DE10106409A1

DE10106409A1 - Eine sehr kostengünstige analytische Vorrichtung für die Durchführung von Immunoassays mit ultrahoher Empfindlichkeit

Info

Publication number: DE10106409A1
Application number: DE2001106409
Authority: DE
Inventors: Tarun K Dhar; Arindam Pal
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Department of Biotechnology
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Department of Biotechnology
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2002-08-14

Abstract

Eine einfache, leicht herzustellende analytische Vorrichtung, welche in der Lage ist, Membran-basierte Immunoassays mit einer Reihe von Proben innerhalb von 3 bis 10 Minuten durchzuführen, worin die Methode die fokussierte Anwendung von Proben, teuren markierten Immunoassay- und Signalverstärkungsreagenzien ermöglicht, wobei die Vorrichtung eine Antikörper-immobilisierte mikroporöse Membran, deren breite Ecke mittels wasserunlöslichem Klebstoff direkt an einem halbsteifen, flüssigkeitsundurchlässigen Körper angebracht ist, beinhaltet; der Absorptionsmittelkörper getrennt zur Verfügung gestellt wird und während der Herstellung nicht an der analytischen Vorrichtung befestigt ist, der Absorptionsmittelkörper befeuchtet und in der Nähe der unteren Membranoberfläche platziert wird, wodurch im Absorptionsmittelkörper Netzwerke von kapillaren Kanälen gebildet werden; der Fluss von Proben oder Reagenzien wird immer nach unten gerichtet gehalten und konzentriert ohne Anwendung irgendwelcher Kraft auf den Absorptionsmittelkörper und die Verwendung von wegwerfbarem Absorptionsmittelkörper ermöglicht die stufenweise Hinzufügung von Signalverstärkungsreagenzien für die ultrasensitive Bestimmung von diagnostisch wichtigen Molekülen durch visuelle Untersuchung der Membranoberfläche.

Description

Feld der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine analytische Vorrichtung und Methoden mit ultrahoher Empfindlichkeit zur Verwendung bei der Bestimmung von Analyten in einer Reihe von Proben, von denen angenommen wird, dass sie diesen Analyten enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Vorrichtung und einfache Methoden für die Anwendung von Signalverstärkungsreagenzien nach dem Immunoassay in einem Laboratorium oder unter Feldbedingungen, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen.

Hintergrund der Erfindung

Die diagnostisch wichtigen Moleküle können kleine Moleküle oder Makromoleküle sein. Kleine Moleküle wie Mycotoxine wie z. B. Aflatoxin B₁, Ochratoxin T-2-Toxin sind aufgrund von Pilzinfektionen als Verunreinigungen in Lebensmitteln und Futter wie Getreidekörnern, gemahlenen Nüssen, Reis, Erdnüssen und (Trocken)futter enthalten. Menschen und Tiere sind Mycotoxinen durch die Nahrungsaufnahme von mit Toxinen verunreinigten Lebensmitteln und Futter, durch Einatmen und Hautkontakt ausgesetzt. Die Bestimmung von Mycotoxinen in landwirtschaftlichen Waren ist wichtig, weil deren Verzehr durch Mensch und Tier Mycotoxikose verursacht. Sie produzieren auch verschiedene biologische Effekte wie akute Toxizität, Mutagenität, Carzinogenität, Teratogenität etc. (Morgan, M. R. A., Tetrahedron 45, 2237, 1989). Die Bestimmung der Konzentration von Steroiden wie Estriol, Dehydroepiandrosteronsulfat, Cortisol, Testosteron, Hormonen wie Thyroxin, Trijodthyronin und Drogen (Arzeimitteln) wie Methotrexat, welche in winzigen Mengen in biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin anwesend sind, wurde als einer der attraktiven Indikatoren für mehrere Krankheiten und unter pathologischen Bedingungen akzeptiert ("Methods of Hormone Radioimmunoassay", Hrsg. Jaffe, B. M. und Behrman, H. R. 1979, Academic Press, New York).

Die diagnostisch wichtigen Makromoleküle wie Hormone wie beispielsweise Thyroid stimulierende Hormone (TSH), adrenocorticotropes Hormon (ACTH) oder Krebsmarker wie azide Phosphatase, Ferritin, "Carcinoembroynic" Antigen sind in extrem geringen Mengen in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma enthalten. Diese biologisch wichtigen Moleküle sind weithin als effektive Krankheitsindikatoren akzeptiert worden. Auf ähnliche Weise erfordert die Diagnose von verschiedenen ansteckenden Krankheiten ebenso den Nachweis von Antigenen wie bei Hepatitis, Malaria oder den Nachweis von Antikörpern im Falle von Krancheiten wie AIDS, Amoebiasis ("Methods of Enzymatic Analysis", Hrsg. Bergmeyer, J. und Gross, Band X, XI, 1983, Verlag Chemie, Weinheim). Diese Antigene oder Antikörper sind in biologischen Flüssigkeiten wie Serum in extrem winzigen Mengen vorhanden und der frühzeitige Nachweis ist manchmal nicht möglich. Einige dieser ansteckenden Krankheiten werden mittels der gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden nur in einem späteren Stadium nachgewiesen, wenn die Konzentration von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten erhöht ist.

Der Nachweis dieser diagnostisch wichtigen Moleküle erfordert ein hochsensitives Assaysystem. Immunologische Assays haben sich für den Nachweis und die quantitative Bestimmung von zahlreichen Analyten in flüssigen Proben als von großem Wert erwiesen. Weil die Ergebnisse von immunologischen und anderen spezifischen Bindungsreaktionen häufig nicht direkt beobachtet werden können, wurden viele Techniken für deren indirekte Beobachtung erdacht. Solche Techniken umfassen das Markieren eines der Mitglieder des spezifischen Bindungspaares mit einem Radioisotop, Chromophor, Fluorophor oder Enzymlabel. Radiolabel, Chromophore und Fluorophore können durch Verwendung von Strahlungsdetektoren bzw. Spektrophotometern nachgewiesen werden. Wenn Mitglieder von spezifischen Bindungspaaren mit einem Enzymlabel markiert sind, kann deren Anwesenheit durch die enzymatische Aktivierung eines Reaktionssystemes nachgewiesen werden, worin eine Verbindung wie ein Farbstoff aktiviert wird, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Solche Prozeduren sind in einigen Artikeln und Texten beschrieben, beispielsweise in "Reviews on Immunoassay Technology", Hrsg. S. B. Pal, Pub. Chapman und Hall, 1988.

Unter den verschiedenen Immunoassays werden Enzymlabel, die mit einem spezifischen Bindungspaar markiert sind, weithin verwendet. Diese Assays werden Enzymimmunoassays, gemeinhin ELISA, genannt. Gegenwärtig wird für die Bestimmung von kleinen Molekülen die kompetitive ELISA- und von Makromolekülen die Sandwich ELISA-Methode verwendet (Porstman, T. und Kiessig, S. T., "Journal Immunological Methods", 150, 5, 1992).

In der kompetitiven ELISA, werden Probe oder Standard zu einer Festphase wie einer mit 96 Vertiefungen versehenen Mikrotiterplatte, Röhren, Perlen, die mit einem gegen die zu bestimmenden kleinen Moleküle gezogenen Antikörper beschichtet sind, gegeben. Sie werden nach Hinzufügung eines Enzyms, welches kovalent mit dem kleinen Molekül verbunden ist, bei einer Temperatur im Bereich von 4°C bis 37°C während eines Zeitraumes von 3 bis 24 Stunden inkubiert. Der nachzuweisende Analyt konkurriert mit dem markierten Reagenz des gleichen Analyten für eine begrenzte Zahl von Antikörper bindenden Stellen. Die Menge an markierten Antigenen, welche sich an den Antikörper bindet, ist der Menge an unbekanntem Antigen in der Probe umgekehrt proportional.

Die festen Phasen werden mit einem Puffer gewaschen und Substratlösung wird hinzugefügt, welche sich aufgrund der enzymatischen Aktivität des Enzymkonjugaten, welches mit dem auf der Festphase immobilisierten Antikörper färbt. Die Farbintensität ist der Konzentration des kleinen Moleküls in der Probe umgekehrt proportional. Die Sichtbarmachung der Farbintensität mit bloßem Auge im Vergleich zur bekannten Konzentration des kleinen Moleküls gibt eine Vorstellung von der relativen Menge des in der Probe vorhandenen kleinen Moleküls. Die Menge an entwickelter Farbe kann auch zur quantitativen Bestimmung mittels eines Spektrophotometers oder eines automatischen Lesegerätes für Mikrotiterplatten gemessen werden. Die gemessenen Absorptionen werden gegen die bekannte Konzentration von kleinen Molekülen aufgetragen, um eine Standardkurve zu erhalten. Die Konzentration des kleinen Moleküls in Proben wird anhand dieser Standardkurve durch Standardprozeduren berechnet.

In einem anderen Assay, bekannt als Sandwich ELISA Methode, wird eine feste Oberfläche wie eine mit 96 Vertiefungen versehene Mikrotiterplatte, Röhren mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, der gegen die zu bestimmenden Makromoleküle erhalten wurde. Freie Stellen sind mit blockierendem Protein wie Casein, BSA blockiert. Makromoleküle enthaltende Standards oder Proben werden zur Festphase hinzugefügt und bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 37°C für einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden inkubiert. Das ausgewählte makromolekulare Antigen in der Probe oder dem Standard bindet sich an den Rezeptor monoklonalen Antikörper. Die Festphase wird gewaschen und weiter für einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden mit einem zweiten polyklonalen Antikörper (gegen Makromoleküle) inkubiert, der kovalent mit einem Enzym verbunden ist, welches sich an das gebundene Antigen binden kann, um ein immobilisiertes Reaktionsprodukt zu bilden. Die feste Phase wird weiter gewaschen. Das Label im Reaktionsprodukt wird nachgewiesen, welches die Gegenwart des Antigens in der Probe anzeigt. Die Konzentration des Makromoleküls in Proben wird wie in obiger Methode beschrieben bestimmt.

Diese oben beschriebenen immunologischen Nachweismethoden werden weithin für den Nachweis von biologisch wichtigen Molekülen, wie sie üblich als Analyten bezeichnet werden, verwendet. Diese Methoden sind einfach, haben aber folgende Nachteile:

1. Sie erfordern gut ausgestattete Laboratorien und sind für das Testen einer Reihe von Proben (Batch-Betrieb) eingerichtet.
2. Das Vorhandensein von meistens langen Inkubationszeiten macht die Methode lang und zeitaufwendig.
3. Die Nachweisgrenze der Methode liegt tief, was den Nachweis von Analyten, welche nur in extrem winzigen Mengen vorhanden sind, sehr schwierig gestaltet.
4. Diese Assays sind nicht geeignet für das Testen vor Ort oder für Verwendung unter Feldbedingungen.

"Dot-immunobinding" Assays, welche für den Nachweis von Antigenen oder Antikörpern als Alternative zu ELISA eingeführt wurden (Hawkes, R., et. al. "Analytical Biochemistry", 119, 142, 1982) haben für eine große Revolution auf dem Gebiet der Diagnose gesorgt. Diese, im allgemeinen als Membran-basierte Assays bezeichnet, sind ELISA ähnlich, und der einzige Unterschied ist, dass hier Membranen als Immunosorbent anstelle von Mikrotiterplatten oder - röhren verwendet werden. Sie haben auch kompetitive Methoden für kleine Moleküle und nicht kompetitive oder Sandwich-Methoden für Makromoleküle. Hier wird ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an die Zielsubstanz binden kann, über der Membran immobilisiert. Im Assay wird die zu testende Probe auf die Reaktionsmembran aufgebracht. Wenn der Zielanalyt in der Probe vorhanden ist, wird er sich an den immobilisierten Rezeptor binden. Typischerweise wurde die Probe nach einem Inkubationsschritt von der Festphase getrennt, welche dann gewaschen und mit der Lösung eines zusätzlichen polyklonalen Antikörpers, er mit Enzym markiert ist, inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde der nicht gebundene Antikörper von der Festphase abgetrennt und die Menge an markiertem Antikörper, welche an die Festphase gebunden ist, bestimmt. Diese Methoden sind einfach, die Farbe ist vor dem weißen Hintergrund der Membran sichtbar. Die Methode hat die folgenden Nachteile:

1. Die Nachweisgrenze der Methode liegt sehr tief und ist im Bereich von 500 bis 2000 pg, wodurch die Bestimmung von Antigen oder Antikörpern in Testproben schwierig ist.
2. Die lange Inkubationszeit macht die Methode zeitaufwendig.
3. Die niedrige Nachweisgrenze der Methode hat ihre Anwendung für den Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die in extrem winzigen Mengen vorliegen, begrenzt.
4. Membranen sind von Natur aus empfindlich und ihre Handhabung wird schwierig.

