CN108254560A - 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents

牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108254560A
CN108254560A CN201810352778.7A CN201810352778A CN108254560A CN 108254560 A CN108254560 A CN 108254560A CN 201810352778 A CN201810352778 A CN 201810352778A CN 108254560 A CN108254560 A CN 108254560A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
aflatoxins
labelled antibody
milk
lock solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810352778.7A
Other languages
English (en)
Inventor
骆鹏杰
李敬光
赵云峰
陈霞
蒋双勤
王华丽
刘卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Food Safety Risk Assessment Center
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Food Safety Risk Assessment Center
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Food Safety Risk Assessment Center, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention filed Critical National Food Safety Risk Assessment Center
Priority to CN201810352778.7A priority Critical patent/CN108254560A/zh
Publication of CN108254560A publication Critical patent/CN108254560A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1的高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括封闭溶液、酶标抗体浓缩液、酶标物稀释液、包被有包被抗原的酶标板和底物显色液；所述封闭溶液包括：胎牛血清、脱脂奶粉、蛋白稳定剂，其中，每1000mL所述封闭溶液含有所述胎牛血清32.0～48.0mL、所述脱脂奶粉7.2～10.8g、所述蛋白稳定剂2.4～3.6g；所述酶标抗体浓缩液包括酶标抗体，所述酶标抗体浓缩液还包括胎牛血清和Proclin300，其中，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述胎牛血清50～100mL、所述Proclin300 100～400μL。

Description

牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及食品中真菌毒素检查技术领域，特别是涉及一种牛奶中黄曲霉毒素M1的高通量酶联免疫试剂盒及牛奶中黄曲霉毒素M1的检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素M是一组结构相关的毒性化合物，牛奶中的黄曲霉毒素主要有M1和M2两种。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，其危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。
检测黄曲霉素素M1目前主要有以下三种方法：
一、生物学检测法。包括种子发芽试验、呕吐试验等，不利于快速检测，已很少采用。
二、理化检测法。包括薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC法虽然简便，但是灵敏度差；HPLC法虽然灵敏度高，但是样品处理烦琐、操作复杂、仪器昂贵，并且标准品耗用较大，检测成本高。
三、免疫化学检测法。如酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)方法和胶体金免疫层析方法。ELISA法特别适宜大批样品集中检测，胶体金免疫层析方法适合现场单个或少数样品即时检测。
酶联免疫吸附剂测定是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，形成固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗体或抗原按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。通过加入与酶可发生化学反应的物质，酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来判断所检物质的含量，然而目前存在的最大的问题是酶联免疫吸附剂测定原理所制作的试剂盒不易长期保存，产品稳定性差，并且应用于黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附测定中的非特异性吸附仍较高、稳定性差。
发明内容
基于此，有必要针对传统的试剂盒不易长期保存，并且应用于黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附剂测定中的非特异性吸附仍较高的问题，提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法。
