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Allgemeiner
Stand der Technik
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Das
technische Gebiet dieser Erfindung betrifft analytische Vorrichtungen
zur Verwendung beim Bestimmen der Anwesenheit einer bindbaren Zielsubstanz
(z.B. Analyt) in einer flüssigen
Probe, die vermutlich eine derartige Substanz enthält. Zahlreiche
analytische Vorrichtungen in verschiedenen Konfigurationen wurden
für diesen
Zweck verwendet. Viele dieser Vorrichtungen gebrauchen Reaktionsmembranen,
auf denen ein Rezeptor, der fähig
ist, sich insbesondere an die Zielsubstanz zu binden, immobilisiert
ist. In dem Assay, der diese Arten von Vorrichtungen gebraucht,
wird typischerweise die zu prüfende
Probe auf die Reaktionsmembran angewandt. Wenn die Zielsubstanz
in der Probe anwesend ist, wird sie sich an den immobilisierten
Rezeptor binden. Verschiedene Verfahren werden verwendet, um zu bestimmen,
ob sich die Zielsubstanz an den Rezeptor gebunden hat, womit ihre
Anwesenheit in der Probe angezeigt wird. In einem gewöhnlich verwendeten Verfahren
wird ein Antikörper,
der fähig
ist, sich insbesondere an die Zielsubstanz zu binden und der an einer
erfassbaren Markierung befestigt ist, auf die Membran angewandt.
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Auf
Membranen basierende Immunassays und -vorrichtungen weisen stark
vereinfachte medizinische Diagnosen auf. In der Vergangenheit waren Enzyme-linked-immunosorbens-Assays
(ELISA) die häufigste
Art eines diagnostischen Assays. Diese Assays wurden in der Regel
von sachkundigen Technikern in einem klinischen Labor durchgeführt. Bei
einem typischen ELISA sind relativ lange Inkubationszeiten erforderlich.
Deswegen dauert es in der Regel über
eine Stunde, den Assay durchzuführen.
Zusätzlich
dazu sind ELISAs ausgelegt, um Proben schubweise zu prüfen. Deswegen
wird eine Probe im Allgemeinen nicht geprüft bis eine ausreichende Anzahl an
Proben zum Prüfen
erhalten wird. Als ein Ergebnis kann ein Patient bis zu Tagen nach
der Bereitstellung einer Probe keine Prüfungsergebnisse empfangen. Auf
Membranen basierende Immunassays weisen den Vorteil auf, dass sie
individuell oder schubweise durchgeführt werden können. Somit
können
auf Membranen basierende Immunassays in einem Behandlungszimmer
eines Arztes statt in einem klinischen Labor durchgeführt werden.
Individuelle Prüfungen
können
durchgeführt
und Ergebnisse erhalten werden, in der Regel unter 10 Minuten. Quantitative
Ergebnisse können
ebenfalls von besonderen Instrumenten, die ausgelegt sind, um die
Prüfungsergebnisse
zu lesen, bereitgestellt werden.
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Die
Empfindlichkeit der Immunassays der Art Reaktionsmembran (i.e. die
Eignung, sehr niedrige Niveaus der Zielsubstanz zu erfassen) kann
erhöht werden,
wenn die Probe durch die Reaktionsmembran konzentriert wird. Bei
einigen Vorrichtungen wird die Konzentration der Probe durch die
Reaktionsmembran durch Aufweisen eines absorbierenden Materials
unterhalb der Reaktionsmembran, das die Probe, die dem oberen Ende
der Membran zugefügt wird,
durch die Membran und in das absorbierende Material darunter zieht,
erreicht. Auf Membranen basierende Immunassays, die absorbierende
Materialien benutzen, um die Probe zu konzentrieren, werden in U.S.
Pat. Nr. 5,006,464 an Chur et al., U.S. Pat. Nr. 4,818,677 an Hay-Kaufman et al. und
U.S. Pat. Nr. 4,632,901 an Valkirs et al. und U.S. Pat. Nr. 5,185,127
an Vonk et al. beispielhaft erläutert.
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Die
Membran und das absorbierende Material der analytischen Vorrichtungen,
die in jedem der oben aufgezeigten Patente beschrieben werden, sind
in einem Kunststoffgehäuse
enthalten, dass ein oberes Element und ein unteres Element, die
unter Kompression miteinander verknüpft sind, um die Membran und
das absorbierende Material an der Verwendungsstelle und in Kontakt
zueinander zu halten, aufweist. Die Verwendung von hinreichend Kompression
erleichtert den Fluss der Probe durch die Membran nach unten. Wenn
nicht hinreichend Kompression vorhanden ist würde die Probe tendenziell lateral
durch die Membran fließen,
wodurch die Menge an Probe, die durch das Zentrum der Reaktionsmembran,
wo der Rezeptor in der Regel lokalisiert ist, fließt, reduziert
wird. Diese Arten von analytischen Vorrichtungen sind typischerweise
einzeln zusammengebaut, was den Herstellungsprozess kompliziert
und kostenaufwendig machen kann.