Der Nachweis von in geringer Konzentration vorliegenden Analyten erfordert die Aufkonzentration der Probe oder längere Inkubationszeiten, um für die genaue Schätzung des Analyten ein genügendes Signal zu erzeugen. Jedoch kann wegen der niedrigen Empfindlichkeit der Membran-basierten Assays und unspezifischer Interferenz die Interpretation der Ergebnisse nicht genau sein. Die Anwendung eines Enzymverstärkungsschrittes hat sich als sehr effizient gezeigt, nicht nur zur Erhöhung der Empfindlichkeit, sondern auch zur Verringerung der Assayzeit (Bates, "Trends in Biotechnology", 5, 204, 1987). In diesen Verfahren ist das an der Festphase gebundene primäre Enzym katalytisch mit einem zusätzlichen System verbunden, welches nicht nur das Signal verstärkt, sondern auch die Empfindlichkeit erhöht.

Bobrow et al., (Journal of Immunological Methods, 125, 279, 1989; Ibid. 137, 103, 1991) beschrieb ein Signalverstärkungssystem, genannt "Catalyze Reporter Deposition (CARD)- Methode", um die Nachweisgrenze in Immunoassays zu verbessern, indem Hasen IgG als Testanalyt verwendet wird. Bei dieser Methode wurde eine verdünnte Lösung des Antigen (Hasen IgG) bei verschiedenen Konzentrationen über Nitrocellulose-Membranstreifen in Form von Punkten aufgebracht. Es wurde getrocknet, mit 5% Casein blockiert und mit Doppelantikörperperoxidase-Konjugat ("double antibody-peroxidase conjugate") inkubiert. Es wurde dann erneut mit Biotin-Tyramin-Konjugat inkubiert, welches 0.004% Wasserstoffperoxid enthält. Membrangebundene Peroxidase katalysiert den phenolischen Teil des Biotin-Tyramin- Konjugats, welches sich auf der Oberfläche der Membran niederschlägt. Das abgeschiedene Biotin wird dann mit mit Streptavidin markiertem Enzym umgesetzt, was zur Abscheidung der Enzyme führt. Der Nettoeffekt ist, dass ein einzelnes HRP-Label von vielen Peroxidasemolekülen umgeben ist. Die Membran ist mit Substratlösung inkubiert und aufgrund der enzymatischen Aktivität entwickelt sich Farbe über den Membranen in Form von Punkten. Die Farbintensität ist der entwickelten Farbmenge direkt proportional. Die Methode, die auch "Tyramid Signal Verstärkung" genannt wird, ist flexibel und kann als zusätzlicher Schritt nach einer konventionellen Dot-ELISA angewandt werden. In dieser Methode kommt es aufgrund einer Abscheidung von zusätzlichem Enzym zu einer Verstärkung und dadurch einer Verbesserung der Nachweisgrenze um mehr als das 25-fache. Diese Methode hat folgende Nachteile:

1. Die Nachweisgrenze der Methode mit verschiedenen Substratlösungen liegt, abhängig von dem für Streptavidin benutzten Enzymlabel, im Bereich von 80 bis 1 pg.
2. Die Zunahme an Empfindlichkeit beträgt nur das 30-fache.
3. Die benötigten langen Inkubationszeiten gestalten die Methode zeitaufwendig.

Vor kurzem haben die Anmelder eine neue Signalverstärkungsmethode basierend auf der "catalyzed reporter deposition" entwickelt. Die als Super-CARD-Methode bezeichnete Methode nutzt synthetisierte elektronenreiche Proteine, welche mehrfache Kopien von phenolischen Gruppen als Blockierungsagenzien haben. Nach der Vervollständigung eines konventionellen Assay oxidiert das an der Festphase gebundene HRP das zugefügte markierte Substrat, welches sich auf der Festphase abscheidet. Diese Abscheidung wird durch die Gegenwart von immobilisierten elektronenreichen Proteinen merklich erhöht, was nicht nur das Signal verstärkt sondern auch die Empfindlichkeit erhöht. Die hohe Spezifität der Verstärkungsreaktion vermeidet die Erzeugung von irgendwelchen falschen positiven Signalen. Der direkte Vergleich mit existierenden CARD-Methoden demonstriert eine nahezu 1.6.10⁴-fache Vergrößerung der Nachweisempfindlichkeit, welche weit größer ist als die von jeder anderen existierenden Methode (Indische Patente Nr. 1996/DEL/97; 1989/DEL/97; 1991/DEL/97 und veröffentlicht in "Journal of Immunological Methods" 227, 31-39, 1999; Ibid. 230, 71-86, 1999). Die Methode bietet mehrere Vorteile:

1. Die Methode ist einfach und leicht zu implementieren.
2. Die als Blockierungsagenzien benutzten neuen Proteinkonjugate können ausgehend von kommerziell erhältlichen preiswerten Proteinen und Chemikalien hergestellt werden.
3. Die gleichen Reagenzien wie in der CARD Verstärkung können verwendet werden.

Da die Membranen sehr empfindlich und schwierig handhabbar sind, wurden zahlreiche Assayvorrichtungen in verschiedenen Konfigurationen für eine breitere Anwendung unter Feldbedingungen entwickelt. Der "Messstab" wurde zuerst eingeführt. Er benutzt im allgemeinen einen Plastikstreifen mit einer immobilisierte Antikörper enthaltenden Membran, die an einem Ende für das Eintauchen in eine Lösung befestigt ist, die entweder den interessierenden Analyten (mutmaßlich) enthält. Bei der Inkubation binden sich der in der Probe vorhandene Analyt an den über der Membran immobilisierten Antikörper. Das Ausmaß, in welchem die Probe an diese Zone gebunden wird, kann mit Hilfe der markierten Reagenzien ermittelt werden. Typischerweise bestimmt der Nutzer die Konzentration des Analyten durch Vergleich der Farbe auf der Membran mit der Farbe auf einem externen Kalibrator, wie einer Reihe von gefärbten Platten, die auf einem Label gedruckt sind. Die Farbe jeder Platte entspricht einer bestimmten Konzentration des Analyten. Die Farbe auf der Platte, die der Farbe auf dem Messstab am meisten ähnelt, gibt dem Benutzer die ungefähre Konzentration des Analyten in den Testproben an. Die Methode hat jedoch mehrere Nachteile:

1. Die Methode ist zeitraubend und erfordert häufig eine Anzahl von Manipulationsschritten, beispielsweise die Hinzufügung und Inkubation von Assayreagenzien.
2. Es ist schwierig, die Farbe der Platten mit der Farbe des Messstabes zu vergleichen.
3. Nur eine Probe kann mit einem Messstab analysiert werden.
4. Die Farbe auf den Platten würde nicht proportional zu den adversen Konditionen schwächer werden, welche die Farbe des Messstabes beeinflussen. Daher wird für einen bestimmten Satz von Reaktionsbedingungen der Vergleich der Ergebnisse mit den Farben auf den Platten kein genaues Ergebnis bringen.

Die "Immunochromatographische Teststreifen-Anordnung" stellt gegenüber dem einfachen Messstab eine Verbesserung dar. Diese Klasse von Vorrichtungen hat einen absorbierenden Streifen, der mit Rezeptor (Antikörper) in der Nähe des Zentrums eines typischerweise rechtwinkligen chromatographischen Mediums, z. B. Filterpapier, Membran immobilisiert ist, und ein Endteil für die Kontaktierung einer Testlösung hat. Der eine Länge und eine Breite aufweisende Streifen kann Flüssigkeiten in einer Richtung des Flüssigkeitsflusses ("fluid flow direction") im allgemeinen parallel zur Länge der Streife übertragen. Sie zeigen im allgemeinen eine verbesserte Empfindlichkeit beim Nachweis von Analyten, relativ zu denen von einfachen Messstabvorrichtungen, aufgrund des den Analyten konzentrierenden Effektes, welcher durch den Fluß der den Analyten enthaltenden Probe hinter eine "immobilized analyte binding zone" erreicht wird. Eine Probe, von der vermutet wird, das sie den interessierenden Analyten enthält, wird am Ende oder in der Nähe des Endes eines Membranstreifens platziert, gefolgt von dem markierten Reagenz. Das markierte Reagenz ist ein vom ersten Antikörper unterschiedlicher Antikörper. Dennoch bindet es ebenfalls spezifisch an den Analyten, wird separat hergestellt und gebunden an eine nachweisbare Markersubstanz, um einen Marker-Zweiter Antikörper-Komplex herzustellen. Der Marker-Zweiter Antikörper Komplex kann vor der Hinzufügung zum Streifen mit Probe vorgemischt werden oder er kann im wesentlichen gleichzeitig mit der Probe oder nach der Probenhinzufügung zugefügt werden. Der Mischung wird es erlaubt, durch eine flüssige Phase zum entgegengesetzten Ende des Membranstreifens gebracht zu werden, welche den Membranstreifen aufgrund kapillarer Wirkung durchquert. Während der Membranstreifen durchquert wird, wenn die Probe Analyten enthält, dieser an den Rezeptor (entweder die mobile oder stationäre Phase) gebunden, und der Marker wird ebenfalls in der Falle gefangen, indem es einen Komplex von Maler, zweitem Antikörper, Analyten und erstem Antikörper ergibt. Weil der Marker nachweisbar ist, kann die Gegenwart des Markers mit bloßem Auge nachgewiesen werden, d. h. mittels Farbe, welche mit dem chromatographischen Medium kontrastiert. Daher wird eine gefärbte Marke oder ähnliches vom Marker an der Stelle zurückgelassen, an welcher der erste Antikörper aufgebracht wurde, und dadurch ist es möglich, leicht die Gegenwart (oder Abwesenheit) von Analyten zu bestätigen. Gegenwärtig sind viele solcher in vitro diagnostischen Kits basierend auf Immunochromatographie bekannt und kommerziell erhältlich. Die Methoden sind einfach und weniger zeitaufwendig, haben jedoch mehrere Nachteile:

1. Die Methode kann nur zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit der interessierenden oder klinisch bedeutsamen Substanz verwendet werden. Die quantitative Bestimmung des Analyten ist nicht möglich.
2. Die Materialien und Dimensionen beeinflussen die Gleichmäßigkeit des Flusses der nachzuweisenden Moleküle durch den Assay. Wenn der Fluss der Flüssigkeit zu schnell ist, werden die nachzuweisenden Moleküle zurückgelassen und nicht genau durch den Assay nachgewiesen.
3. Nur eine Probe kann mit einer Assayvorrichtung analysiert werden.