本发明提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1的高通量酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括封闭溶液、酶标抗体浓缩液、酶标物稀释液、包被有包被抗原的酶标板和底物显色液，所述封闭溶液包括：胎牛血清、脱脂奶粉、蛋白稳定剂，其中，每1000mL所述封闭溶液含有所述胎牛血清32.0～48.0mL、所述脱脂奶粉7.2～10.8g、所述蛋白稳定剂2.4～3.6g。
所述酶标抗体浓缩液包括酶标抗体，所述酶标抗体浓缩液还包括胎牛血清和Proclin300，其中，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述胎牛血清50～100mL、所述Proclin300 100～400μL。
在其中一个实施例中，所述封闭溶液中的蛋白稳定剂为AEP-HBC。
在其中一个实施例中，每1000mL所述封闭溶液还含有：
蔗糖 12.0～18.0g；
Proclin300 240～360μL。
在其中一个实施例中，所述封闭溶液还含有第一磷酸缓冲液，所述酶标抗体浓缩液还包括第二磷酸缓冲液，所述第一磷酸缓冲液和所述第二磷酸缓冲液分别包括Na2HPO4和NaH2PO4；每1000mL所述封闭溶液包含Na2HPO4·12H2O4.64～6.96g，NaH2PO4·2H2O 0.48～0.72g；每1000mL所述酶标抗体浓缩液包含Na2HPO4·12H2O 2～3g、NaH2PO4·2H2O 0.2～0.8g。
在其中一个实施例中，所述封闭溶液和所述酶标抗体浓缩液还分别包括甘油，每1000mL所述封闭溶液含有所述甘油8.0～12.0mL，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述甘油4～10mL。
在其中一个实施例中，所述封闭溶液pH值为7.4。
在其中一个实施例中，所述酶标物稀释液包括牛血清蛋白、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl和Proclin300，其中，每1000mL酶标物稀释液含有所述牛血清白蛋白3.0～6.0g、Na2HPO4·12H2O 30～50g、KH2PO4 12～16g、NaCl 3～6g、Proclin300 200～400μL。
本发明还提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1的检测方法，包括以下步骤：
S10、对待测牛奶进行样品前处理得到待测样品；
S12、用所述封闭液对包被有包被抗原的所述酶标板进行封闭处理，随后在所述酶标板中加入用所述酶标物稀释液稀释过的所述酶标抗体浓缩液和所述步骤S10的所述待测样品；
S14、用所述底物显色液对所述酶标板进行显色反应；
S16、对所述显色反应的结果进行分析。
在其中一个实施例中，所述步骤S10样品前处理还包括以下步骤：
S101、将所述待测牛奶放置于离心管中；
S102、将所述离心管放置于水浴锅中充分平衡；
S103、将平衡后的所述离心管静置并除去所述离心管中的油脂层；
S104、将所述离心管下层的液体充分摇匀得到所述待测样品。
在其中一个实施例中，所述步骤S102中对于所述离心管充分平衡的时间至少1h，所述水浴锅的温度为室温。
本发明提供的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括封闭溶液、酶标抗体浓缩液、酶标物稀释液和底物显色液，封闭溶液中加入蛋白稳定剂维护包被抗原和抗体的稳定性，不易让封闭溶液中的蛋白质变性，能够更好封闭固相载体上的空隙，同时酶标抗体浓缩液中加入胎牛血清和Proclin300，两者相互配合充分保持抗体和包被抗原的活性以及稳定性，以及提高牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒的特异性，提高利用牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒的准确性。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括封闭溶液、酶标抗体浓缩液、酶标物稀释液、包被有包被抗原的酶标板和底物显色液。所述封闭溶液包括：胎牛血清、脱脂奶粉、蛋白稳定剂，其中，每1000mL所述封闭溶液含有所述胎牛血清32.0～48.0mL、所述脱脂奶粉7.2～10.8g、所述蛋白稳定剂2.4～3.6g。所述酶标抗体浓缩液包括酶标抗体，所述酶标抗体浓缩液还包括胎牛血清、甘油、第二磷酸缓冲液、Proclin300、氯化钾和氯化钠，其中，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述胎牛血清50～100mL、所述甘油4～10mL以及第二磷酸缓冲液、Proclin300，所述第二缓冲溶液包括Na2HPO4·12H2O 2～3g、NaH2PO4·2H2O 0.2～0.8g。
本发明实施例通过在封闭溶液中加入蛋白稳定剂，优选的，所述蛋白稳定剂为AEP-HBC，针对本包被抗原效果更加明显。在所述酶标抗体浓缩液中加入Proclin300，维护包被抗原和抗体的稳定性，同时不易让封闭溶液中的蛋白质变性，充分保持抗体和包被抗原的活性以及稳定性，能够更好的封闭固相载体上的空隙，提高利用牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒的准确性和特异性。
其中，胎牛血清与脱脂奶粉组成的蛋白质分子量分布更广，能够更好封闭固相载体上大小不一的空隙，并且蛋白稳定剂能够使胎牛血清与脱脂奶粉中的蛋白质与固相载体的吸附更加牢固，避免在后续操作中脱落，以进一步提高免疫吸附剂的特异性，提高利用酶联免疫吸附法测定真菌毒素的准确性。
