CN111088320A - α-L-岩藻糖苷酶测定试剂 - Google Patents

α-L-岩藻糖苷酶测定试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶测定试剂，所述α‑L‑岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源‑岩藻糖苷底物、0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L金属络合剂，通过加入所述稳定剂解决色源‑岩藻糖苷底物水解反应导致试剂空白显著上升的问题，采用GOOD’S生物缓冲液和所述激活剂提高稳定性和灵敏度。

Description

α-L-岩藻糖苷酶测定试剂
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase，AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，分类名为a-L-岩藻糖苷酶岩藻糖水解酶(EC32.1.51)。AFU其基本生理功能是催化含岩藻糖基的各种糖脂、粘多糖、糖蛋白和糖苷等大分子物质的分解代谢，广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中，多项研究证实AFU是一项新的诊断原发性肝癌的肿瘤标志物，随着对AFU的进一步深入研究，检测方法也不断发展。 AFU的主要检测方法有荧光法、化学比色法、连续监测法等。荧光法的底物为 4-甲基伞形酮α-L-岩藻吡喃糖苷，方法灵敏度高，但需要专门的仪器，不能常规应用。比色法常用的底物是对硝基酚α-L-岩藻吡喃糖苷(PNP-F)，适用于手工法测定，因需要设定血清空白管已排除胆红素引起的干扰，难以实现自动分析。随着AFU检测方法学的不断发展与进步，连续监测法是最近应用最普遍的检测方法，它以对硝基苯岩藻糖苷为底物，经样本中AFU催化水解，产生对硝基酚(CNP)，在405nm或410nm波长下监测CNP的生成速率，可计算出样本中AFU的活性。连续监测法具有测试快速、操作方便的特点，以此为基础的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒已逐步在临床检验中得到普及应用，但试剂盒普遍存在灵敏度不够、底物不稳定，特别是试剂空白吸光度显著上升的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，灵敏度高、稳定性好，并且试剂空白低。
为实现上述目的，本发明提供了一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，所述α-L- 岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L 色源-岩藻糖苷底物、0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L金属络合剂。
其中，所述缓冲液为PH值在4.0～7.0之间的GOOD’S生物缓冲液，所述 GOOD’S生物缓冲液包括吗啉乙磺酸-盐酸、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸-盐酸和1,4- 哌嗪二乙磺酸-盐酸中任意一种或多种混合物。
其中，所述稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚和月桂醇聚氧乙烯醚中任意一种或两者混合物。
其中，所述激活剂为硫酸锌和氯化锌中任意一种或两者混合物。
其中，所述非离子型表面活性剂为曲拉通X-100和吐温TWEEN-20中任意一种或两者混合物。
其中，所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者混合物。
其中，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠和Proclin 300中任意一种或两者混合物。
本发明的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源-岩藻糖苷底物、 0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L 金属络合剂，通过加入所述稳定剂解决色源-岩藻糖苷底物水解反应导致试剂空白显著上升的问题，采用GOOD’S生物缓冲液和所述激活剂提高稳定性和灵敏度。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。
本发明提供一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源-岩藻糖苷底物、 0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L 金属络合剂。
在本实施方式中，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源-岩藻糖苷底物、0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L金属络合剂，所述缓冲液为PH值在4.0～7.0之间的GOOD’S生物缓冲液，所述GOOD’S生物缓冲液包括吗啉乙磺酸-盐酸(MES-HCL)、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸-盐酸(MOPSO-HCL) 和1,4-哌嗪二乙磺酸-盐酸(PIPES-HCL)中任意一种或多种混合物，所述缓冲液可以解决生物酶原料稳定保存和无干扰反应问题，并且所述缓冲液的PH值为4.0～ 7.0之间，可以保证生物酶的活性，利于生物酶原料的稳定保存，所述稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚和月桂醇聚氧乙烯醚中任意一种或两者混合物，可以延缓色源-岩藻糖苷底物水解反应，提高试剂空白稳定性，避免因试剂空白吸光度显著上升，影响线性测试和试剂贮存有效期，所述激活剂为硫酸锌和氯化锌中任意一种或两者的混合物，可以增强溶液的离子强度，产生原液反应，从而加速测定反应速率，显著提高所述试剂的反应灵敏度，所述非离子型表面活性剂为曲拉通X-100和吐温TWEEN-20中任意一种或两者的混合物，可以促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊、乳糜等因素对测定结果的影响，进一步保证试剂的使用效果，所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者的混合物，可以防止重金属离子生物酶活力的影响，保证生物酶活性，所述试剂中的所有用量均是通过精确计算和试验分析得到的，可保证在此用量的前提下，所述试剂的效果最佳，并且在此用量下的试剂的成本也最合适，通过采用烷基酚聚氧乙烯醚和月桂醇聚氧乙烯醚等稳定剂解决色源-岩藻糖苷底物水解反应导致试剂空白显著上升的问题；采用GOOD’S生物缓冲体系实现生物酶原料稳定保存和无干扰反应问题，通过添加激活剂提高反应灵敏度。