"Durchflussvorrichtungen", welche einige der Nachteile des Messstabes und der immunochromatographischen Teststreifenvorrichtungen überwinden, wurden entwickelt, die Membranen wie Nitrocellulose, Glasfasern, Polyester, Cellulosenitrat, Polyester und Nylon, die mit einem Antigen vorbeschichtet sind, benutzen. Diese Vorrichtungen nutzen den Fluss der Flüssigkeit in eine Richtung, welche im wesentlichen quer zu der Ebene der Membran ist. Eine den Zielanalyten enthaltende Lösung wird durch Kapillaraktion des adsorbierten Materials, welche der Membran benachbart lokalisiert ist, durch die gesamte Membranfläche gezogen. Absorbierendes Material wie Celluloseacetat, Filterpapier, poröses Polyethylen ist fähig, flüssige Proben in einer wesentlich größeren Menge aufzusaugen als während eines Testes angewandt wurde. Der absorbierende Körper stellt ein Mittel zur Sammlung der Probe bereit, indem ein gleichförmiges Saugen zur Verfügung gestellt wird, um die Probe durch die Reaktionsmembran hinunter in den adsorbierenden Körper zu liefern. Daher agiert der Adsorbtionsmittelkörper auch als Reservoir zum Halten der Probe und von verschiedenen Reagenzien. Proben, die Zielanalyten enthalten, und Referenzstandards werden auf verschiedene Stellen der Membranoberfläche aufgebracht und das Aufnahmevermögen des Absorbtionsmittel wird die Flüssigkeit der Probe ziehen. Danach werden Signal-produzierende Systeme, die am Antikörper mit Bindespezifität für den Zielanalyten befestigt sind und in der Lage sind, eine nachweisbare sichtbare Änderung auf der Oberfläche zu erzeugen, über die Membranoberfläche gezogen. Wenn das farbproduzierende System verwendet wird, wird Antikörper, konjugiert mit Meerrettich Peroxidase, der Membranoberfläche ausgesetzt. Anschließendes Aussetzen der Membran gegenüber 4-Chloro-1-Naphthol-Substrat resultiert in der Abscheidung eines dunkelblauen Farbstoffes auf der Membranoberfläche aufgrund der enzymatischen Aktivität. Hoher Kontrast zwischen den gefärbten und ungefärbten Teilen der Membranoberfläche erlaubt den Nachweis des Analyten. Sichtbarmachung der Intensität der Farbe im Vergleich mit bekannter Konzentration von Referenzstandard gibt eine Vorstellung von der in der Probe vorhandenen Menge an Antigen. Die Methode ist einfach und der Test kann unter Feldbedingungen durchgeführt werden und Ergebnisse gewöhnlich in weniger als 10 Minuten erhalten werden.

Mehrere analytische Vorrichtungen auf der Basis des Durchflussprinzips wurden entwickelt und in Patenten beschrieben, welche ein Membranimmunoadsorbtionsmittel in Kombination mit einer adsorbierenden Auflage verwenden. Der absorbierende Körper, der in diesen Vorrichtungen die Flüssigkeit aufnehmende Zone darstellt, kann entweder in nichtkontinuierlichem Kontakt mit der immobilisierten Antikörper enthaltenden Membran sein (US-Patent Nr. 4,246,339) oder in kontinuierlichem Kontakt mit der Membran (US-Patente Nr. 4,366,241, 4,446,232, 4,632,901 und 4,727,019). Vorrichtungen, in denen der absorbierende Körper nicht in direktem Kontakt mit der Membran ist, erlauben der die Probe enthaltenden Lösung und/oder markierten Reagenzien einen größeren Kontakt mit der Membran, bevor der Fluss der Lösung zum absorbierenden Körper stattfindet. Solche Vorrichtungen mit nichtkontinuierlichen Kontakt sind effizienter bei der Nutzung von Proben und markierten Reagenzien, sie benötigen jedoch physikalische Bewegung durch den Assayisten, um den Fluß der Flüssigkeit zu bewirken. Dieser Schritt kann in den Assay einen Fehler einführen. Die Vorrichtungen mit kontinuierlichem Kontakt sind weniger effizient bei der Nutzung von teuren markierten Reagenzien. Daher wird ein Reagenzvolumen benötigt, welches wesentlich größer ist als das Hohlraumvolumen ("void volume") der Membran, um sicherzustellen, dass die gesamte Membran mit der Reagenzien enthaltenden Lösung kontaktiert wurde.

In beiden Vorrichtungstypen sind Membran und absorbierender Körper in einem Plastikgehäuse enthalten, welches einen oberen und einen unteren Teil hat, welche unter Druck zusammengefügt werden, um die Membran und den absorbierenden Körpern am Platz und im Kontakt miteinander zu halten. Vor kurzem wurde im US-Patent Nr. 5,885,526 an Chu (März 1999) eine analytische Vorrichtung gering modifiziert, indem die Reaktionsmembran und der absorbierende Körper mit einem wasserunlöslichen Klebstoff versiegelt werden. Die flüssige Probe wird mittels verschiedener Techniken auf die Unterlage aufgebracht und die Probe aufgrund kapillarer Aktion der absorbierenden Unterlage durch die gesamte Membranfläche gezogen. Die Geschwindigkeit und der Pfad des Flüssigkeitsflusses in der Assayvorrichtung hat einen großen Einfluss auf die Assayresultate. Eine Anzahl Vorrichtungen wurde im Stand der Technik beschrieben, welche Oberflächen mit spezifisch angeordneten geometrischen Elementen benutzten, um den Pfad und die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsflusses zu kontrollieren. Vorrichtungen wie sie in den US-Patenten Nr. 4,426,451 und 5,922,615 beschrieben sind, benutzen eine Anordnung, in welcher eine Membran zwischen planaren Blättern mit einer glatten Oberfläche eines nicht absorbierenden Körpers angeordnet ist, um eine Flüssigkeit innerhalb der Membran zu halten. Vorrichtungen wie sie in den US-Patenten Nr. 4,233,029 und 4,310,399 beschrieben sind, benutzten geometrischen Anordnungen von kapillaren Kanälen um den Flüssigkeitsstrom zu modulieren, so dass die Flüssigkeit gerichtet ist, in regulären geometrischen Mustern und mit kontrollierten Geschwindigkeiten zu fließen. Der Nachweis von in niedriger Konzentration anwesenden Analyten erfordert die Aufkonzentrierung der Proben. Dies wurde in einigen analytischen Vorrichtungen erreicht (US-Patent Nr. 4,818,677), indem unterhalb der Reaktionsmembran ein adsorbierender Körper von hoher Kapazität verwendet wurde, welcher größeres Probenvolumen zieht, das auf die Oberseite der Membran gebracht wird. Jedoch kann wegen der unspezifischen Interferenz die Interpretation der Ergebnisse nicht genau sein. Die Hauptnachteile der bis heute entwickelten Durchflussvorrichtungen sind wie folgt:

1. Die niedrige Nachweisgrenze der analytischen Vorrichtung hat ihre Anwendung zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern begrenzt, die in extrem niedrigen Mengen vorhanden sind.
2. Analytische Vorrichtungen werden individuell zusammengebaut, wodurch der Herstellungsprozess kompliziert und teuer wird.
3. Die Verwendung ungenügender Kompression, um Membran und absorbierenden Körper zu halten, führt zum seitlichen Fließen der Probe während des Assay, wodurch es zu Ungenauigkeiten im Ergebnis kommt.
4. Sie erfordern die Anwendung von Druck, um Flüssigkeit von der Membran zur absorbierenden Schicht zu zwingen.
5. Die Anwendung des Signalverstärkungsschritts ist schwierig.

Aufgaben der Erfindung

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte, sehr kostengünstige, leicht herzustellende analytische Vorrichtung auf der Basis des Durchflussprinzips für die Durchführung rascher Immunoassays zum visuellen Nachweis von diagnostisch wichtigen Antigenen oder Antikörpern bereitzustellen.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung von wegwerfbaren absorbierenden Körpern nicht nur für die einfachere Herstellung der Vorrichtung, sondern auch für die Anwendung von Elementen der Signalverstärkung für den Erhalt ultrahoher Empfindlichkeit.

Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung einer einfachen Assaymethode mit der erfundenen Vorrichtung, welche ohne Ausbreitung immer einen nach unten gerichteten effizienten Fluss von Probe oder teuren markierten Reagenzien erlaubt, ohne Anwendung von Kraft auf den absorbierenden Körper, wodurch die oben beschriebenen Nachteile der bislang bekannten Durchflussvorrichtungen überwunden werden.

Neuheit

Die analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist sehr einfach in seiner Konstruktion verglichen mit bislang bekannten Vorrichtungen. Die für die Konstruktion verwendeten Materialien sind billig und abgesehen von der Reaktionsmembran sehr leicht in Schreibwarengeschäften erhältlich. Der absorbierende Körper wird weder durch Kompression noch Klebstoff während der Herstellung mit der Reaktionsmembran verbunden. Sie werden getrennt mit der Vorrichtung bereitgestellt und nach der Verwendung weggeworfen, bevor mit dem nächsten Schritt weitergemacht wird. Dieses Merkmal unterscheidet die hier erfundene Vorrichtung vollständig von den bislang bekannten Vorrichtungen. Zusätzlicher absorbierender Körper wird, falls durch das Assayprotokoll für die Hinzufügung von Elementen des Signalverstärkungssystems erforderlich, zur Verfügung gestellt. Der verwendete absorbierende Körper ist ein einfaches ebene dünne Schichte ("sheet") aus jedem konventionell verwendeten absorbierendem Material, welches über die Fähigkeit zur Absorption von Flüssigkeiten verfügt. Keine besonderen geometrischen Anordnungen im absorbierenden Körper für die Flusskontrolle sind erforderlich.

Die für die Durchführung von Immunoassays mit der erfundenen Vorrichtung entwickelte Assayprozedur ist einfach und verschieden von bekannten Vorrichtungen. Der absorbierende Körper wird zunächst mit Flüssigkeit getränkt und zu der Vorrichtung auf solche Weise zusammengebaut, dass die obere Oberfläche des absorbierenden Materials in engem Kontakt mit der unteren Oberfläche der Reaktionsmembran ist.

Der vorgefeuchtete absorbierende Körper sättigt das Hohlraumvolumen der Reaktionsmembran, welche dadurch nicht das Ausbreiten von Probe oder von Immunoassayreagenzien erlaubt. Der Fluss von angewandter Probe oder Reagenz erfolgt immer nach unten und konzentriert, ohne Anwendung irgendeiner Kraft auf den absorbierenden Körper, wodurch teure markierte Reagenzien effizient benutzt werden können. Das Hohlraumvolumen des befeuchteten absorbierenden Körpers reicht noch aus, um im wesentlichen das zusätzliche Volumen der während des Assay eingeführten Flüssigkeit zu füllen, und erfüllt daher die Funktion einer Flüssigkeit aufnehmenden Zone. Der befeuchtete absorbierende Körper kontrolliert die Flussgeschwindigkeit der aufgebrachten Flüssigkeit, welche die Ausbreitung der Flüssigkeit verhindert und eine größere Wechselwirkung zwischen den Zielmolekülen und den immobilisierten Antikörpern auf der Reaktionsmembran ermöglicht, wodurch die Empfindlichkeit erhöht wird. Die Immunoassays, welche die erfundene Vorrichtung benutzen, sind einfach und schnell, und können qualitativ oder quantitativ sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine sehr kostengünstige, leicht herzustellende analytische Vorrichtung zur Verfügung, die insbesondere für die Durchführung von Immunoassays zur Bestimmung von Analyten innerhalb von 10 Minuten mit ultrahoher Empfindlichkeit verwendet werden kann. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst einen halbsteifen, flüssigkeitsundurchlässigen Trägerkörper und einen mikroporösen Teil wie eine Membran, welche eine Vielzahl von immobilisierten Antikörperpunkten enthält, die an der unteren Seite zur oberen breiten Seite hin mit wasserunlöslichem Klebstoff über einem halbsteifen, flüssigkeitsundurchlässigem Körper befestigt ist. Die Vorrichtung beinhaltet auch getrennte Schichten ("sheets") von adsorbierendem Körper, welche größer als die Membran sind, welche während der Herstellung nicht mit der Membran in der Vorrichtung verbunden ist. Die Zahl der Blätter von Absorptionskörper kann für die weitere Hinzufügung von Elementen von Signalverstärkungssystemen nach dem Wegwerfen des ersten Absorptionskörpers mehr als eins betragen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In der Methode der vorliegenden Erfindung wird der absorbierende Körper mit Flüssigkeit getränkt und in der Näher der unteren Oberfläche der Reaktionsmembran positioniert und gedrückt, um in flüssiger Kommunikation mit der Reaktionsmembran zu sein. Unter diesen Umständen ist das Hohlraumvolumen der reaktiven Membran gesättigt und der Abstand, welcher die reaktive Membran und den absorbierenden Körper trennt so, dass Netzwerke von Kapillarkanälen mit dem absorbierenden Material gebildet werden. Die auf einen gut definierten Bereich der Membran aufgebrachte Probe oder markiertes Reagenz passiert ohne Anwendung von irgendeiner äußeren Kraft immer nach unten. Die aufgebrachte Flüssigkeit breitet sich nicht aus und bleibt innerhalb der begrenzten Fläche fokussiert.