作为一种可选实施方式，每1000mL封闭溶液还含有：
蔗糖 12.0～18.0g；
Proclin300 240～360μL。
上述封闭溶液中，含有适量的蛋白稳定剂AEP-HBC，既能够起到保护、稳定封闭溶液中蛋白质的作用，又能够避免过量的添加蛋白稳定剂影响封闭溶液的封闭效果。
可选地，封闭溶液pH值为7.4。
可选地，封闭溶液包括第一磷酸缓冲液，每1000mL封闭溶液包含Na2HPO4·12H2O4.64～6.96g，NaH2PO4·2H2O 0.48～0.72g。
可选地，封闭溶液还包括甘油，每1000mL封闭溶液还含有甘油8.0～12.0mL。封闭溶液中的甘油能够进一步增加封闭溶液的稳定性，进一步提高试剂盒的特异性。
蛋白稳定剂AEP-HBC具有抗沉淀、增溶、促效的作用，并能够与甘油具有协同作用，共同使脱脂奶粉在封闭溶液中更稳定，延长封闭溶液的储存期限，并能够使胎牛血清和脱脂奶粉中的蛋白质与固相载体的吸附更加牢固，避免在后续操作中脱落，并起到保护包被抗原的作用，以进一步提高免疫吸附剂的特异性。
所述酶标抗体浓缩液包括酶标抗体，所述酶标抗体包括黄曲霉毒素M1人工抗原与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原得到的抗体，将所述的抗体与酶分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。所述酶分子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
进一步优选地，所述酶标抗体浓缩液的组成为：
进一步优选地，所述酶标抗体浓缩液的组成为：
所述牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒还包括酶标物稀释液，优选地，所述酶标物稀释液的组成为：
进一步优选地，所述酶标物稀释液的组成为：
所述牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒还包括底物显色液，所述底物显色液包括底物显色液A和底物显色液B，使用时将底物显色液A和底物显色液B按照1：1体积比例混合。
可选地，所述底物显色液A(下文简称A液)的组成为：
过氧化脲 0.21g
醋酸钠 27.20g
去离子水 定容至1L。
可选地，所述底物显色液B(下文简称B)的组成为：
所述牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒还包括终止液，优选地，所述终止液的组成为：
浓硫酸 53mL
去离子水 定容至1L。
所述牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒还包括浓缩洗涤液，优选地，所述浓缩洗涤液的组成为：
所述封闭溶液的制备方法，包括以下步骤：
将配方量的Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O加入适量水中溶解，制得第一缓冲溶液；按照配方量的蔗糖、脱脂奶粉、第一缓冲溶液、蛋白稳定剂加入适量水中溶解，制得第一溶液；
具体的，先将蔗糖、脱脂奶粉、第一缓冲溶液、蛋白稳定剂加入适量水中溶解，能够先形成缓冲的pH溶液条件，再加入胎牛血清避免胎牛血清成分被破坏，进一步地，最后加入的Proclin300具有防腐作用，能够提高封闭溶液的抗腐性能。
作为一种可选实施方式，在将配方量的胎牛血清以及Proclin300加入所述第一溶液之前，还包括以下步骤：
将配方量的甘油加入所述第一溶液中。
可选地，将配方量的甘油加入所述第一溶液中后，搅拌10～14h后再将配方量的胎牛血清以及Proclin300加入所述第一溶液中。
通过加入配方量的甘油并使甘油与第一溶液经过较长时间的搅拌混合均匀，以使甘油能够与脱脂奶粉等成分充分接触，例如嵌入蛋白质的某些空间中，保护蛋白质，增加其亲水性，使其在封闭溶液中更稳定。
所述酶标抗体浓缩溶液的制备方法，包括以下步骤：
制备所述酶标抗体，所述酶标抗体包括黄曲霉毒素M1人工抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的抗体；优选的，所述载体蛋白为天然蛋白质、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、纯化的重组蛋白、人工合成多肽、兔血清白蛋白(RSA)、多价抗原肽(MAP，主要指多聚Lys)中的一种，或者是其他人工蛋白。
将配方量的酶标抗体、胎牛血清和Proclin300加入适量的水中溶解，制得第二溶液，即所述酶标抗体浓缩溶液，Proclin300具有防腐作用，能够提高酶标抗体浓缩液抗腐性能。
优选的，将配方量的Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O加入适量水中溶解，制得第二磷酸缓冲溶液；按照配方量的所述酶标抗体、所述胎牛血清和第二缓冲溶液加入适量水中溶解，制得第二溶液，即酶标抗体浓缩溶液。
进一步优选的，先将第二缓冲溶液加入适量水中溶解，能够先形成缓冲的pH溶液条件，再加入所述酶标抗体和胎牛血清，避免酶标抗体和胎牛血清成分被破坏，最后加入Proclin300。
作为一种可选实施方式，在将配方量的胎牛血清以及Proclin300加入所述第二溶液之前，还包括以下步骤：
将配方量的甘油、NaCl和KCl加入所述第二溶液中。
可选地，将配方量的甘油加入所述第二溶液中后，搅拌10～14h后再将配方量的胎牛血清以及Proclin300加入所述第二溶液中。
本发明实施例还提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1的检测方法，包括以下步骤：
S10、对待测牛奶样品进行前处理；
S12、用所述封闭液对包被有包被抗原的所述酶标板进行封闭处理，随后加入加入用所述酶标物稀释液稀释过的所述酶标抗体浓缩液；
S14、用所述底物显色液对所述酶标板进行显色反应；