进一步的，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠和Proclin 300中任意一种或两者混合物。
在本实施方式中，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠和Proclin 300中任意一种或两者混合物，所述防腐剂能够防止细菌在试剂中生长，防止细菌对试剂中原料产生破坏作用，进一步保证试剂的使用效果和保存期限，并且所述防腐剂对所述试剂中各种成分没有及其混合物没有任何副作用。
所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂的原理为：AFU催化MG-CNP-AFU(M-G-2- 氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷)水解生成2-氯-4-硝基酚(CNP)，后者在测试环境下呈现明显黄色，引起405nm处吸光度升高。在405nm波长下监测CNP的生成速率，可计算出样本中AFU的活性。可采用手工测试方法，也可以通过全自动生化分析仪等分析仪器对样本进行检测，具体采用以下测定方法：
Figure RE-GDA0002405425340000041
计算方法为：
Figure RE-GDA0002405425340000042
将试剂37℃放置7天的热稳定性实验以及在2至8℃贮存温度下保存12个月的贮存稳定性实验中，试剂外观、灵敏度和准确度、线性范围的性指标均无明显变化，完全符合临床检测要求。
实施案例1
试剂组分:
Figure RE-GDA0002405425340000043
将各组分依次溶解于纯化水，混合均匀后，用1mmol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH值为4.5～6.0之间，然后用纯化水定容至1L。
实施案例2
试剂组分：
Figure RE-GDA0002405425340000044
Figure RE-GDA0002405425340000051
将各组分依次溶解于纯化水，混合均匀后，用1mmol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH值为4.5～6.0之间，然后用纯化水定容至1L。
实施案例3
试剂组分：
Figure RE-GDA0002405425340000052
将各组分依次溶解于纯化水，混合均匀后，用1mmol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH值为4.5～6.0之间，然后用纯化水定容至1L。
将上述3个实施例的试剂37℃放置7天的热稳定性试验以及在2至8℃贮存温度下保存12个月的贮存稳定性实验中，试剂中的M-G-2-氯-4-硝基苯-α-L- 岩藻糖苷无明显水解现象，试剂外观无明显变化，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的测定α-L-岩藻糖苷酶的线性范围上限可达200U/L。
本发明的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源-岩藻糖苷底物、 0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L 金属络合剂，通过采用烷基酚聚氧乙烯醚和月桂醇聚氧乙烯醚等的所述稳定剂解决色源-岩藻糖苷底物水解反应导致试剂空白显著上升的问题，采用PH值在 4.0～7.0之间的GOOD’S生物缓冲液和所述激活剂提高所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂的稳定性和灵敏度。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂包括80～200mmol/L缓冲液、5～10g/L氯化钠、0.1～1g/L色源-岩藻糖苷底物、0.5～2g/L稳定剂、0.1～2g/L激活剂、0.5～5g/L非离子型表面活性剂和2～5g/L金属络合剂。
2.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述缓冲液为PH值在4.0～7.0之间的GOOD’S生物缓冲液，所述GOOD’S生物缓冲液包括吗啉乙磺酸-盐酸、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸-盐酸和1,4-哌嗪二乙磺酸-盐酸中任意一种或多种混合物。
3.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚和月桂醇聚氧乙烯醚中任意一种或两者混合物。
4.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述激活剂为硫酸锌和氯化锌中任意一种或两者混合物。
5.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为曲拉通X-100和吐温TWEEN-20中任意一种或两者混合物。
6.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者混合物。
7.如权利要求1所述的一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂，其特征在于，所述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠和Proclin 300中任意一种或两者混合物。
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