Die analytische Vorrichtung und Methode der vorliegenden Erfindung können für die Verwendung in verschiedenen Assaytypen angenommen werden. Je nach Erfordernis können sowohl konventionelles wie auch ultraempfindliches Format verwendet werden. Assays sind schnell und Reihen von Proben können innerhalb von 4 oder 10 Minuten analysiert werden. Die Vorrichtung findet ihren größten Nutzen nicht nur mit biologischen Proben sondern auch mit Industrie-, Umwelt- und Lebensmittelproben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Vorrichtung der Erfindung kann anhand der Figuren erkannt werden, welche schematische Zeichnungen und nicht maßstabsgerecht sind.

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht der Komponenten der analytischen Vorrichtung.

Fig. 1A ist ein rechtwinkliges Blatt der Reaktionsmembran.

Fig. 1B sind Streifen der Reaktionsmembran.

Fig. 1C ist ein schmaler fester Streifen von flüssigkeitsundurchlässigem Körper

Fig. 1D ist eine halbsteife, flüssigkeitsundurchlässige Bodenträgerschicht der analytischen Vorrichtung.

Fig. 1E ist ein absorbierender Körper, welcher während der Herstellung nicht an der analytischen Vorrichtung angebracht ist.

Fig. 2 (A und B) ist eine perspektivische Ansicht einer analytischen Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.

Fig. 3 (A und B) ist eine perspektivische Ansicht einer alternativen analytischen Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.

Fig. 4 (A und B) ist eine perspektivische Ansicht einer analytischen Vorrichtung für die Durchführung eines Immunoassay in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.

Fig. 5 (A und B) ist eine perspektivische Ansicht einer alternativen analytischen Vorrichtung für die Durchführung eines Immunoassay in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.

Demgemäss stellt die vorliegende Erfindung eine analytische Vorrichtung für die Durchführung von Immunoassays für den Nachweis von Analyten in einer flüssigen Probe zur Verfügung, worin eine Reaktionsmembran, die flüssigkeitsundurchlässig und porös ist und eine obere und eine untere Oberfläche hat, wobei eine ausgesetzte (frei liegende) Fläche von besagter oberer Oberfläche einen immobilisierten Antikörper oder Antigen aufweist, welcher sich an den Zielanalyten binden kann, wobei besagter immobilisierter Antikörper oder Antigen in einer mehrfach punktförmigen Region von besagter oberen Oberfläche konzentriert ist.

Es umfasst weiterhing eine halbsteife, flüssigkeitsundurchlässige Bodenträgerschicht, worin ein Teil der unteren Oberfläche von besagter Reaktionsmembran in der breiten Ecke, die keinen immobilisierten Antikörper oder Antigen aufweist, mittels eines wasserunlöslichen Klebstoffes oder Bandes mit Klebstoff auf beiden Seiten auf der oberen Oberfläche der Trägerschicht befestigt ist. Alternativ ist ein schmaler fester Streifen eines flüssigkeitsundurchlässigen Körpers zwischen der Reaktionsmembran und der halbsteifen Unterstützungsschicht angeordnet, wobei die obere Oberfläche an einem Teil der unteren Oberfläche in der breiten Ecke besagter Reaktionsmembran und die untere Oberfläche mit der Bodenträgerschicht mittels eines wasserunlöslichen Klebstoffes verbunden ist.

Es umfasst weiterhin einen Körper von absorbierendem Material mit einer oberen Oberfläche und einer unteren Oberfläche, der in der Lage ist, Flüssigkeit zu absorbieren. Er ist nicht mittels Kompression oder Klebstoff während der Herstellung mit der Reaktionsmembran verbunden worden. Er wird getrennt mit der analytischen Vorrichtung zur Verfügung gestellt. Die obere Oberfläche von besagtem absorbierendem Körper erstreckt sich hinter die Peripherie der besagten Reaktionsmembran, ist aber kleiner als die besagte Bodenträgerschicht. Der absorbierende Körper ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Celluloseacetat, Filterpapier oder Toilettenpapier ("bathroom tissue paper"). Die Dicke des besagten absorbierenden Körpers kann von ungefähr 0.1 bis ungefähr 8 mm und mehr reichen. Eine einzelne analytische Vorrichtung enthält mehr als einen wegwerfbaren absorbierenden Körper, welcher für die Hinzufügung von Elementen von Signalverstärkungsreagenzien verwendet wird.

In der analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist die Größe und Peripherie besagter Reaktionsmembran wesentlich kleiner als besagter Bodenträgerschicht ("bottom support layer"). Außerdem ist die Größe der Reaktionsmembran nicht kritisch und größere Größen können in einer einzelnen Vorrichtung für die Durchführung einer Reihe von Proben verwendet werden. Mehrfache Streifen Reaktionsmembran können an der halbsteifen Trägerschicht befestigt werden, um für eine Reihe von Proben einen Immunoassay durchzuführen. Die Reaktionsmembran umfasst Nitrocellulose, aber andere Arten von halbdurchlässigen Membranmaterialien einschließlich Nylon, Polyvinylidendifluorid und ähnliche können ebenfalls verwendet werden. Der durchschnittliche Durchmesser der Membran liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0.22 bis ungefähr 3 µm, und noch mehr bevorzugt 0.45 µm. Die freie ("loose") Fläche der Reaktionsmembran hat auf ihr immobilisiert Antikörper oder Antigene über die gesamte Membranoberfläche als mehrfache Punkte oder unter bestimmten Umständen kann es erwünscht sein, über die gesamte Membranoberfläche bei gleichförmiger Konzentration zu immobilisieren.

Weiterhin kann es immobilisiert sein mit mehr als einem spezifischen Antikörper auf der Membran, an der gleichen oder verschiedenen Stellen für den gleichzeitigen Nachweis von mehrfachen Analyten in einer Probe mit einer einzigen Assayvorrichtung.

Nach der Immobilisierung können ungenutzte Bindestellen auf der Nitrocellulose mit geeigneten Blockierungsproteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Casein, BSA, Gelatine und ähnlichen blockiert werden. Alternativ werden für das ultraempfindliche Format freie Bindungsstellen auf der Nitrocellulosemembran für die Anwendung von Super-CARD- Signalverstärkung mit elektronenreichen Proteinen wie p-Hydroxyphenylpropionsäure-Casein- Konjugat, p-Hydroxyphenylpropionsäure-Gelatine-Konjugat und ähnlichen blockiert.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Bodenträgerschicht mit adäquater mechanischer Stärke verwendet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylen, Plastik und Fiberglas. Die Reaktionsmembranen sind über der Bodenunterstützungsschicht unter Verwendung von wasserunlöslichen Klebstoffen, der nur im oberen 4 mm niedrigeren Teil der Membran aufgebracht ist, befestigt. Alternativ kann ebenfalls ein Klebeband verwendet werden, das auf beiden Seiten Klebstoff hat, um die Membran über der Bodenträgerschicht zu befestigen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Zusammenbau von absorbierendem Körper mit der analytischen Vorrichtung für die Durchführung von Immunoassays:

a) Tränken des absorbierenden Körpers mit Flüssigkeit, gefolgt von Platzieren in der analytischen Vorrichtung auf solche Weise, dass die obere Oberfläche des absorbierenden Körpers in engem Kontakt mit der unteren Oberfläche der Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche über der Bodenträgerschicht ist.
b) Die obere Oberfläche der Reaktionsmembran wird zur Entfernung von Luft, welche zwischen der unteren und oberen Oberfläche von Reaktionsmembran und absorbierendem Körper eingeschlossen ist, gedrückt.
c) Das Hohlraumvolumen der Reaktionsmembran wird gesättigt und der Abstand, welcher reaktive Membran und absorbierenden Körper trennt, ist derart, dass dort Netzwerke von kapillaren Kanälen gebildet werden, wo die beiden Teile in Kontakt miteinander sind.
d) Der Fluss von aufgebrachter Probe oder Reagenz erfolgt ohne Anwendung von irgendeiner Kraft auf den absorbierenden Körper immer nach unten und fokussiert.
e) Das Hohlraumvolumen des befeuchteten absorbierenden Körpers reicht immer noch aus, um im wesentlichen das zusätzliche, während des Assay eingeführte Flüssigkeitsvolumen zu füllen.

In der Methode der vorliegenden Erfindung wird der absorbierende Körper in entionisiertem destillierten Wasser, Puffer getränkt, und die obere Oberfläche der Reaktionsmembran wird mit einem kleinen Roller, randlosen kleinen Reagenzgläsern und ähnlichem gedrückt. Der vorgefeuchtete absorbierende Körper sättigt das Hohlraumvolumen der Reaktionsmembran, welche dadurch das Ausbreiten von Probe oder Immunoassayreagenzien nicht erlaubt. Dies ermöglicht die effiziente Verwendung von teuren markierten Reagenzien. Verschiedene Volumen von Probe oder markierten Reagenzien, reichend von 10 µl bis 100 µl, können verwendet werden. Das markierte Reagenz kann mit dem Standard oder der Probe vor der Hinzufügung zu verschiedenen Stellen/Flächen der Membran in der Vorrichtung vorgemischt werden, oder es kann nach der Hinzufügung von Standard oder Probe addiert werden. Mehr als ein spezifischer Antikörper kann in der gleichen oder in verschiedenen Flächen für den gleichzeitigen Nachweis von mehrfachen Analyten in einer Probe mit einer einzigen Assayvorrichtung immobilisiert werden.

Nach der Hinzufügung von Probe und Reagenzien wird der absorbierende Körper verworfen und die Reaktionsmembran wird direkt mit Hilfe einer Waschflasche über der Vorrichtung gewaschen. Weiterhin werden für eine hohe Empfindlichkeit Elemente der Signalverstärkung zusätzlich zugefügt. Eine Signalverstärkungsmethode wie Super-CARD wird angewandt, worin biotinyliertes Tyramin direkt über der Reaktionsmembran in der Vorrichtung zugefügt wird. Dann wird ein frischer, vorgefeuchteter absorbierender Körper zusammengebaut und Avidin- Peroxidase Konjugat zugefügt und gewaschen. Dann folgt Substratlösung, die direkt über der Reaktionsmembran hinzugefügt wird, um innerhalb einer gut definierten Fläche Farbflecken zu produzieren. Die ausgesetzte (freie) Fläche der Reaktionsmembran ist genügend größer um die Sichtbarmachung der Intensität der Farbflecken zu ermöglichen. Der visuelle Vergleich mit bekannten Konzentrationen des Referenzstandards ergibt eine halbquantitative Schätzung der Menge von Antigen in der Probe. Ein Signalverstärkungsschritt ist nicht nötig für den Analyten, der in hoher Konzentration anwesend ist. Die Assayergebnisse können abhängig vom verwendeten Assayformat innerhalb von 3 bis 10 Minuten erhalten werden. Eine die Vorrichtung benutzende Assaymethode kann für Analyten umfassend Antigene, Antikörper, Haptene, Arzneimittel, Hormone, Makromoleküle, Toxine, Bakterien, Viren, Enzyme, Tumormarker, die Umwelt verschmutzende Substanzen und Nukleinsäuren entwickelt werden.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Diese Erfindung liefert eine verbesserte Assayvorrichtung, deren Konstruktionsformat verglichen mit Vorrichtungen aus dem Stand der Technik relativ einfach ist, deren Materialkosten niedriger und deren Herstellungsprozess einfacher ist. Der absorbierende Körper ist nicht permanent mit der Vorrichtung verbunden, sondern wird während des Assay zusammengebaut. Ursprünglich wird der absorbierende Körper mit einer Flüssigkeit wie Wasser, Puffer befeuchtet und unterhalb der Reaktionsmembran positioniert, gepresst, wodurch nicht nur das erforderliche Hohlraumvolumen der reaktiven Membran im wesentlichen gefüllt wird, aber auch ein Netzwerk von kapillaren Kanälen mit dem absorbierenden Körper gebildet wird. Dies stellt den fokussierten, nach unten gerichteten Fluss der aufgebrachten flüssigen Probe oder Reagenzien ohne irgendeine Kraft sicher und erlaubt auch nicht die nach außen gerichtete Diffusion von teuren markierten Reagenzien. Weiterhin ermöglicht das Konstruktionsformat der Vorrichtung das Wegwerfen von verwendeten absorbierenden Körpern und die Verwendung von neuen, wodurch die Anwendung von Signal-verstärkenden Reagenzien für die Verbesserung der Empfindlichkeit des Assay ermöglicht wird.