S16、对显色反应的结果进行分析。
优选地，在步骤S10中，还包括：
S101、将待测奶放置于离心管中；
S102、将所述离心管放置于处于室温的水浴锅中充分平衡；
S103、将平衡后的离心管静置并除去离心管中的油脂层；
S104、将所述离心管下层的液体充分摇匀得到待测样品。
进一步优选的，所述步骤S102还包括室温充分平衡的时间至少1h。
作为一种可选实施方式，在步骤S12中还包括以下步骤：
对封闭处理的所述酶标板温箱孵育1h，弃所述封闭液。
作为一种可选实施方式，对于步骤S14进行显色反应后，加入所述终止液终止反应。
实施例1
1.1、封闭液的制备
分别称取蔗糖15.0g、脱脂奶粉9.0g、Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaH2PO4·2H2O0.6g、蛋白稳定剂AEP-HBC 3.0g置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入甘油10mL和450mL纯水继续用磁力搅拌器搅拌12h，再加入胎牛血清40mL和Proclin300 300μL，定容至1L用磁力搅拌器搅拌30min，制得封闭溶液。
1.2、黄曲霉毒素M1人工抗原偶联物的制备
分别称取20mg黄曲霉毒素M1和10mg马来酸酐置于锥形瓶中，加入20mL吡啶，70℃加热回流反应6h。采用旋转蒸发仪蒸干混合液中的吡啶，经乙酸乙酯萃取和无水硫酸钠除水后，真空干燥12h即可得到黄曲霉毒素M1半抗原粗提物，用1000mL的N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛溶解后，备用。吸取500μL N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛溶解的混合液，加入2mg二环己基碳二亚胺和200μL二环己基碳二亚胺溶解的1mg N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌8h，设定此为反应液A液；将7mg BSA溶于4mL的0.01M的PBS(pH 7.2)中，作为反应液B液，将A液缓慢滴加到B液中，4℃搅拌反应过夜。反应物在4℃条件下用PBS搅拌透析3天，每天换液3次。
1.3、黄曲霉毒素B1人工抗原偶联物的制备
20mg的黄曲霉毒素B1(AFB1)与30mg的羧甲基羟氨半盐酸盐溶于2.0mL的吡啶中，室温避光反应24h。将反应物冷冻干燥，所得残渣用10mL纯水溶解后，用0.2M盐酸调节pH至3.0，再用乙酸乙酯抽提沉淀物，真空干燥后得到AFB1肟。取10mg AFB1肟粉末溶于1mL KOH吡啶溶液中，放于10mL棕色瓶中，加入6.5mg的EDC在70～80℃磁力搅拌器下反应12h；1mL的pH5的缓冲溶液和40mg EDC加入反应物中，10min后加入40mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应混合物室温搅拌反应2h；40mg OVA溶于2mL蒸馏水中，然后加入反应混合物，于暗处室温搅拌反应24h。最后在0.01M的PBS缓冲液中透析3天，每隔4～5h换一次液。
1.4、黄曲霉毒素M1抗体的制备
将1.2制备的黄曲霉素M1人工抗原偶联物，用蒸馏水溶解(遵循实验室基本操作流程)，免疫8只6-8周龄白变种实验室小鼠(BALB/C)，免疫结束后采血，对血清进行效价测定，获取BALB/c小鼠的脾细胞。
将骨髓瘤细胞和获取的BALB/c小鼠脾细胞，用聚乙二醇将两种细胞融合并进行筛选培养。优选地，选用聚乙二醇6000，分离的更加完全。选出其中的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，采用动物体内诱生法，取健康Balb/c雌性小鼠，注射灭菌石蜡油每只注射0.5mL，7～15天后备用。将细胞瓶中培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心10min收集细胞，弃上清液。用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，将细胞数调至1～2×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。
1.5、单克隆抗体的纯化(辛酸-饱和硫酸铵法)
取腹水5mL，加入0.06M的pH为4.0的NaAc-HAc缓冲液10mL，搅拌均匀，用1M的NaOH调pH至4.5。在室温下边搅拌边加入165μL辛酸，搅拌30min。将腹水在4℃环境下，转速为6000rpm离心30min，弃沉淀，用1mol/L NaOH调pH至7.2。向上清液中边搅拌边加入15mL饱和硫酸铵溶液，此操作在4℃条件下完成。此时硫酸铵终浓度为50％，搅拌30min后，在4℃环境下，转速为6000rpm离心30min，弃上清液，将沉淀溶于5.5mL 0.01mol/L pH为7.2的PBS中。向沉淀悬浮液中边搅拌边加入4.5mL饱和硫酸铵溶液，此操作在4℃条件下完成。此时硫酸铵终浓度为45％，搅拌30min后，再次在4℃环境下，转速为6000rpm离心30min，弃上清液，将沉淀溶于1mL 0.01mol/L pH7.2的PBS中。将沉淀悬浮液装入透析袋中，用0.01M pH7.2PBS透析，4～6h换液一次，换液2～3次，得到黄曲霉毒素M1的抗体，将所述的抗体与辣根过氧化物酶酶分子进行共价结合反应，得到酶标抗体。
1.6、黄曲霉毒素M1包被抗原的制备
黄曲霉毒素M1包被抗原选择1.3所制备的黄曲霉毒素B1人工抗原偶联物作为包被抗原，与本发明实施例试剂盒中制备的所述酶标抗体浓缩液所采用的半抗原和载体蛋白不同，其目的是为了减少非特异性反应，提高灵敏度，另外在后期试剂盒研制过程中有助于提高试剂盒的稳定性和特异性。
1.7、液态奶样品前处理
取10mL液态奶样品于离心管中；充分平衡至室温(25±2℃)，至少平衡1h；静置后有脂层析出，加样前充分摇匀，检测时取70μL进行检测。
