CN104357544A - 一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外诊断生化试剂领域，特别是涉及一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒。本发明提供一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液、酶保护剂、反应底物、络合物、表面活性剂、防腐剂、激活剂；试剂R2的组分包括：生物缓冲液、反应底物、防腐剂，所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。本发明所提供的检测试剂盒加入酶保护剂后，可以在提高试剂稳定剂的前提下，选用酶保护剂来保护酶还有以下优点、通过加入酶保护剂后，酶在水溶液中能够保持较长时间稳定，且对酶本身的活性无影响。

Description

一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断生化试剂领域，特别是涉及一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒。

背景技术

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆及线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同工酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。

肌酸激酶在临床上的测定指的是总CK活性，主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2-4小时，血液中肌酸激酶的活动即开始增高。相比血清中谷草转氨酶和乳酸脱氢酶的活力变化出现得更早。相比常用的谷草转氨酶和乳酸脱氢酶，有以下优点：肌酸激酶升高迅速，患者疼痛出现后4小时肌酸激酶急剧上升，最高可达正常上限的10-12倍，是目前最敏感的酶试验。因肝中肌酸激酶含量很少，心脏疾病伴有肝郁血或肝损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶活力升高而肌酸激酶无变化，具有较强的特异性。此外，红细胞中此酶活力较低，溶血标本对此酶测定的干扰较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶小，成为临床化学方面常用酶之一。在心肌梗死的病程中，如肌酸激酶活力再次升高，即说明心肌再梗死。但此酶活力持续时间较短，2-4天后即恢复正常水平。故用此酶诊断心肌梗死，因特别注意病程时间。对于发病时间较长的病例，应测定能维持较长时间持续升高的酶活力的乳酸脱氢酶，此时肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死诊断。

肌酸激酶还可用于肌肉疾病的诊断。在Duchenne肌萎缩患者血中，肌酸激酶极度增高，甚至可高出正常上限的50倍，后随病程延长下降。此病是和性染色体有关的遗传病，在无症状的女性，隐性携带者约75％肌酸激酶也高于正常。其他内型的原发性肌萎缩患者肌酸激酶也有不同程度的升高，这可用于区别继发性肌病如神经性或废用性肌萎缩，此时肌酸激酶活力往往正常。此外，肌酸激酶还可用于脑肌病的诊断。高肌酸激酶活力常见于发作性癫痫、破伤风。肌酸激酶增高也见于器质性神经肌病，如脑梗死、脑膜炎和脑炎等。

目前，肌酸激酶目前已有多种定性和定量的检测方法可用。现有检测方法包含电泳法、化学发光法、酶法等。而电泳法存在灵敏度不够，操作时间长，且操作繁琐等缺点，化学发光法虽具有高灵敏性，但其重复性差也阻碍了其大量适用于临床，而酶法具有酶活性高，检测灵敏度高的优点，但也存在酶在缓冲液中易失活的缺点。

本专利的方法学为酶法，其基本原理是肌酸激酶(CK)催化磷酸肌酸转变成肌酸，同时ADP磷酸化成ATP。己糖激酶(HK)催化ATP和葡萄糖反应，生成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)催化葡萄糖-6-磷酸生成磷酸葡萄糖酸，同时使氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD+)转变成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADH)，酶反应速度与样本中肌酸激酶的活力成正比。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液、酶保护剂、反应底物、络合物、表面活性剂、防腐剂、激活剂；试剂R2的组分包括：生物缓冲液、反应底物、防腐剂。

优选地，所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。

优选的，所述试剂R1中的生物缓冲液为添加有5wt％牛血清白蛋白、AEP-HBC、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的缓冲液。

更优选的，所述缓冲液为咪唑醋酸盐缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Good’生物缓冲液中的一种。

优选的，所述试剂R2中的生物缓冲液为咪唑醋酸盐缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Good’生物缓冲液的一种。

更优选的，所述生物缓冲液为咪唑醋酸缓冲液。

上述技术方案中缓冲液的主要作用，使各个组分的性能保持稳定。其中缓冲液的加入量、pH值保持在一个适中的范围，使各组份的酸碱度保持稳定，不会对其他物质的性能产生影响，从而保证试剂盒整体性能的稳定，使测试结果更准确。

优选的，所述表面活性剂为吐温系列、聚乙二醇，属于非离子表面活性剂，易溶于水，具有发泡、稳泡、渗透去污、抗硬水等功能，并且在一定浓度下能完全溶解于不同种类的表面活性剂中，增稠效果明显，能防止水溶液游离氧的作用，在一定程度上提高试剂的稳定性。

优选的，所述R1试剂中反应底物为ADP、D-葡萄糖和NAD+。

所述试剂R2中的反应底物与试剂R1中的反应底物相对应，可以为磷酸肌酸。

优选的，所述R1试剂中还包括催化酶，所用催化酶为己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

优选的，所述R1试剂中激活剂为N-乙酰半胱氨酸或硫代甘油。

更优选的，所述R1试剂中激活剂为N-乙酰半胱氨酸，其激活效应更强。

优选的，所述R1试剂中络合物为金属离子络合物，具体为乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或几种。