Die vorliegende Erfindung ist nützlich für den Assay für eine weite Vielzahl von Analyten in nahezu allen Arten von Proben, die eine Flüssigkeit sind, in flüssige Form gebracht werden können, oder die in einer Flüssigkeit suspendiert werden können. Die Vorrichtung kann in Testkits eingebunden werden und Assaymethoden, welche die Vorrichtung benutzen, können abhängig vom Erfordernis in konventionellem oder ultrasensitivem Format entwickelt werden. Die Ergebnisse können abhängig vom benutzten Format innerhalb von 3 bis 8 Minuten erhalten werden. Die analytische Vorrichtung wird ihre größte Anwendung für biologische Proben finden, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel und ähnliche. Anwendungen werden auch gefunden für Industrie-, Umwelt- und Lebensmittelproben.

Der nachzuweisende Analyt kann nahezu jede Verbindung oder andere Substanz sein, die immunologisch nachgewiesen werden kann. D. h., dass der Analyt oder ein Teil davon antigenisch oder haptenisch mit mindestens einer determinanten Stelle sein wird, oder er wird ein Mitglied eines natürlich vorkommenden Bindungspaares sein, z. B. Kohlenhydrate und Lectin, Hormone und Rezeptor, komplementäre Nukleinsäuren, und ähnliche Analyten von besonderem Interesse umfassen Antigene, Antikörper, Proteine, Kohlenhydrate, Haptene, Arzneimittel, Hormone, Makromoleküle, Toxine, Bakterien, Viren, Enzyme, Tumormarker, Nukleinsäuren, und ähnliche, obwohl auch andere Substanztypen nachgewiesen werden können.

Der Nachweis von Aflatoxin B₁, einem kleinen Molekül, und von menschlichem IgG sind im nachfolgenden Beispielteil beispielhaft dargestellt.

Die analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst eine mikroporöse Membran, welche an einem Ende über einer halbsteifen, flüssigkeitsundurchlässigen Blatt befestigt ist. Ein wasserunlöslicher Klebstoff wird zur Befestigung einer Reaktionsmembran verwendet, welche daran gebunden einen Antikörper oder Antigen aufweist. Der zweite Teil, ein absorbierender Körper, ist eine separate Komponente, die größer als die mikroporöse Membran ist und während des Assay auf solch eine Weise zusammengebaut wird, dass sie an ihrer ebenen Oberfläche in engem Kontakt miteinander sind.

Die mikroporöse Membran der vorliegenden Erfindung hat den Zweck, den Analyten von der Probe zu trennen und zu immobilisieren, wenn er durch die Membran zum Absorbtionsmittel durchtritt. Die Größe der Membran ist nicht kritisch und eine größere Größe oder mehrfache Streifen können in einer einzelnen Vorrichtung verwendet werden, um eine Reihe von Proben zu analysieren. Die Membran sollte jedoch eine genügend große ausgesetzte Fläche haben, um die Sichtbarmachung jeder Probe oder von Kontrollen auf einem Teil von ihr zu ermöglichen, mit genügend Überschussoberfläche, sodass der Kontrast zwischen dem sichtbaren Signal und dem Rest der Membran leicht beobachtet werden kann. Die mikroporöse Membran kann aus einer großen Zahl von halbdurchlässigen Membranmaterialien gebildet werden, einschließlich Nitrocellulose, Polyvinylidendifluorid, Nylon, Papier, und ähnlichen. Der durchschnittliche Porendurchmesser des Materials ist üblicherweise nicht kritisch, obwohl Materialien mit besonderen Porendurchmessern für besondere Assays ausgesucht werden können. Jedoch hat die Porosität der Membran einen großen Einfluss auf die Flussgeschwindigkeit der Flüssigkeit und die Empfindlichkeit des Assay. Je größer die Porengrößen der Membran, desto schneller die Flussgeschwindigkeit für eine gegebene Flüssigkeit. Wenn die Flussgeschwindigkeit zunimmt, nimmt die Zeit für die Wechselwirkung zwischen den Zielmolekülen in der Probe und dem auf der Reaktionsmembran immobilisierten Antikörper erhältliche Zeit ab, wodurch die Assayempfindlichkeit herabgesetzt wird. Für die meisten Assays liegt die Porosität der Membran vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0.22 bis ungefähr 3 µm. Für die meisten Anwendungen werden spezifische Bindesubstanzen wie Antikörper an die Membran gebunden sein, um die Trennung (Abtrennung) des interessierenden Analyten zu erleichtern.

Eine wichtige bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Auswahl einer Nitrocellulosemembran als Trägermaterial. Dies hat einen beträchtlichen Vorteil, weil es eine natürliche Fähigkeit hat, Proteine zu binden, ohne dass zuvor eine Sensibilisierung erforderlich ist. Solche spezifischen Bindesubstanzen sind gewöhnliche Antikörper, die fähig sind, Antigene und Haptene zu binden, obwohl Antigene, Hormonrezeptoren, Lectin, Polysaccharide, Nukleinsäuren und andere natürliche Rezeptoren und "legends" können ebenfalls Verwendung finden. Methoden für die Bindung der spezifischen Bindesubstanzen an die Nitrocellulosemembran sind gut bekannt und umfassend in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Ungenutzte Bindestellen auf der Nitrocellulose können daher mit Blockierungsproteinen wie Casein, BSA oder Gelatine blockiert werden. Elektronenreiche Blockierungsproteine wie p-Hydroxyphenylpropionsäure-Casein, p-Hydroxyphenylpropionsäure-Gelatine-Konjugat werden zur Blockierung von freien Stellen auf der Nitrocellulosemembran für den ultrasensitiven Nachweis von Analyten für die Anwendung von Super-CARD Signalverstärkung verwendet (Journal of Immunological Methods, 227, 31, 1999).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die specifischen Bindesubstanzen in gleichförmiger Konzentration als mehrfache Flecken über der gesamte Membranoberfläche immobilisiert oder unter bestimmten Umständen kann es erwünscht sein, die Substanzen über die gesamte Membranoberfläche zu binden. Die Fleckennäherung ist bevorzugt, weil Probe und markierte Reagenzien in einer einzigen Region konzentriert werden, wodurch ein besser unterscheidbares Endproduktsignal geliefert wird. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform kann es erwünscht sein, manchmal mehr als eine spezifische Bindesubstanz an der selben oder an verschiedenen Stellen der Membran zu binden, für den gleichzeitigen Nachweis von mehrfachen Analyten in einer Probe mit einer einzelnen Assayvorrichtung.

Die analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin eine halbsteife flüssigkeitsundurchlässige Bodenträgerschicht. Die Reaktionsmembran wird über der halbsteifen Trägerschicht platziert und ein Ende ist entlang der breiten Seite durch die untere Oberfläche befestigt. Die Größe der Bodenträgerschicht ist wesentlich größer als die der reaktiven Membran und des absorbierenden Körpers. Die Bodenträgerschicht besteht üblicherweise aus Plastik, Polyethylen, Polyester und ähnlichen. Die Auswahl von geeigneten Materialien mit angemessener mechanischer Stärke als unterstützender Halt ist für die Erfindung wichtig.

Unerwünschtes Biegen der Assayvorrichtung kann geschehen, wenn ein schwacher Halt oder eine unangemessene mechanische Stärke der Bodentägerschicht verwendet wird. Wie bereits bemerkt wurde, bestehen typische analytische Vorrichtungen aus dem Stand der Technik aus einem oberen und unteren Gehäuseteil, welche miteinander verbunden werden, um Reaktionsmembran und absorbierenden Körper während der Kompression an Ort und Stelle zu halten. Weil Reaktionsmembran und absorbierender Körper zwei unabhängige Komponenten der Vorrichtung sind, und der absorbierende Körper nur während des Assay platziert wird, gibt es keine Notwendigkeit für die Verwendung von verbundenen oder auf sonstige Weise versiegelten oberen und unteren Gehäuseteilen. Die Bodenträgerschicht unterstützt die Reaktionsmembran während des Transits und die Handhabung der Membran während des Assay wird einfacher. Die für die Bodenträgerschicht verwendeten Materialien könnten auch verwendet werden, um eine oberste Trägerschicht zur Bedeckung der Membran zur Verfügung zu stellen, obwohl es verschieden sein kann.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können für die Analyse einer Reihe von Proben mehrfache mikroporöse Membranstreifen oder solche, die in einem Stück mehrfache reaktive Stellen haben, über der festen Trägerschicht befestigt sein. Alternativ kann zwischen der Membran und der festen Trägerschicht ein schmaler fester Streifen, der üblicherweise aus irgendeinem wasserundurchlässigen Material bestehen kann, befestigt sein, um genügend Raum bereitzustellen für den absorbierenden Körper, der während des Assay unterhalb der Reaktionsmembran platziert werden soll. Dasselbe Material als feste Trägerschicht, die eine ähnliche oder höhere Dicke als das absorbierende Material hat, kann verwendet werden. Nachdem die Vorrichtung konstruiert worden war, kann die oberste feste Trägerschicht mit einem Kennzeichen oder Barcode markiert werden, um den Testtyp anzugeben, für den die Vorrichtung benutzt werden soll.

In einer weiteren Ausführungsform der erfinderischen Vorrichtung wird der absorbierende Körper nicht mit der Reaktionsmembran zusammengefügt, indem während der Herstellung Kompression oder Klebstoff verwendet werden. Sie werden getrennt zur Verfügung gestellt und vor der Fortsetzung mit dem nächsten Schritt verworfen. Falls durch das Assayprotokoll erforderlich, wird zusätzlicher Absorptionskörper zur Verfügung gestellt. In einer weiteren Ausführungsform der analytischen Vorrichtung wird zusätzlicher Absorptionskörper gemäß der oben beschriebenen Methode für die Hinzufügung von Elementen von Signalverstärkungssystemen benutzt.

Das Haupterfordernis für das absorbierende feste Material ist, dass es in der Lage ist, Flüssigkeiten zu absorbieren. Jedes konventionell verwendete absorbierende Material, das die Fähigkeit zur Flüssigkeitsabsorption hat, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nützliche bekannte Materialien umfassen Celluloseacetatfilter, Polyester oder andere solcher Materialien. Schichten von kommerziell erhältlichem Filterpapier oder Toilettenpapier können verwendet werden. Die Dicke des absorbierenden Körpers (d. h., Seitenwand ("side-wall"), welches der Abstand zwischen der oberen und unteren Oberfläche des absorbierenden Materials ist) kann in Abhängigkeit von dem für einen gegebenen Immunoassay notwendigen Hohlraumvolumen ("void volume") variieren. Typischerweise beträgt die Dicke von ungefähr 0.1 mm bis ungefähr 8 mm und mehr. Die Oberfläche des absorbierenden Körpers ist gewöhnlich größer als jene der Reaktionsmembran, aber kleiner als die der Bodenträgerschicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der benutzte absorbierende Körper ungefähr fünffach größer als die Größe der Reaktionsmembran. In der beispielhaften Ausführungsform umfasst der absorbierende Körper Whatman Filterpapier Nr. 3.