1.8、具体的检测步骤如下
1.8.1、在酶标板上包被步骤1.6制备的黄曲霉毒素M1包被抗原，随后在酶标板中加入150μL/孔的封闭液，37℃封闭2h，拍干插入酶标板架上，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中，并记录下各标准品和样品的位置，均做平行实验。
1.8.2、将70μL各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；
1.8.3、将酶标抗体浓缩液与酶标稀释液按照1：1的比例稀释后，得到酶标抗体工作液；
1.8.4、在每个板孔中加入30μL酶标抗体工作液；
1.8.5、盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2℃)，避光反应10min；
1.8.6、揭开盖板膜；
1.8.7、倒掉酶标板孔中液体，在每孔加入260μL洗涤工作液，浸泡10s；
1.8.8、再重复上一步骤3次；
1.8.9、倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
1.8.10、立即在每孔中加入100μL A、B混合液(注意：底物A液、底物B液按体1：1混合，必须充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂)；
1.8.11、盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2℃)，避光反应10～15min；
1.8.12、揭开盖板膜，在各板孔中加入50μL终止液轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；
1.8.13、用酶标仪在双波长450nm、630nm下检测吸光度，结果在终止后5min内读取。
试剂盒灵敏度、准确性、精密度和稳定性试验
试剂盒灵敏度包括方法灵敏度及方法的检测限。取空白样本20批次检测，按公式计算方法对样本的最低检测限值。公式中SD为标准偏差、MN为平均值。LOD＝MN+3SD。
配置不同浓度的标准品绘制标准曲线，去R2>0.99曲线段安排合理的浓度作标准曲线。确定0ng/mL-1.62ng/mL绘制标准曲线，确定该试剂盒的线性范围为0.02ng/mL-1.62ng/mL。
试剂盒的准确性和精密性通过样本添加回收试验来评定，样本的添加回收率及其变异系数分别代表了试剂盒的准确性与精密性。取空白牛奶7个批次，每个批次做3个平行，每个样本的每个批次黄曲霉毒素M1的添加浓度为0.05μg·kg-1、0.5μg·kg-1，经检测计算样本加标回收率、批内变异系数及批间变异系数以评价试剂盒的准确性和精密性。
表1不同添加浓度各批次的样本回收率
结果如表1所示，样品加标回收率为80.3％～101.2％；各样本的批内变异系数和批间变异系数均小15％。该试剂盒的准确性和精密性符合要求。
试剂盒稳定性试验
考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将上述试剂盒在37℃、4℃、-20℃分别保存7天、14天、280天，测定的结果表明试剂盒各项指标完全正常。从结果可以看出试剂盒可以在2℃～8℃至少可以保存12个月以上。
试剂盒特异性试验
黄曲霉毒素M1酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的，结果如下：
黄曲霉毒素M1……………….…100.0％
黄曲霉毒素M2…………………..<1.0％
试剂盒参数如下
试剂盒吸光度板内误差小于5％，板间误差小于10％。
样品最低检测限：
液态奶…………………………约0.05ppb
实施例2
封闭液的制备如下，其他制备方法与实施例1相同。
分别称取蔗糖12.0g、脱脂奶粉7.2g、Na2HPO4·12H2O 4.64g、NaH2PO4·2H2O0.48g、蛋白稳定剂AEP-HBC 2.4g置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入甘油8mL和450mL纯水继续用磁力搅拌器搅拌12h，再加入胎牛血清32mL和Proclin300 240μL，定容至1L用磁力搅拌器搅拌30min，制得封闭溶液。
实施例3
封闭液的制备如下，其他制备方法与实施例1相同。
分别称取蔗糖18.0g、脱脂奶粉10.8g、Na2HPO4·12H2O 6.96g、NaH2PO4·2H2O0.72g、蛋白稳定剂AEP-HBC 3.6g置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入甘油12mL和450mL纯水继续用磁力搅拌器搅拌12h，再加入胎牛血清48mL和Proclin300 360μL，定容至1L用磁力搅拌器搅拌30min，制得封闭溶液。
对比例1
封闭液的制备如下，其他制备方法与实施例1相同。
分别称取酪蛋白10.0g、NaH2PO4·2H2O 0.6g、置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入Proclin300 300μL并用纯水定容至1L，用磁力搅拌器室温下搅拌30min，制得封闭溶液。
对比例2
封闭液的制备如下，其他制备方法与实施例1相同。
分别称取脱脂奶粉15.0g、NaH2PO4·2H2O 0.6g、置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入Proclin300 300μL并用纯水定容至1L，用磁力搅拌器室温下搅拌30min，制得封闭溶液。
对比例3
封闭液的制备如下，其他制备方法与实施例1相同。