更优选的，所述R1试剂中金属离子络合物为乙二胺四乙酸二钠，其原因是乙二胺四乙酸二钠具有广泛的配位性能，几乎能与所有的金属离子形成稳定的螯合物。

优选的，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种。

更优选的，所述防腐剂为叠氮钠，其原因是叠氮钠具有优良的防腐杀菌性能，能较长时间抑制细菌的增生。

优选的，所述R1试剂中还包括Mg+，所述Mg+可以为醋酸镁、氯化镁，硫酸镁等，但由于缓冲液中含有醋酸离子，为避免引入其他离子会影响反应结果，优选醋酸镁。

本领域技术人员可根据所述肌酸激酶检测试剂盒中的各组分，以常规检测试剂盒的制备方法制备本发明的肌酸激酶检测试剂盒。

本发明第二方面提供一种提高肌酸激酶检测试剂盒稳定性的方法，具体为在肌酸激酶检测试剂盒的试剂中添加酶保护剂。

优选的，所述肌酸激酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液、酶保护剂、反应底物、络合物、表面活性剂、防腐剂、激活剂；试剂R2的组分包括：生物缓冲液、反应底物、防腐剂。

与现有技术相比，本发明具如下明显效果：

加入酶保护剂后，可以在提高试剂稳定剂的前提下，选用酶保护剂来保护酶还有以下优点。

1、通过加入酶保护剂后，酶在水溶液中能够保持较长时间稳定，且对酶本身的活性无影响。

2、与其他保护酶的方法相比，可用于保护酶的缓冲液浓度范围广。

3、对临床常用的酶有广泛的保护作用，且保护时间长，从而增加试剂的稳定性。

4、加入酶保护剂对酶本身的活性无影响，能够更加准确的测定酶活性。

5、加入的酶保护剂可能还会对HPR标记的抗原和部分抗体有保护作用。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例

本发明肌酸激酶检测试剂盒的制备：

其中试剂R1的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4，缓冲液中，其他各组分的含量为：NAD+2mmol/L、ADP 2mmol/L、D-葡萄糖20mmol/L、乙二胺四乙酸二钠2mmol/L、聚乙二醇2g/L、叠氮钠1g/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L；5wt％牛血清白蛋白浓度3g/L，AEP-HBC5g/L，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠3g/L；

试剂R2的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4，缓冲液中，其他各组分的含量为：磷酸肌酸30mmol/L、叠氮钠1g/L。

对比例1肌酸激酶检测试剂盒的制备：

其中试剂R1的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4、缓冲液中，其他各组分的含量为：NAD+2mmol/L、ADP 2mmol/L、D-葡萄糖20mmol/L、乙二胺四乙酸二钠2mmol/L、聚乙二醇2g/L、叠氮钠1g/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L；5wt％牛血清白蛋白浓度11g/L；

试剂R2的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4，缓冲液中，其他各组分的含量为：磷酸肌酸30mmol/L、叠氮钠1g/L。

对比例2肌酸激酶检测试剂盒的制备：

其中试剂R1的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4、缓冲液中，其他各组分的含量为：NAD+2mmol/L、ADP 2mmol/L、D-葡萄糖20mmol/L、乙二胺四乙酸二钠2mmol/L、聚乙二醇2g/L、叠氮钠1g/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L；脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠11g/L；

试剂R2的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4，缓冲液中，其他各组分的含量为：磷酸肌酸30mmol/L、叠氮钠1g/L。

对比例3肌酸激酶检测试剂盒的制备：

其中试剂R1的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4、缓冲液中，其他各组分的含量为：NAD+2mmol/L、ADP 2mmol/L、D-葡萄糖20mmol/L、乙二胺四乙酸二钠2mmol/L、聚乙二醇2g/L、叠氮钠1g/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L；AEP-HBC 11g/L；

试剂R2的组分为：50mM咪唑醋酸缓冲液pH7.4，缓冲液中，其他各组分的含量为：磷酸肌酸30mmol/L、叠氮钠1g/L。

将本发明肌酸激酶检测试剂盒与对比例进行肌酸激酶的活性对比实验，发现加入酶保护剂后，可以在提高试剂稳定剂，选用酶保护剂来保护酶可以使酶在水溶液中能够保持较长时间稳定，且对酶本身的活性无影响。具体结果如表1所示：

表1

	2-8℃CK活性	18-22℃活性损失
			本发明	72h以上	每小时3％
对比例1	24h	每小时10％
			对比例3	24h	每小时10％
对比例3	24h	每小时10％

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液、反应底物、络合物、表面活性剂、防腐剂、激活剂；试剂R2的组分包括：生物缓冲液、反应底物、防腐剂，所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。 

2.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的生物缓冲液为添加有5wt％牛血清白蛋白、AEP-HBC、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的缓冲液。 

3.如权利要求2所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为咪唑醋酸盐缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Good’生物缓冲液中的一种。 

4.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温系列、聚乙二醇，属于非离子表面活性剂。 

5.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中反应底物为ADP、D-葡萄糖和NAD+。 

6.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中还包括催化酶，所用催化酶为己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。 

7.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中激活剂为N-乙酰半胱氨酸或硫代甘油，所述R1试剂中络合物为金属离子络合物，具体为乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或几种。 

8.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种，所述R1试剂中还包括Mg+，所述Mg+可以为醋酸镁、氯化镁，硫酸镁。 

9.一种提高肌酸激酶检测试剂盒稳定性的方法，具体为在肌酸激酶检测试剂盒的试剂中添加酶保护剂。 

10.如权利要求9所述的一种提高肌酸激酶检测试剂盒稳定性的方法，其特征在于，所述肌酸激酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液、酶保护剂、反应底物、络合物、表面活性剂、防腐剂、激活剂；试剂R2的组分包括：生物缓冲液、反应底物、防腐剂，所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。