In der Methode der vorliegenden Erfindung wird der mit der analytischen Vorrichtung zur Verfügung gestellte absorbierende Körper zuerst mit überschüssiger Flüssigkeit wie entionisiertem Wasser, Puffer oder ähnlichem durchtränkt. Der befeuchtete absorbierende Körper wird mit der analytischen Vorrichtung so zusammengesetzt, dass die obere Oberfläche des absorbierenden Körper in engem Kontakt mit der unteren Oberfläche der Reaktionsmembran ist und die untere Oberfläche über der Bodenträgerschicht ist. Die obere Oberfläche der Reaktionsmembran wird dann mit einem kleinen Roller oder einem randlosen Reagenzglas auf solche Weise gedrückt, dass die zwischen der unteren und oberen Fläche von Reaktionsmembran und absorbierendem Körper eingeschlossene Luft entfernt wird. Unter diesen Umständen ist das Hohlraumvolumen der reaktiven Membran gesättigt und der Abstand, welcher die reaktive Membran und den absorbierenden Körper voneinander trennt ist derart, dass sich Netzwerke aus kapillaren Kanälen dort bilden, wo die beiden Teile in Kontakt sind. Die befeuchtete Reaktionsmembran und der absorbierende Körper erlauben es der Flüssigkeit der Probe oder von Reagenzien nicht, seitlich über die Reaktionsmembran in den absorbierenden Körper zu fließen. In der Methode der vorliegenden Erfindung erfolgt der Fluss von Probe oder Reagenz immer nach unten und fokussiert ohne Anwendung von irgendeiner Kraft auf den absorbierenden Körper, so dass teure markierte Reagenzien effizient genutzt werden können. Das Hohlraumvolumen des befeuchteten absorbierenden Körpers ist noch genügend um im wesentlichen das zusätzliche Volumen zu füllen, das während des Assay eingeführt wird, und erfüllen dadurch die Funktion einer Flüssigkeit aufnehmenden Zone. Das Befeuchten des absorbierenden Körpers hat einen großen Einfluss auf die Flussrate der Flüssigkeit und die Empfindlichkeit des Assay. Überschüssiges Befeuchten des absorbierenden Körpers reduziert die Flussgeschwindigkeit, wodurch sich die Flüssigkeit ausbreiten kann. Wenn weniger befeuchtet wird, nimmt die Flussgeschwindigkeit zu, was die Wechselwirkung zwischen den Zielmolekülen in der Probe und dem immobilisierten Antikörper auf der Reaktionsmembran herabsetzt, wodurch die Empfindlichkeit herabgesetzt wird.

Die Immunoassays, welche die analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung benutzen, können sehr einfach und schnell sein, können qualitativ oder quantitativ sein. Viele verschiedene Typen von Immunoassays, die in der Technik bekannt sind, können unter Verwendung dieser analytischen Vorrichtungen durchgeführt werden. Das Immunoassay-Format hängt vom Typ des nachzuweisenden Analyten ab.

Verschiedene Nachweisreagenzien können verwendet werden, um die Assayempfindlichkeit weiter zu vereinfachen und zu verbessern. Direkte Marker wie Goldsole und Farblösungen können ebenfalls verwendet werden. Methoden sind bereits im Stand der Technik bekannt. Die die Vorrichtung benutzende Assaymethode kann je nach Erfordernis in konventionellem oder ultrasensitiven Format sein. Der einzelne absorbierende Körper wird für die Zugabe von Standards oder Probe und markiertem Reagenz verwendet. Das Markierungsreagenz kann vor der Hinzufügung zu verschiedenen Stellen der Membran in der Vorrichtung mit Standard oder Probe vorgemischt sein oder es kann nach der Zugabe von Standard oder Probe hinzugefügt werden. Im ultrasensitiven Format wird der absorbierende Körper nach dem konventionellen Immunoassay entfernt und die Membranoberfläche in der analytischen Vorrichtung wird direkt gewaschen. Diesem folgt die Zugabe von Signalverstärkungsreagenz, direkt und/oder Verwendung eines neuen absorbierenden Körpers, der mit der Vorrichtung zur Verfügung gestellt wird. Beispielsweise wird für die Super-CARD-Signalverstärkungsmethode eine Lösung von biotinyliertem Tyramin direkt über der Membran ohne absorbierenden Körper hinzugefügt und mit Waschpuffer gewaschen. Dann wird gemäß der oben beschriebenen Methode ein neuer absorbierender Körper zusammengebaut und Avidin-Peroxidase wird über der Reaktionsmembran zugefügt. Visueller Vergleich der Farbintensität der Flecken mit solchen bekannter Konzentration an Referenzstandard ergeben eine halbquantitative Abschätzung der Menge an in der Probe vorhandenem Antigen.

Sämtliche zitierten Dokumente sind durch ihre Bezugnahme vollständig einbezogen. Die folgenden Beispiele und Zeichnungen dienen nur Illustrationszwecken und sollen nicht als den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend gedeutet werden.

Beispiel 1 Konventioneller Assay für Aflatoxin B₁ unter Verwendung der vorliegenden Erfindung

A) Antikörper für Aflatoxin B₁. Das Immunogen, Aflatoxin B₁-O-Carboxymethyloxim- BSA-Konjugat wurde nach einer Standardmethode unter Verwendung einer Stöchiometrie von 20 : 1 Aflatoxin B₁-Derivat: Protein hergestellt. Das Immunogen wurde zusammen mit Freunds Adjuvans in Hasen injiziert und ein hoch spezifisches Antiserum erhalten. Die Gammaglobulinfraktion dieses Antiserums wurde durch wiederholte Fällung mit Ammoniumsulfat, gefolgt von Dialyse gegen Phosphatpuffersalzlösung gereinigt. Es wurde dann durch eine BSA-Sepharose 4B-Immunosorbent-Säule geleitet, um anti-BSA-Antikörper zu entfernen.
B) Herstellung der Testvorrichtung. Schleich mit einer Porengröße von 0.45 µm wird in ein rechteckiges Stück (14 mm × 70 mm) geschnitten und mit einem Bleistift mit "14 × 14 mm" markiert (Fig. 1A). Die Membran kann auch in Streifen geschnitten werden (14 × 70 mm) und mit einem Bleistift mit 14 × 14 mm markiert werden (Fig. 1B). Die Membran wird dann unter leichtem Schütteln für 5 Minuten in Blottingpuffer (Tris-HCl, 20 mM, pH 8.0, enthaltend 0.9% NaCl) getaucht. Die Streifen wurden dann halb getrocknet und mit einem Dispenser (Hamilton) an vielfachen Stellen im Abstand von 1.4 cm mit 5 µl Hasen-Antikörper-gegen Aflatoxin B1, 100-fach verdünnt in Tris-gepufferter Salzlösung (0,05 M, pH 8.0), betüpfelt. Das obere 14 mm Quadrat auf der breiten Seite der rechtwinkligen Membran wurde wegen der Befestigung an halbsteifes Material nicht betüpfelt. Nach Trocknen der Membran bei Raumtemperatur für 15 Minuten wurde es weiter getrocknet durch Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Die freien Stellen des Membranstreifens wurden durch Inkubation mit 0.4% Casein in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (0.05 M, pH 9.6) während einer Stunde bei 22 bis 26°C unter leichtem Schütteln blockiert. Die Membranstreifen wurden dann dreimal mit Waschpuffer (Tris-HCl-Puffer, 20 mM, pH 8.0), enthaltend 29 g/l NaCl und 0.5% Tween 20) gewaschen. Schließlich wurden die Membranen mit 0.1% Thimerosal gespült und dann bei Raumtemperatur für 15 Minuten und 37°C für 30 Minuten getrocknet. Diese Membranen können bis zur Verwendung in einem Exsikkator gelagert werden.
Um die Testvorrichtung zusammenzubauen, wurde ein halbsteifes Material wie ein Polyethylenblatt (140 × 120 mm) mit einer Dicke von ungefähr 0.005 bis 0.030 Zoll genommen (Fig. 1D). In der nicht betüpfelten Eckenspitze der Membran wird eine 4 mm- Schicht wasserunlöslichen Klebers aufgebracht. Die Membran wird dann in einem Abstand von 15 mm von der Spitze auf der breiten Seite über das rechteckige Polyethylenblatt platziert (Fig. 2). Klebeband, das auf beiden Seiten Klebstoff aufweist, kann ebenfalls zur Befestigung der Membran verwendet werden.
Alternativ kann ein schmaler fester Streifen aus einem flüssigkeitsundurchlässigen Körper, der zwischen Membran und halbsteifer Trägerschicht platziert ist, verwendet werden, wobei durch wasserunlöslichen Klebstoff die obere Oberfläche an einen Teil der unteren Oberfläche besagter Membran in der breiten Ecke und die niedrigere Oberfläche an der Bodenträgerschicht befestigt ist (Fig. 3).
Ein rechteckiges Stück Filterpapier (Whatman Nr. 3) mit den Maßen 125 × 110 mm (Fig. 1E) wird aus dem Filterpapierblatt für die Verwendung während des Assay ausgeschnitten. Diese analytische Vorrichtung kann in einem Exsikkator gelagert werden.
C) Enzym-Konjugat-Herstellung. Aflatoxin B₁-O-Carboxymethyloxim-Meerrettich- Peroxidase-Konjugat wurde nach einer Standardmethode unter Verwendung einer Stöchiometrie von 5 : 1 Aflatoxin B₁-Derivat : Peroxidase hergestellt. Es wurde durch Dialyse gefolgt von Chromatographie an Sephadex G-50 gereinigt. Nach Hinzufügung von BSA, 20 g/l, wurde eine Arbeitslösung von Enzymkonjugat (1 : 100) in Phosphatpuffer (0.05 M, pH 7.6, enthaltend pro Liter 0.9% NaCl, 0.4% BSA und 0.01% Thimerosal) zubereitet.
D) Probenvorbereitung. Die infizierten Samen wurden für eine Stunde bei 22 bis 26°C in Wasser eingeweicht und auf Filterpapier getrocknet. Die Samen (1 g) wurden in Methanol (1 ml) homogenisiert und bei 10,000 Umdrehungen pro Minute während 15 Minuten zentrifugiert. Das Überstehende wurde im Assay verwendet, indem 1000-fach mit Assaypuffer verdünnt wird (Tris-HCl-Puffer, 0.05 M, pH 8.0, enthaltend 0.9% NaCl, 0.02% BSA und 0.01% Thimerosal).
E) Aflatoxin B₁-Standards. Aflatoxin B₁-Vorratsstandardlösung (0.25 mg/ml in Acetonitril) wurde bei -20°C gelagert und die Arbeitsstandardlösung (0.25 pg, 50 pg und 100 pg/25 µl) wurde durch Verdünnen mit Assaypuffer hergestellt.
F) Substratlösung. 3,3'-Diaminobenzidin (15 mg) und Imidazol (201 mg) wurde in 30 ml Tris-HCl-Puffer (0,05 M, pH 8.0) gelöst und 0.001% H2O2 wurden hinzugefügt. Die Lösung wurde bis zur Verwendung im Dunkeln aufbewahrt.
G) Verfahren für das Testen der Anwesenheit von Aflatoxin B₁ in Proben (Zwei Stufen). Ein rechteckiges Stück Filterpapier (Fig. 1E) wurde mit destilliertem Wasser befeuchtet und zwischen Membran und Polyethylenblatt der Testvorrichtung platziert (Fig. 4 oder 5). Die zwischen Membran und Filterpapier eingeschlossene Luft wurde durch Drehen einer randlosen Glasröhre über dem Membranstreifen entfernt. Standard oder Probe (25 µl) wurde langsam über verschiedene mit Antikörper getüpfelte Flächen der Membran hinzugefügt. Die Lösung wird aufgrund der kapillaren Aktion, die durch das Filterpapier erzeugt wird, absorbiert. Jetzt werden über jeder betüpfelten Fläche, zu der Standard oder Proben hinzugefügt worden waren, 25 µl AFB₁-HRP-Konjugat (1 : 1000) in Assaypuffer zugefügt. Das Filterpapier wird entfernt und die Membran eingehend mit Waschpuffer gewaschen. Substratlösung (DAB) wird über der Membran zugefügt und für 1 Minute inkubiert und mit Wasser gewaschen. Die Sichtbarmachung der Intensität der Farbflecken im Vergleich mit bekannten Konzentrationen an Referenzstandard gibt eine Vorstellung von der Menge des in der Probe vorhandenen Antigens. Die Assayempfindlichkeit wird zu 20 pg/25 µl Aflatoxin B₁ bestimmt.

Beispiel 2

Es wurde derselben Prozedur gefolgt wie in Beispiel 1(A), 1(B), 1(C), 1(D), 1(E), 1(F) mit der Ausnahme, dass in 1(F) Standards 50, 100 und 200 pg/25 µl benutzt wurden. Standard oder Proben werden in gleichen Anteilen mit AFB₁-HRP-Konjugat (1 : 500) gemischt und 25 µl wurden über die mit AFB₁-Antikörper betupfte Fläche gegeben. Die mit dieser Einschrittmethode erhaltenen Ergebnisse waren nahezu ähnlich denen der Zweischrittmethode.