分别称取蔗糖15.0g、脱脂奶粉9.0g、Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaH2PO4·2H2O0.6g置于1L玻璃容器中，加入500mL纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入胎牛血清40mL、Proclin300 300μL并用纯水定容至1L，用磁力搅拌器室温下搅拌30min，制得封闭溶液。
在真菌毒素ELISA试验过程中的封闭步骤中，酶标板中加入150μL/孔的封闭液，37℃封闭2h，拍干备用。酶标板中加入150μL/孔的磷酸盐缓冲溶液，37℃封闭2h，拍干作为空白对照酶标板备用。
用实施例1至3以及对照例1至3的封闭液封闭酶标板并按照上述方法测定同一样品中的黄曲霉毒素M1以及上述空白对照酶标板按照ELISA试验步骤测定样品中的黄曲霉毒素M1，测定结果请参阅表2。测定样品及空白对照品的450nm的吸光度(OD/450nm)，测定结果请参阅表2所示。
表2实施例及对照例测定结果
从表2可以看出，实施例1至3制备的封闭液封闭的酶标板相对于对照例1至3制备的封闭液封闭的酶标板的OD测定值明显提高，并且反应酶标板特异性反应的参数P/N也明显提高。说明本发明的封闭溶液能够有效降低真菌毒素酶联免疫吸附剂测定中的非特异性吸附，提高测定的准确性。
进一步地，本发明实施例还将实施例1至3制备的封闭溶液储存3个月、6个月、9个月后进行真菌毒素的酶联免疫吸附测定，测定结果依然与表2所示结果接近，说明本发明的封闭溶液稳定性高，保质期限较长。
更进一步地，实施例1至实施例3制备的封闭溶液封闭酶标板，经过37度烤评试验，OD值不变，进一步证明了包被的抗原不易发生变性降解，添加蛋白保护剂AEP-HBC的封闭溶液能够保护封闭溶液中的蛋白和酶以及酶标板上的抗原，使封闭溶液抗沉淀、增溶、促效，稳定封闭溶液体系，从而使封闭后防止非特异性结合的效果更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种牛奶中黄曲霉毒素M1的高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括封闭溶液、酶标抗体浓缩液、酶标物稀释液、包被有抗原的酶标板和底物显色液；
所述封闭溶液包括：胎牛血清、脱脂奶粉、蛋白稳定剂，其中，每1000mL所述封闭溶液含有所述胎牛血清32.0～48.0mL、所述脱脂奶粉7.2～10.8g、所述蛋白稳定剂2.4～3.6g；
所述酶标抗体浓缩液包括酶标抗体、胎牛血清和Proclin300，其中，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述胎牛血清50～100mL、所述Proclin300100～400μL。
2.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭溶液中的蛋白稳定剂为AEP-HBC。
3.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，每1000mL所述封闭溶液还含有：
蔗糖 12.0～18.0g；
Proclin300 240～360μL。
4.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭溶液还含有第一磷酸缓冲液，所述酶标抗体浓缩液还包括第二磷酸缓冲液，所述第一磷酸缓冲液和所述第二磷酸缓冲液分别包括Na2HPO4和NaH2PO4；每1000mL所述封闭溶液包含Na2HPO4·12H2O 4.64～6.96g，NaH2PO4·2H2O 0.48～0.72g；每1000mL所述酶标抗体浓缩液包含Na2HPO4·12H2O 2～3g、NaH2PO4·2H2O 0.2～0.8g。
5.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭溶液和所述酶标抗体浓缩液还分别包括甘油，每1000mL所述封闭溶液含有所述甘油8.0～12.0mL，每1000mL所述酶标抗体浓缩液含有所述甘油4～10mL。
6.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭溶液pH值为7.4。
7.根据权利要求1所述的牛奶中黄曲霉毒素M1高通量酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标物稀释液包括牛血清蛋白、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl和Proclin300，其中，每1000mL酶标物稀释液含有所述牛血清白蛋白3.0～6.0g、Na2HPO4·12H2O 30～50g、KH2PO412～16g、NaCl 3～6g、Proclin300200～400μL。
8.一种使用根据权利要求1～7任一项所述的试剂盒对牛奶中黄曲霉毒素M1的检测方法，包括以下步骤：
S10、对待测牛奶进行样品前处理得到待测样品；
S12、用所述封闭液对包被有包被抗原的所述酶标板进行封闭处理，随后在所述酶标板中加入用所述酶标物稀释液稀释过的所述酶标抗体浓缩液和所述步骤S10的所述待测样品；
S14、用所述底物显色液对所述酶标板进行显色反应；
S16、对所述显色反应的结果进行分析。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S10样品前处理还包括以下步骤：
S101、将所述待测牛奶放置于离心管中；
S102、将所述离心管放置于水浴锅中充分平衡；
S103、将平衡后的所述离心管静置并除去所述离心管中的油脂层；
S104、将所述离心管下层的液体充分摇匀得到所述待测样品。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S102中对于所述离心管充分平衡的时间至少1h，所述水浴锅的温度为室温。