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Es
besteht ein kontinuierlicher Bedarf, auf Membranen basierende Immunassays
und analytische Vorrichtungen dafür, ebenso wie den Herstellungsprozess
der analytischen Vorrichtung weiter zu vereinfachen, um sie leichter
verwendbar und erschwinglicher zu machen, Dies trifft insbesondere
in Entwicklungsländern
zu, in denen ein einfacher, schneller, empfindlicher, spezifischer,
lagerstabiler und kostengünstiger
diagnostischer Assay und eine ebensolche analytische Vorrichtung
ideal wären.
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Zusammenfassung der Erfindung:
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine analytische Vorrichtung bereit,
die bei analytischen Assays wie etwa einem Immunassay zur Erfassung
einer bindbaren Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, die potentiell
diese Zielsubstanz enthält,
verwendet werden kann. In ihrer einfachsten Ausführungsform beinhaltet die analytische
Vorrichtung eine flüssigkeitsundurchlässige obere
Stützschicht,
die einen Rand um einen offenen Kanal definiert. Eine poröse Reaktionsmembran
mit einer oberen Fläche
und einer unteren Fläche
befindet sich nahe der oberen Stützschicht, so
dass ein Abschnitt der oberen Fläche
der Reaktionsmembran und der Rand ein die Probe aufnehmendes Loch
definieren. Die obere Fläche
der Reaktionsmembran ist durch wasserunlöslichen Kleber an der unteren
Fläche
der oberen Stützschicht
abgedichtet, um eine flüssigkeitsundurchlässige Dichtung dazwischen
zu bilden, wobei die flüssigkeitsundurchlässige Dichtung
in Abwesenheit der Kompression zwischen der oberen Stützschicht
und der unteren Stützschicht
aufrechterhalten wird. Ein absorbierender Körper steht nahe und in flüssiger Kommunikation
mit der unteren Fläche
der Reaktionsmembran.
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Die
analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren
eine flüssigkeitsundurchlässige untere
Stützschicht,
die an der unteren Fläche
des absorbierenden Körpers
befestigt ist, beinhalten.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine auseinander gezogene perspektivische Ansicht einer analytischen
Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung, die die Anordnung der Komponenten der Vorrichtung zeigt.
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2 ist
eine Draufsicht der analytischen Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
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3 ist
eine Querschnittsaufrissansicht der Schichten der analytischen Vorrichtung
aus 2 entlang der Ebene 3-3.
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4a–4d, 5a–5c, 6a–6c, 7a–7c, 8a–8c, 9a, 9b, 10a, 10b, 11a und 11b stellen
unterschiedliche Konfigurationen für die obere Stützschicht
und die Reaktionsmembran dar.
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12 stellt
eine schematische Darstellung der Herstellung für die analytische Vorrichtung
dar.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine einfache, leicht herzustellende
analytische Vorrichtung zur Verwendung bei empfindlichen analytischen
Assays zur Erfassung einer bindbaren Zielsubstanz in einer flüssigen Probe,
die möglicherweise
die Zielsubstanz enthält;
bereit. Ein wasserunlöslicher
Kleber wird verwendet, um eine Reaktionsmembran mit einem daran
gebundenen Rezeptor, der fähig
ist, sich an die Zielsubstanz zu binden, und einen absorbierenden Köper an eine
flüssigkeitsundurchlässige obere Stützschicht
zu kleben. Die Verwendung von wasserunlöslichem Kleber dient nicht
nur dem Zweck, die Vorrichtung strukturell zusammenzuhalten, sondern bildet
auch eine flüssigkeitsundurchlässige Dichtung, die
lateralen Fluss einer Flüssigkeitsprobe über die Fläche der
Membran in dem Ausmaß verhindert, dass
sie den Fluss der Probe durch die Membran nach unten und in das
absorbierende Material herbeiführt.
Diese Art von Dichtung zwischen den Membranen und die flüssigkeitsundurchlässige obere
Stützschicht
kann ebenfalls die Fließgeschwindigkeit
der Probe verlangsamen, die lateral durch die Membran fließt, wodurch
die Reaktionszeit zwischen der Zielsubstanz und dem Rezeptor erhöht wird,
was zu erhöhter Empfindlichkeit
führt.
