酶A的巯基结构能够进行化学反应，并且这种化学反应为有条件的可逆反应，其在pH大于6.8的时候能够相互反应而对于巯基进行结合保护，而当pH小于6.8的时候则不会对于辅酶A的巯基进行化学反应产生结合。因此，本发明的试剂中把pH控制在了6.8以下，然后辅酶A处于游离状态，当加入待检测样品后，游离脂肪酸能正常地与辅酶A进行反应生成脂酰辅酶A。然后，脂酰辅酶A在脂酰辅酶A氧化酶的作用下形成过氧化氢，过氧化氢这个时候会与多余的辅酶A的巯基进行反应，从而造成对于过氧化氢的消耗，虽然这种反应的量不大，但是依然会造成过氧化氢的量的减小，这样就对于后期的测量造成了误差。而在进入这种反应的后期，通过对于pH的调节作用，就能够使得pH在6.8以上，然后使得辅酶A与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)进行反应从而完成对于巯基的结合保护，这样就会使得辅酶A的巯基对于过氧化氢的破坏作用减少，从而提高检测的准确度。
一个优选的方案是，其中缓冲液为70mmol/L、氯化镁为80mmol/L、辅酶A为2.0KU/L、脂酰辅酶A合成酶为2.0KU/L、腺苷三磷酸为10mmol/L；4-氨基安替比林为1.0g/L、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.05mmol/L；在第二种试剂中，缓冲液为70mmol/L、脂酰辅酶A氧化酶为4.0KU/L、过氧化物酶为2.0KU/L、色原为18g/L。
一个优选的方案是，所述第二种试剂具有螯合剂，所述螯合剂为以下物质的至少一种：乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、二羟乙基甘氨酸。
一个优选的方案是，所述色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺、高水溶性苯胺衍生物色原或者3-甲基-N-乙基-N-苯胺。
一个优选的方案是，所述缓冲液为以下物质的至少一种：磷酸缓冲盐溶液、两性离子缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
本发明提供的游离脂肪酸检测试剂盒的使用方法，其包括下面的步骤：
S1：把待测试的样品先与第一种试剂进行混合反应经过一定时间后形成第一混合液；
S2：调节第一混合液的pH在6.8以上，并且把第二种试剂加入到第一混合液内继续进行反应，经过一定时间后形成第二混合液；
S3：把第二混合液放入到仪器中检测吸光光度值，经过计算得到待测试的样品中的游离脂肪酸的浓度。
一个优选的方案是，所述待测试的样品、第一种试剂和第二种试剂的体积用量比为1:10～30:5～10。
一个优选的方案是，所述第二种试剂的pH大于6.8，在所述S2中通过加入第二种试剂而完成对于第一混合液的pH的调节，即使得pH在6.8以上。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的辅酶A与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)进行反应示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明提供一种游离脂肪酸检测试剂盒，其包括两种独立放置的液体试剂，这两种液体试剂的组成比例如下：
第一种试剂包括：缓冲液为50mmol/L至100mmol/L，所述缓冲液的pH小于6.8；氯化镁为50mmol/L至120mmol/L；辅酶A为1.0KU/L至3.0KU/L；脂酰辅酶A合成酶为1.0KU/L至3.0KU/L；腺苷三磷酸为5mmol/L至15mmol/L；4-氨基安替比林为0.5g/L至1.5g/L；5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.01mmol/L至0.1mmol/L；
第二种试剂包括：缓冲液为50mmol/L至100mmol/L；脂酰辅酶A氧化酶2.0KU/L至6.0KU/L；过氧化物酶1.0KU/L至3.0KU/L；色原为15g/L至20g/L；另外，第一种试剂和第二种试剂的基础溶剂为纯化水。
在现有的试剂中加入了5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，这种试剂与辅酶A的巯基结构能够进行化学反应，并且这种化学反应为有条件的可逆反应，其在pH大于6.8的时候能够相互反应而对于巯基进行结合保护，而当pH小于6.8的时候则不会对于辅酶A的巯基进行化学反应产生结合。因此，本发明的试剂中把pH控制在了6.8以下，然后辅酶A处于游离状态，当加入待检测样品后，游离脂肪酸能正常地与辅酶A进行反应形成脂酰辅酶A，然后在脂酰辅酶A氧化酶的作用下形成过氧化氢，而过氧化氢这个时候会与多余的辅酶A的巯基进行反应，从而造成对于过氧化氢的消耗，虽然这种反应的量不大，但是依然会造成过氧化氢的量的减小，这样就对于后期的测量造成了误差。而在进入这种反应的后期，通过对于pH的调节作用，就能够使得pH在6.8以上，然后如图1所示使得辅酶A与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)进行反应从而完成对于巯基的结合保护，这样就会使得辅酶A的巯基对于过氧化氢的破坏作用减少，从而提高检测的准确度。
优选地，本实施例中的缓冲液为70mmol/L、氯化镁为80mmol/L、辅酶A为2.0KU/L、脂酰辅酶A合成酶为2.0KU/L、腺苷三磷酸为10mmol/L；4-氨基安替比林为1.0g/L、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.05mmol/L；在第二种试剂中，缓冲液为70mmol/L、脂酰辅酶A氧化酶为4.0KU/L、过氧化物酶为2.0KU/L、色原为18g/L。