Beispiel 3

Es wird derselben Prozedur gefolgt wie in Beispiel 2, mit dem Unterschied, dass Standard oder Proben in gleichen Anteilen mit 1000-fachem AFB₁-HRP-Konjugat gemischt wird und 25 µl jeder Mischung zweifach über der mit AFB₁-Antikörper betüpfelten Fläche zugefügt wurden. Die mit dieser Methode erhaltenen Ergebnisse waren nahezu ähnlich mit den in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen.

Beispiel 4 Ultrasensitiver Assay für Aflatoxin B₁ unter Verwendung der vorliegenden Erfindung

A) Herstellung von 3-(p-Hydroxyphenyl)-propionsäure-Casein-Konjugat (p-OH-PPA- Casein). Casein (1 Gramm), aufgelöst in 30 ml Natriumbicarbonat (150 mmol/l) wurde tropfenweise unter Rühren zu 300 mg p-OH-PPA-N-Hydroxysuccinimid, aufgelöst in trockenem Dimethylformamid, zugefügt. Die Reaktionsmischungen wurden kontinuierlich während drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann extensiv gegen destilliertes Wasser und anschließend gegen Phosphatpuffer (20 mmol/l, pH 7.6) dialysiert. Das erhaltene p-OH-PPA-Casein-Konjugat wurde zentrifugiert, um die leichte Trübung zu entfernen, und dann lyophilisiert
B) Herstellung von biotinyliertem Tyramin. Eine Lösung von Biotin (100 mg) in einer Mischung von trockenem Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid (1 : 2.3) wurde über Nacht bei 4°C mit N-Hydroxysuccinimid (70 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Die aktivierte Esterlösung wurde zur Entfernung von Harnstoff filtriert und zu einer Lösung von Tyraminhydrochlorid (60 mg) in 1 ml Dimethylformamid gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht in Gegenwart von pulverisiertem festen Natriumcarbonat gerührt und filtriert. Die resultierende Lösung (3 ml) wurde in gleiche Mengen aufgeteilt und bei -20°C gelagert. Eine Arbeitslösung (200 µmol/l in destilliertem Wasser) wurde hergestellt und bei 4°C gelagert. Im Assay wurde die Arbeitslösung von biotinyliertem Tyramin zweifach mit Boratpuffer (0.2 M, pH 8.0, enthaltend 0.008% H₂O₂) verdünnt und direkt verwendet.
C) Herstellung der Testvorrichtung. Schleich mit einer Porengröße von 0.45 µm wird in ein rechteckiges Stück (14 mm × 70 mm) geschnitten und mit einem Bleistift mit "14 × 14 mm" markiert (Fig. 1A). Die Membran kann auch in Streifen geschnitten werden (14 × 70 mm) und mit einem Bleistift im Abstand von 14 mm markiert werden (Fig. 1B). Die Membran wird dann unter leichtem Schütteln für S Minuten in Blottingpuffer (Tris-HCl, 20 mM, pH 8.0, enthaltend 0.9% NaCl) getaucht. Die Streifen wurden dann halb getrocknet und mit einem Dispenser (Hamilton) an vielfachen Stellen in der Mitte eines 14 mm Vierecks mit 5 µl Hasen-Antikörper-gegen Aflatoxin B₁, 2500-fach verdünnt in Tris-gepufferter Salzlösung (0.05 M, pH 8.0) ergänzt mit 25 µg/ml BSA, betüpfelt. Das obere l4 mm Quadrat auf der breiten Seite der rechtwinkligen Membran wurde wegen der Befestigung an halbsteifes Material nicht betüpfelt. Nach Trocknen der Membran bei Raumtemperatur für 15 Minuten wurde es weiter getrocknet durch Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Die freien Stellen des Membranstreifens wurden durch Inkubation mit 0.2% p-OH-PPA-Casein in Carbonat- Bicarbonat-Puffer (0.05 M, pH 9.6) während einer Stunde bei 22 bis 26°C unter leichtem Schütteln blockiert. Die Membranstreifen wurden dann dreimal mit Waschpuffer (Tris- HCl-Puffer, 20 mM, pH 8.0, enthaltend 29 g/l NaCl und 0.5% Tween 20) gewaschen. Schließlich wurden die Membranen mit 0.1% Thimerosal gespült und dann bei Raumtemperatur für 15 Minuten und bei 37°C für 30 Minuten getrocknet. Diese Membranen können in einem Exsikkator bis zur Verwendung gelagert werden.
Um die Testvorrichtung zusammenzubauen, wurde ein halbsteifes Material wie eine Polyethylenblatt (140 × 120 mm) mit einer Dicke von ungefähr 0.005 bis 0.030 Zoll genommen (Fig. 1D). Im nicht betüpfelten Eckenspitze der Membran wird eine 4 mm- Schicht wasserunlöslichen Kleber aufgebracht. Die Membran wird dann in einem Abstand von 15 mm von der Spitze über das rechteckige Polyethylenblatt platziert (Fig. 2). Klebeband, das auf beiden Seiten Klebstoff aufweist, kann ebenfalls zur Befestigung der Membran verwendet werden.
Alternativ kann ein schmaler fester Streifen aus einem flüssigkeitsundurchlässigen Körper, der zwischen Membran und halbsteifer Trägerschicht platziert ist, verwendet werden, wobei mit wasserunlöslichem Klebstoff die obere Oberfläche an einem Teil der unteren Oberfläche besagter Membran in der breiten Ecke und die niedrigere Oberfläche mit der Bodenträgerschicht befestigt ist (Fig. 3).
Ein rechteckiges Stück Filterpapier (Whatman Nr. 3) mit den Maßen 125 × 110 mm (Fig. 1E) wird aus dem Filterpapierblatt für die Verwendung während des Assay ausgeschnitten. Diese analytische Vorrichtung kann in einem Exsikkator gelagert werden.
D) Probenvorbereitung. Die infizierten Samen wurden für eine Stunde bei 22 bis 26°C in Wasser eingeweicht und auf Filterpapier getrocknet. Die Samen (1 g) wurden in Methanol (10 ml) homogenisiert und bei 10,000 Umdrehungen pro Minute während 15 Minuten zentrifugiert. Das Überstehende wurde im Assay verwendet, indem 20,000-fach mit Assaypuffer verdünnt wurde (Tris-HCl-Puffer, 0,05 M, pH 8.0, enthaltend 0.9% NaCl, 0.02% BSA und 0.01% Thimerosal).
E) Aflatoxin B₁-Standards. Aflatoxin B₁-Vorratsstandardlösung (0.25 mg/ml in Acetonitril) wurde bei -20°C gelagert und die Arbeitsstandardlösung (0.1 pg, 5 pg und 10 pg/25 µl) wurde durch Verdünnen mit Assaypuffer hergestellt.
F) Substratlösung. 4-Chlor-1-naphthol (15 mg) wurde in 6 ml Methanol aufgelöst und auf 30 ml mit Tris-HCl-Puffer (0.1 M, pH 8.0) verdünnt. Die Lösung wurde nach Hinzufügung von 0.001% H₂O₂ im Dunkeln aufbewahrt.
G) Verfahren für das Testen der Anwesenheit von Aflatoxin B₁ in Proben (Zwei Stufen). Ein rechteckiges Stück Filterpapier wurde mit destilliertem Wasser befeuchtet und zwischen Membran und Polyethylenblatt der Testvorrichtung platziert (Fig. 4 oder 5). Die zwischen Membran und Filterpapier eingeschlossene Luft wurde durch Drehen einer randlosen Glasröhre über dem Membranstreifen entfernt. Standard oder Probe (25 µl) wurde langsam über verschiedene, mit Antikörper getüpfelte Flächen der Membran hinzugefügt. Die Lösung wird aufgrund der kapillaren Aktion, die durch das Filterpapier erzeugt wird, sofort absorbiert. Jetzt werden über jeder betüpfelten Fläche, zu der Standard oder Proben hinzugefügt worden waren, 25 µl AFB₁-HRP-Konjugat (1 : 20,000) in Assaypuffer zugefügt. Das Filterpapier wird entfernt und die Membran eingehend mit Waschpuffer gewaschen. Zur Verstärkung wurden die Membranen mit einer Lösung von biotinyliertem Tyramin für zwei Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die Membranen wurden wieder mit Waschpuffer gewaschen. Dann wurde wieder ein rechteckiges Stück Filterpapier mit destilliertem Wasser befeuchtet und zwischen Membran und Polyethylenblatte der Testvorrichtung platziert. Die zwischen Membran und Filterpapier eingeschlossene Luft wurde durch Drehen einer randlosen Glasröhre über einem Membranstreifen gedreht. Avidin-HRP-Konjugat (gekauft von Sigma, St. Louis, USA) wurde mit Assaypuffer 500-fach verdünnt und 25 µl wurden jeweils über jeder anti-AFB1 betüpfelten Fläche zugegeben. Filterpapier wird entfernt und die Membran eingehend mit Waschpuffer gewaschen. Substratlösung (4CN) wird über der Membran zugefügt und für 2 Minuten inkubiert und mit Wasser gewaschen. Die Sichtbarmachung der Intensität der Farbflecken im Vergleich mit bekannten Konzentrationen an Referenzstandards ergibt eine Vorstellung von der Menge des in der Probe vorhandenen Antigens. Die Assayempfindlichkeit wird zu 0.5 pg/25 µl Aflatoxin B₁ bestimmt.

Beispiel 5

Die gleiche Prozedur wie in Beispiel 4(A), 4(B), 4(C), 4(D), 4(E), 4(F), und 4(G) wird befolgt, mit der Ausnahme, dass in 4(G) als Standards 2, 10 und 20 pg/25 µl verwendet wurden. Standard oder Proben wurden mit gleichen Anteilen AFB₁-HRP-Konjugat (1 : 10,000) gemischt und 25 µl wurden über der mit AFB1-Antikörper getüpfelten Fläche aufgegeben. Die bei dieser Einstufenmethode erhaltenen Ergebnisse zeigten eine etwas höhere Empfindlichkeit als jene der Zweistufenmethode.

Beispiel 6 Ultrasensitiver Assay für Humanes IgH unter Verwendung der vorliegenden Erfindung

Die analytische Vorrichtung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben zusammengebaut, außer das die Membran mittels einem Verdünner (Hamilton) mit 5 µl 1 : 100 Protein-A-Lösung (Vorrat 0.4 mg/l) in Natriumphosphatpuffer (10 mM, pH 7.6, enthaltend 137 mM NaCl, 0.02 KCl) getüpfelt wurde. Das Reagenz p-OH-PPA-Casein, biotinyliertes Tyramin und Substrat waren dieselben wie in Beispiel 4 beschrieben.

A) Humanes IgG-Standards. Eine Vorratslösung von humanem IgG (0.25 mg/ml in Assaypuffer) wurde mit Assaypuffer verdünnt, um Arbeitsstandards herzustellen: 62.5, 125, 250, 500 und 1000 ng/25 µl.
B) Assay-Verfahren. Der gleichen Prozedur wie in Beispiel 4 G beschrieben wurde gefolgt. Humanes IgG Standards (25 µl) wurden zu der Reaktionsmembran gefügt und deren vollständige Absorption erlaubt. Dann wurde 25 µl Protein A-HRP-Konjugat (Sigma, USA), 1 : 8000 in Tris-HCl-Puffer verdünnt (50 mM, pH 8.0, enthaltend 0.4% BSA), hinzugefügt und die vollständige Absorption erlaubt. Waschpuffer (1 ml) wurde zu der Reaktionsmembran zugefügt und dann mit Waschpuffer gewaschen, um nicht gebundene Reagenzien von der Membran zu entfernen. Jetzt wurden die Signalverstärkungsreagenzien zugefügt wie es in Beispiel 4G beschrieben ist. Eine Probe, die unbekannte Mengen an IgG enthält, wurde durch Vergleich mit der Standardkurve bestimmt (semiquantitativ). Dies belegt, dass die analytische Vorrichtung zum Nachweis geringer Konzentrationen an IgG bestimmt werden kann.