CN201810352778.7A 2018-04-19 2018-04-19 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法 Pending CN108254560A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810352778.7A CN108254560A (zh) 2018-04-19 2018-04-19 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810352778.7A CN108254560A (zh) 2018-04-19 2018-04-19 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108254560A true CN108254560A (zh) 2018-07-06

Family

ID=62748145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810352778.7A Pending CN108254560A (zh) 2018-04-19 2018-04-19 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108254560A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113567661A (zh) * 2021-07-05 2021-10-29 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种酶标抗体保护液
CN114088626A (zh) * 2021-11-16 2022-02-25 国家食品安全风险评估中心 一种鉴定巴氏杀菌乳的方法及检测系统

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931385A (en) * 1985-06-24 1990-06-05 Hygeia Sciences, Incorporated Enzyme immunoassays and immunologic reagents
CN1547028A (zh) * 2003-12-02 2004-11-17 湖北省预防医学科学院 用竟争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法
WO2005062050A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa)
CN101226194A (zh) * 2008-01-18 2008-07-23 华南农业大学 孔雀石绿残留的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法
CN101839918A (zh) * 2009-11-11 2010-09-22 北京望尔康泰生物技术有限公司 一种检测螺旋霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN102662051A (zh) * 2012-04-19 2012-09-12 上海蓝怡科技有限公司 酶联免疫体外诊断试剂中封闭液
CN102955031A (zh) * 2011-08-31 2013-03-06 北京勤邦生物技术有限公司 检测黄曲霉毒素b1药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN103168237A (zh) * 2010-10-27 2013-06-19 结合点集团有限公司 包被的珠
CN104357544A (zh) * 2014-12-05 2015-02-18 重庆中元生物技术有限公司 一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒
CN104569381A (zh) * 2015-01-23 2015-04-29 天津伯克生物科技有限公司 一种用于检测黄曲霉毒素m1的方法及酶联免疫试剂盒
CN105566494A (zh) * 2016-01-26 2016-05-11 华中农业大学 用于检测黄曲霉毒素m1的单克隆抗体及酶联免疫方法
CN105606826A (zh) * 2016-02-05 2016-05-25 中国农业大学 一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931385A (en) * 1985-06-24 1990-06-05 Hygeia Sciences, Incorporated Enzyme immunoassays and immunologic reagents
CN1547028A (zh) * 2003-12-02 2004-11-17 湖北省预防医学科学院 用竟争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法
WO2005062050A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa)
CN101226194A (zh) * 2008-01-18 2008-07-23 华南农业大学 孔雀石绿残留的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法
CN101839918A (zh) * 2009-11-11 2010-09-22 北京望尔康泰生物技术有限公司 一种检测螺旋霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN103168237A (zh) * 2010-10-27 2013-06-19 结合点集团有限公司 包被的珠