所述第二种试剂具有螯合剂，所述螯合剂为以下物质的至少一种：乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、二羟乙基甘氨酸。所述色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺、高水溶性苯胺衍生物色原或者3-甲基-N-乙基-N-苯胺。所述缓冲液为以下物质的至少一种：磷酸缓冲盐溶液、两性离子缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
本发明提供的游离脂肪酸检测试剂盒的使用方法，其包括下面的步骤：
S1：把待测试的样品先与第一种试剂进行混合反应经过一定时间后形成第一混合液，液体中包括了脂酰辅酶A；
S2：调节第一混合液的pH在6.8以上，通过pH的调节而抑制游离状态的辅酶A的巯基存在，并且把第二种试剂加入到第一混合液内继续进行反应，经过一定时间后形成第二混合液；在这个过程中，脂酰辅酶A会与脂酰辅酶A氧化酶反应形成过氧化氢，过氧化氢与色原底物反应形成有色物质；
S3：把第二混合液处理后放入到仪器中检测吸光光度值，经过计算得到待测试的样品中的游离脂肪酸的浓度。
优选地，所述待测试的样品、第一种试剂和第二种试剂的体积用量比为1:10～30:5～10。
所述第二种试剂的pH大于6.8，在所述S2中通过加入第二种试剂而完成对于第一混合液的pH的调节，即使得pH在6.8以上。这样就省去了对于pH的调节过程，即通过第二种试剂的加入过程，就能够使得pH自动地调节为6.8以上，这样就实现了更加简单的操作流程，即加入第二种试剂的时候自动调节，并且通过这种调节而使得反应液内的辅酶A自动消除，这样就不会对于第二次反应的过氧化氢物质形成影响。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (8)
1.一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于：包括两种独立放置的液体试剂，这两种液体试剂的组成比例如下：
第一种试剂包括：
缓冲液为50mmol/L至100mmol/L，所述缓冲液的pH小于6.8；
氯化镁为50mmol/L至120mmol/L；
辅酶A为1.0KU/L至3.0KU/L；
脂酰辅酶A合成酶为1.0KU/L至3.0KU/L；
腺苷三磷酸为5mmol/L至15mmol/L；
4-氨基安替比林为0.5g/L至1.5g/L；
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.01mmol/L至0.1mmol/L；
第二种试剂包括：
缓冲液为50mmol/L至100mmol/L；
脂酰辅酶A氧化酶2.0KU/L至6.0KU/L；
过氧化物酶1.0KU/L至3.0KU/L；
色原为15g/L至20g/L；
另外，第一种试剂和第二种试剂的基础溶剂为纯化水。
2.如权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于：在第一种试剂中，其中缓冲液为70mmol/L、氯化镁为80mmol/L、辅酶A为2.0KU/L、脂酰辅酶A合成酶为2.0KU/L、腺苷三磷酸为10mmol/L；4-氨基安替比林为1.0g/L、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为0.05mmol/L；
在第二种试剂中，缓冲液为70mmol/L、脂酰辅酶A氧化酶为4.0KU/L、过氧化物酶为2.0KU/L、色原为18g/L。
3.如权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于：所述第二种试剂具有螯合剂，所述螯合剂为以下物质的至少一种：乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、二羟乙基甘氨酸。
4.如权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于：所述色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺、高水溶性苯胺衍生物色原或者3-甲基-N-乙基-N-苯胺。
5.如权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为以下物质的至少一种：磷酸缓冲盐溶液、两性离子缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
6.如权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括下面的步骤：
S1：把待测试的样品先与第一种试剂进行混合反应经过一定时间后形成第一混合液；
S2：调节第一混合液的pH在6.8以上，并且把第二种试剂加入到第一混合液内继续进行反应，经过一定时间后形成第二混合液；
S3：把第二混合液放入到仪器中检测吸光光度值，经过计算得到待测试的样品中的游离脂肪酸的浓度。
7.如权利要求6所述的游离脂肪酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述待测试的样品、第一种试剂和第二种试剂的体积用量比为1:10～30:5～10。
8.如权利要求7所述的游离脂肪酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述第二种试剂的pH大于6.8，在所述S2中通过加入第二种试剂而完成对于第一混合液的pH的调节，即使得pH在6.8以上。
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