CN103575887B

CN103575887B - 一种检测黄曲霉毒素b1的试纸卡及其应用

Info

Publication number: CN103575887B
Application number: CN201210272138.8A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 冯才伟; 崔海峰; 冯才茂; 陶光灿; 彭鸽; 马腊腊; 王建霞
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN103575887A

Abstract

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的试纸卡及其应用。试纸卡包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述黄曲霉毒素B1试纸卡检测谷物及饲料中黄曲霉毒素B1残留的方法。本发明所提供的试纸卡具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的试纸卡及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素B1的试纸卡及其应用，具体涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的胶体金试纸卡，其特别适用于黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）样品中黄曲霉毒素B1残留的检测。

背景技术

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是迄今发现污染农产品毒素最强的一类生物毒素，也是强致癌物。它是由黄曲霉菌（Aspergillusflavus）和寄生曲霉菌（A．parasiticus）等多种真菌产生的一类代谢产物，一群结构相似的化合物。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性，是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏。最为常见的有AFB1、B2、G1、G2，其中AFB1的存在量与毒性都是最大的。研究表明，人们食用这些被污染的食品后会导致急性中毒，引起肝坏死；慢性中毒则可引发人的肝癌、胃癌、肾癌或食道癌等严重的疾病。

1995年，世界卫生组织制定的食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg。美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量(指AFB1+B2+Gl+G2的总量)不能超过15μg/kg。人类消费的牛奶中的AF总含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的AF总含量不能超过300μg/kg。欧盟国家要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素B1的含量不能超过0.05μg/kg。目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱法、免疫亲和荧光法等。高效液相色谱法灵敏度高、分离能力强、特异性好等，但有些样品需要作彻底有效的前处理，不适合于大批量样品的检测，并且设备仪器昂贵，不易普及。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定量、对样品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。胶体金免疫层析法与酶联免疫法相比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于进行现场快速筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的黄曲霉毒素B1残留检测试纸卡。

本发明所提供的检测黄曲霉毒素B1残留的试纸卡，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物。

所述黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物是由黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白。

所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是以黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。

所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸卡的方法，其包括步骤：

1）制备喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸卡。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将黄曲霉毒素B1与丙二胺反应得到黄曲霉毒素B1半抗原；

2）将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到黄曲霉毒素B1单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的黄曲霉毒素B1单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，置于干燥环境中保存备用；

8）将黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸卡检测黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）样品中黄曲霉毒素B1残留的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试纸卡进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的黄曲霉毒素B1在流动过程中，与结合物释放垫上的黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成毒素-抗体-胶体金标记物。样本中的毒素与反应膜检测线上的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有黄曲霉毒素B1残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸卡卡孔内，当黄曲霉毒素B1在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T）和质控线（C）内各出现一条红色条带；如果黄曲霉毒素B1在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与黄曲霉毒素B1全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图4所示。

阴性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阳性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸卡均判为无效。

本发明的试纸卡具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸卡检测黄曲霉毒素B1残留的方法简便、快速、直观、准确、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为黄曲霉毒素B1半抗原合成图。

图2为黄曲霉毒素B1半抗原核磁共振氢谱图。

图3为试纸卡剖面结构示意图。

图4a、4b、4c为试纸卡检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1黄曲霉毒素B1检测试纸卡的制备

该试纸卡的制备方法主要包括以下步骤：

下面分步详细叙述：

1、黄曲霉毒素B1半抗原的制备

0.10g黄曲霉毒素B1在2ml二甲基亚砜（DMSO）中的混合液，60℃下缓慢滴加入0.1ml1,3-丙二胺和0.1ml吡啶在2mlDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应12h，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到黄曲霉毒素B1的丙二胺单缩合物，合成路线如图1。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，核磁图谱说明：1.0-1.5ppm之间新增加的丙二胺结构中的烷基信号峰说明半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液Ⅰ；取3%的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液Ⅰ中，室温搅拌反应24h得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白（BSA）50mg用4ml水溶解得到溶液Ⅲ；将溶液Ⅱ缓慢加入到溶液Ⅲ中，室温搅拌反应过夜得到溶液Ⅳ；加入30mgNaBH₄还原，用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得免疫原。

3、包被原的制备

取卵清蛋白（OVA）50mg用4ml水溶解得到溶液Ⅴ；取碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液Ⅴ中，室温搅拌反应30min得到溶液Ⅵ；取半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液Ⅶ；将溶液Ⅵ缓慢加入到溶液Ⅶ中，室温搅拌反应24h，用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得包被原。

4、黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射黄曲霉毒素B1的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.25ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）金标抗体的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20~50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入黄曲霉毒素B1单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02%~0.1%、吐温-200.05%~0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（BSA在缓冲液中的浓度为0.5%）、pH7.2，0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜30%）60min后取出，置于干燥环境（湿度＜30%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将黄曲霉毒素B1半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将黄曲霉毒素B1半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸卡的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线）和质控线（C线）均为与所述试纸卡的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸卡用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡，4~30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中黄曲霉毒素B1残留的检测

1、样品的前处理

称取3.0g±0.05g粉碎的样品至15ml或50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙腈，将瓶塞盖紧，振荡5min；室温（20-25℃）3000g以上离心5min；移取1ml上清液到玻璃离心管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干，加入0.4ml样品复溶液（0.02mol/L的磷酸盐缓冲液），涡动30s，待检。

2、用试纸卡进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5~10min，判定结果。15min后判断无效。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中黄曲霉毒素B1浓度低于检测限，如图4a。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中黄曲霉毒素B1浓度等于或高于检测限，如图4b。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效，如图4c。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白谷物（黄豆、玉米）及饲料（原料、配合料、浓缩料），在其中分别添加黄曲霉毒素B1至终浓度为2.5、5、10μg/kg，取试纸卡进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸卡检测黄豆、玉米、原料、配合料、浓缩料样本时，当其中黄曲霉毒素B1添加浓度为2.5μg/kg时，试纸卡上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中黄曲霉毒素B1添加浓度为5、10μg/kg时，试纸卡质控线显色，但检测线不显色，呈阳性，表明本试纸卡对谷物、饲料样品中黄曲霉毒素B1的检测限为5μg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取阳性玉米、配合料样本各20份和阴性玉米、配合料样本各20份，用三批试纸卡进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。

表1检测阳性样本结果

表2检测阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸卡检测阳性玉米、配合料样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测阴性玉米、配合料样本时，结果全为阴性，可知阴性样本符合率为100%，假阳性率为0。

3、特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、克仑特罗、莱克多巴胺用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释至500μg/L，用黄曲霉毒素B1胶体金试纸卡进行检测。结果显示，用该试纸卡检测500μg/L玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、克仑特罗、莱克多巴胺时，试纸卡质控线和检测线均显色，说明本试纸卡对这些药物无交叉反应。

Claims

1.一种检测黄曲霉毒素B1的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，其特征在于所述反应膜上有包被有黄曲霉毒素B1-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物，所述黄曲霉毒素B1-载体蛋白偶联物由黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄曲霉毒素B1半抗原的制备方法是：取0.10g黄曲霉毒素B1在2ml二甲基亚砜中的混合液，60℃下缓慢滴加入0.1ml1,3-丙二胺和0.1ml吡啶在2ml二甲基亚砜的混合液中，滴加完毕后，继续反应12h，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到黄曲霉毒素B1的丙二胺单缩合物。

2.如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述黄曲霉毒素B1半抗原分子结构式为：

3.一种应用权利要求1～2任一项所述的黄曲霉毒素B1胶体金试纸卡检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)样品的前处理；

(2)用胶体金试纸卡进行检测；

(3)分析检测结果。