CN102955031A (zh) * 2011-08-31 2013-03-06 北京勤邦生物技术有限公司 检测黄曲霉毒素b1药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102662051A (zh) * 2012-04-19 2012-09-12 上海蓝怡科技有限公司 酶联免疫体外诊断试剂中封闭液
CN104357544A (zh) * 2014-12-05 2015-02-18 重庆中元生物技术有限公司 一种高稳定性的肌酸激酶检测试剂盒
CN104569381A (zh) * 2015-01-23 2015-04-29 天津伯克生物科技有限公司 一种用于检测黄曲霉毒素m1的方法及酶联免疫试剂盒
CN105566494A (zh) * 2016-01-26 2016-05-11 华中农业大学 用于检测黄曲霉毒素m1的单克隆抗体及酶联免疫方法
CN105606826A (zh) * 2016-02-05 2016-05-25 中国农业大学 一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴晓萍等: "《食品安全检验技术》", 30 September 2012 *
裴世春等: "基于HRP标记抗体的黄曲霉毒素M1的直接竞争-ELISA快速检测方法", 《食品科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113567661A (zh) * 2021-07-05 2021-10-29 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种酶标抗体保护液
CN113567661B (zh) * 2021-07-05 2024-04-16 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种酶标抗体保护液
CN114088626A (zh) * 2021-11-16 2022-02-25 国家食品安全风险评估中心 一种鉴定巴氏杀菌乳的方法及检测系统
CN114088626B (zh) * 2021-11-16 2022-08-26 国家食品安全风险评估中心 一种鉴定巴氏杀菌乳的方法及检测系统

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2007257105B2 (en) Elisa kit for detecting Sudan red and method thereof
CN101413955B (zh) 一种检测玉米赤霉烯酮的elisa测试盒及制备及检测方法
CN101413943B (zh) 一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN101788560B (zh) 检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN101261271B (zh) 苏丹红i免疫层析试纸检测方法
CN106324240B (zh) 检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒及其应用
CN108254560A (zh) 牛奶中黄曲霉毒素m1高通量酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN107589249A (zh) 用于通过免疫复合物转移法检测被检物质的抗体试剂及其制造方法、以及该抗体试剂的用途
CN103575887B (zh) 一种检测黄曲霉毒素b1的试纸卡及其应用
CN105277708A (zh) 检测辣椒中黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒
CN100533148C (zh) 一种检测泰乐菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN111205219B (zh) 百草枯半抗原、完全抗原、纳米抗体、检测试纸、试剂盒及制备方法、用途
CN102539790A (zh) 一种生物素的酶联免疫检测试剂盒
CN103288661A (zh) 一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用
KR900002840B1 (ko) 안정화된 효소 결합체 조성물
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN103102319A (zh) 三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用
CN102608317B (zh) 检测沙丁胺醇的试剂盒或试纸条
CN111289753B (zh) 一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
CN101424685A (zh) 一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒及方法
CN111443202B (zh) 一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
CN100487457C (zh) 一种检测常山酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN101692091A (zh) 一种检测双烯雌酚的金标免疫层析半定量检测试纸
CN106872708B (zh) 铅离子环境污染中直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用
CN111273041A (zh) 一种检测鬼笔环肽的酶联免疫试剂盒及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180706