Beispiel 7

Eine analytische Vorrichtung wurde wie in Beispiel 6 beschrieben zusammengebaut. Serielle Verdünnung von normalem menschlichem Serum (1 : 500 bis 1 : 32,000) wurde in Natriumphosphatpuffer-Salzlösung, enthaltend 0.4% BSA, durchgeführt. 25 µl von jeder Verdünnung des menschlichen Serums wurden zu der Reaktionsmembran zugefügt und die vollständige Absorption erlaubt. 25 µl der Protein A-HRP-Konjugat-Lösung (1 : 8000), wie sie in Beispiel 6 beschrieben ist, wurden zu der Reaktionsmembran zugefügt und die vollständige Absorption erlaubt. Der Rest des Assay ist ähnlich dem in Beispiel 6 beschriebenen. Am Ende des Assay war bei einer 1 : 16,000 Verdünnung des normalen menschlichen Serums ein purpurner Fleck auf der analytischen Vorrichtung sichtbar, der die Anwesenheit und Nachweisbarkeit von IgG bei dieser Verdünnung unter Verwendung der analytischen Vorrichtung und der obigen Assayprozeduren anzeigte.

Vorteile

a) Die analytische Vorrichtung ist sehr kostengünstig und leicht herzustellen.
b) Die für die Konstruktion verwendeten Materialien sind billig und abgesehen von der Reaktionsmembran leicht in Schreibwarengeschäften erhältlich.
c) Der absorbierende Körper wird bei der Herstellung nicht unter Verwendung von Kompression oder Klebstoff mit der Reaktionsmembran zusammengefügt.
d) Der absorbierende Körper wird während des Assay zusammengebaut und wird nach der Verwendung vor der Fortsetzung mit dem nächsten Schritt weggeworfen.
e) Zusätzlicher absorbierender Körper wird, falls aufgrund des Assayprotokolls für die Zufügung von Elementen eines Signalverstärkungssystems erforderlich, zur Verfügung gestellt.
f) Die für die Durchführung von Immunoassays unter Verwendung der Vorrichtung entwickelte Methode ist einfach und erlaubt den Fluss von Probe und teuren markierten Reagenzien immer nach unten gerichtet und fokussiert ohne Anwendung irgendeiner Kraft auf den absorbierenden Körper.
g) Die Methode ist nützlich für den Assay einer breiten Vielzahl von Analyten.
h) Die Assays sind nicht instrumentell und können unter Feldbedingungen angewendet wer den.
i) Die Sichtbarmachung der Intensität der Farbflecken im Vergleich mit bekannten Konzentrationen von Referenzstandard gibt eine Vorstellung von der in der Probe vorhandenen Menge an Antigenen.
j) Die Empfindlichkeit der Methode kann durch Signalverstärkung erhöht werden.
k) Ergebnisse können in Abhängigkeit vom verwendeten Immunoassay-Format innerhalb von 3 bis 8 Minuten erhalten werden.
l) Ein Satz von Proben kann analysiert werden.
m) Direkte Marker wie Goldsole und Farblösungen können verwendet werden.
n) Geschicktes Personal wird zur Durchführung des Assay nicht benötigt.
o) Quantitative Ergebnisse sind durch Verwendung eines Gel-Dokumentationssystems möglich.

Claims

1. Eine analytische Vorrichtung für die Durchführung von Immunoassays zum Nachweis von Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend:

a) eine Reaktionsmembran, die flüssigkeitsdurchlässig und porös ist und eine obere und eine untere Oberfläche hat, wobei eine freiliegende Fläche der besagten oberen Oberfläche auf ihr immobilisiert einen Antikörper oder Antigen aufweist, der sich an den Zielanalyten binden kann, wobei besagter immobilisierter Antikörper oder Antigen in einer mehrfach getüpfeltenen Region besagter oberer Oberfläche konzentriert ist;
b) eine halbsteife, flüssigkeitsundurchlässige Bodenträgerschicht, worin ein Teil der unteren Oberfläche besagter Reaktionsmembran in der breiten Ecke, in der sich kein immobilisierter Antikörper oder Antigen aufweist, mittels eines wasserunlöslichen Klebstoffes oder Bandes mit Klebstoff auf beiden Seiten an der oberen Oberfläche der Trägerschicht befestigt ist, und
c) ein Körper aus absorbierendem Material, der Flüssigkeit absorbieren kann und eine obere und eine untere Oberfläche hat, getrennt zur Verfügung gestellt wird.

2. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie alternativ einen schmalen festen Streifen eines flüssigkeitsundurchlässigen Körpers, der zwischen der Reaktionsmembran und der halbsteifen Trägerschicht platziert ist, umfasst, wobei mittels einem wasserunlöslichen Klebstoff die obere Oberfläche an einem Teil der unteren Oberfläche von besagter Reaktionsmembran in der breiten Ecke und die untere Oberfläche an die Bodenträgerschicht befestigt sind.

3. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Größe und Peripherie besagter Reaktionsmembran viel kleiner als die besagter Bodenträgerschicht ist.

4. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die obere Oberfläche des besagten getrennt zur Verfügung gestellten absorbierenden Körpers sich über die Peripherie der besagten Reaktionsmembran erstreckt, aber kleiner ist als die besagte Bodenunterstützungsschicht.

5. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der absorbierende Körper bei der Herstellung nicht durch Kompression oder Klebstoffe mit der Reaktionsmembran zusammengefügt wurde.

6. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke des schmalen, festen Streifens ähnlich oder größer als die des absorbierenden Körpers ist.

7. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Reaktionsmembran nicht kritisch ist und größere Größen in einer einzigen Vorrichtung verwendet werden können, um eine Reihe von Proben durchzuführen.

8. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass mehrfache Streifen der Reaktionsmembran an der semirigiden Unterstützungsschicht befestigt werden können, um einen Immunoassay mit einer Reihe von Proben durchzuführen.

9. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Reaktionsmembran ausgewählt ist aus Nitrocellulose, anderen Arten von halbdurchlässigen Membranmaterialien einschließlich Nylon, Polyvinylidendifluorid und anderen ähnlichen Materialien.

10. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der durchschnittliche Durchmesser der Reaktionsmembran im Bereich von ungefähr 0.22 bis ungefähr 3 µm und vorzugsweise 0.45 µm liegt.

11. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die freie ("loose") Fläche der Reaktionsmembran auf sich immobilisiert einen Antikörper oder Antigen über die gesamte Membranoberfläche als mehrfache Punkte aufweist oder unter bestimmten Umständen ist es erwünscht, über die gesamte Membranoberfläche bei gleichförmiger Konzentration zu immobilisieren.

12. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage ist, mehr als einen spezifischen Antikörper an der Membran an derselben oder verschiedenen Flächen für den gleichzeitigen Nachweis von mehrfachen Analyten in einer Probe mit einer einzigen Assayvorrichtung zu immobilisieren.

13. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ungenutzten Bindestellen an der Nitrocellulose mit geeigneten Blockierungsproteinen ausgewählt aus Casein, BSA, Gelatine und anderen ähnlichen Materialien blockiert sind.

14. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für das ultrasensitive Format freie Bindestellen auf der Nitrocellulosemembran mit elektronenreichen Blockierungsproteinen wie p-Hydroxyphenylpropionsäure-Casein- Konjugat, p-Hydroxyphenylpropionsäure-Gelatine-Konjugat und anderen ähnlichen Materialien für die Anwendung von Super-CARD-Signalverstärkung blockiert sind.

15. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenträgerschicht mit adäquater mechanischer Stärke ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylen, Plastik und Fiberglas.

16. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmembran unter Verwendung von wasserunlöslichem Klebstoff, der im oberen 4 mm tieferen Teil der Membran aufgebracht ist, über der Bodenträgerschicht befestigt ist

17. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Klebeband, welches auf beiden Seiten Klebstoff aufweist, ebenso verwendet werden kann, um die Membran über der Bodenträgerschicht zu befestigen.

18. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der getrennt bereitgestellte absorbierende Körper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Celluloseacetat, Filterpapier, Toilettenpapier und anderen ähnlichen absorbierenden Materialien.

19. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke des besagten absorbierenden Körpers von 0.1 bis 8.0 mm und mehr beträgt.

20. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine einzelne analytische Vorrichtung mehr als einen wegwerfbaren absorbierenden Körper enthält.

21. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der absorbierende Körper für die Zufügung von Elementen von Signalverstärkungsreagenzien geändert wird.

22. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusammenbau des absorbierenden Körpers für die Durchführung des Immunoassay umfasst:

a) Tränken des absorbierenden Körpers mit Flüssigkeit und Zusammenbau auf solche Weise, dass die obere Oberfläche des absorbierenden Körpers in engem Kontakt mit der unteren Oberfläche der Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche über der Bodenträgerschicht ist,
b) Entfernen der zwischen unterer und oberer Oberfläche der Reaktionsmembran und absorbierendem Körper eingeschlossenen Luft durch Drücken der oberen Oberfläche der Reaktionsmembran,
c) das Hohlraumvolumen der Reaktionsmembran wird gesättigt und der Abstand, welcher die reaktive Membran vom absorbierenden Körper trennt ist derart, dass Netzwerke aus Kapillarkanälen dort gebildet werden, wo beide Teile im Kontakt miteinander sind,
d) der Fluss von angewandter Probe oder Reagenz ist immer nach unten gerichtet und fokussiert ohne Anwendung von irgendeiner Kraft auf den absorbierenden Körper, und
e) das Hohlraumvolumen des befeuchteten absorbierenden Körpers ist noch ausreichend, um im wesentlichen das zusätzliche Volumen an Flüssigkeit, das während des Assay eingeführt wurde, zu füllen.

23. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der absorbierende Körper in deionisiertem, destilliertem Wasser, Puffer und anderen ähnlichen Materialien getränkt wird.

24. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Oberfläche der Reaktionsmembran mit einem kleinen Roller, randlosen Reagenzglas und anderen ähnlichen Werkzeugen gedrückt wird.

25. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgefeuchtete absorbierende Körper das Hohlraumvolumen der Reaktionsmembran sättigt, welche dadurch das Ausbreiten von Probe oder Immunoassayreagenzien nicht erlaubt.

26. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass teure markierte Reagenzien kostengünstig verwendet werden.

27. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass 10 bis 100 µl Probe oder markierte Reagenzien verwendet werden.

28. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass 10 bis 100 µl Probe oder markierte Reagenzien mehrfach aufgebracht werden.

29. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Reagenz mit dem Standard oder der Probe vor der Hinzufügung zu verschiedenen Flächen der Membran in der Vorrichtung vorgemischt werden oder es kann nach der Zugabe von Standard oder Probe zugefügt werden.

30. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als ein spezifischer Antikörper an derselben oder verschiedenen Stellen für den gleichzeitigen Nachweis von mehrfachen Analyten in einer Probe mit einer einzigen Assayvorrichtung immobilisiert werden.

31. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der absorbierende Körper nach Aufbringung von Proben und Reagenzien weggeworfen wird.

32. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmembran direkt über der Vorrichtung mit Hilfe einer Waschflasche gewaschen wird.

33. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass für eine hohe Empfindlichkeit weiterhin Elemente zur Signalverstärkung zugefügt werden.

34. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Signalverstärkungsmethode wie Super-CARD angewandt wird.

35. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass biotinyliertes Tyramin direkt über der Reaktionsmembran in der Vorrichtung zugefügt wird.

36. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein frischer vorgefeuchteter absorbierender Körper zusammengebaut und Avidin-Peroxidase- Konjugat zugefügt wird.

37. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die direkt über der Reaktionsmembran zugefügte Substratlösung innerhalb gut definierter Flächen Farbflecken erzeugt.

38. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die freie Fläche der Reaktionsmembran genügend größer ist, um die Sichtbarmachung der Intensität der Farbflecken zu ermöglichen.

39. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass der visuelle Vergleich mit bekannter Konzentration an Referenzstandards eine halbquantitative Abschätzung der Menge an in der Probe vorhandenen Antigenen ermöglicht.

40. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratlösung ohne Signalverstärkung direkt zugefügt wird.

41. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass ein Signalverstärkungsschritt nicht notwendig ist für den Analyten, der in hoher Konzentration vorliegt.

42. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22 und 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Assayergebnisse innerhalb von 3 bis 10 Minuten erhalten werden.

43. Analytische Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Arzneimitteln, Hormonen, Makromolekülen, Toxinen, Bakterien, Viren, Enzymen, Tumormarkern, umweltverschmutzenden Substanzen, Nukleinsäuren und anderen natürlichen Rezeptoren.