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Analytische
Vorrichtungen des Stands der Technik beinhalten gepasste obere und
untere Gehäuseelemente,
die sich unter Kompression miteinander verknüpfen, wodurch die Membran zwischen dem
offenen Kanal und dem absorbierenden Material an der Verwendungsstelle
gehalten wird. Beispiele dieser Art analytischer Vorrichtung werden
in U.S. Pat. Nr. 4,632,901 und U.S. Pat. Nr. 5,185,127 bereitgestellt.
Während
derartige gepasste Gehäuseelemente
bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können,
macht die Verwendung eines wasserunlöslichen Klebers, um eine flüssigkeitsundurchlässige Abschirmung
zu bilden, die Verwendung von gepassten Gehäuseelementen unnötig. Bei
einer anderen Art analytischer Vorrichtung, die jedoch keine gepassten
Gehäuseelemente
verwendet, sind die oberen und unteren Stützschichten miteinander verschweißt, was
hinreichend Kompression verursacht, um die Reaktionsmembran an der
Verwendungsstelle zwischen dem offenen Kanal und dem absorbierenden
Material zu halten. Ein Beispiel dieser Art von Vorrichtung wird
in U.S. Pat. Nr. 4,818, 677 gezeigt. Während diese Art von Vorrichtung
wiederum verwendet werden kann, um die vorliegende Erfindung umzusetzen,
macht die Verwendung eines wasserunlöslichen Klebers dies unnötig.
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Ein
Vorteil, keine Kompression zu verwenden, um die Reaktionsmembran
an der Verwendungsstelle zwischen dem offenen Kanal und dem absorbierenden
Material zu halten, besteht darin, dass die obere Fläche der
Reaktionsmembran relativ flach bleibt nachdem die analytische Vorrichtung
zusammengebaut ist. Deshalb ist es wahrscheinlicher, dass die Probe
bei Verwendung, wenn die Probe der Reaktionsmembran zugefügt wird,
die gesamte freigelegte Fläche
der Reaktionsmembran gleichmäßig abdeckt.
Wenn zwei oder mehr Regionen von immobilisierten Rezeptoren auf
der Membran vorhanden sind, wird somit ungefähr das gleiche Volumen der Probe
durch jeden Rezeptorbereich gehen. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung
von Kompression, um eine flüssigkeitsundurchlässige Dichtung
zwischen dem Rand des offenen Kanals und der Reaktionsmembran zu
bilden, verursachen, dass die obere Fläche der Reaktionsmembran geringfügig konkav oder
kuppelförmig
wird. Wenn die Probe der Reaktionsmembran zugefügt wird, kann sie die gesamte Fläche der
Reaktionsmembran somit nicht gleichmäßig abdecken. Dies kann die
Vorrichtung für
einige Immunassays weniger geeignet machen, wo ein Bedarf an quantitativen
Ergebnissen besteht.
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Die
analytische Vorrichtung ist einfach in der Konstruktion und kann
unter Verwendung von leicht erhältlichen
Materialien gefertigt werden. Unter Bezugnahme auf 1 beinhaltet
die analytische Vorrichtung eine flüssigkeitsundurchlässige obere
Stützschicht
(10), die einen Rand (12) um einen offenen Kanal
(11) definiert. Eine poröse Reaktionsmembran (13)
ist unterhalb der oberen Stützschicht
lokalisiert, so dass, nachdem die Vorrichtung zusammengebaut ist,
ein die Probe aufnehmendes Loch von der freigelegten oberen Fläche (14)
der Reaktionsmembran und dem Rand (12) um den offenen Kanal
(11) definiert wird. Ein absorbierender Körper (15)
wird unterhalb der Reaktionsmembran lokalisiert. Die Vorrichtung
kann des Weiteren eine flüssigkeitsundurchlässige untere
Stützschicht
(16), die eine oberen Fläche in Kontakt mit der unteren
Fläche
des absorbierenden Körpers
aufweist, beinhalten.
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Die
obere Stützschicht
kann aus jedem beliebigen wasserundurchlässigen Material wie etwa Metall,
Kunststoff oder Keramik gebildet werden. Selbst wasserundurchlässig gemachtes
Papier (z.B. Ölpapier)
kann verwendet werden. Biegsame Kunststoffe sind besonders sachdienlich,
da sie preiswert und leicht zu handhaben sind und der Reaktionsmembran
und dem absorbierenden Körper
eine hinreichende Stütze
bieten. Zusätzlich
dazu kann biegsamer Kunststoff leicht geschnitten oder gelocht werden, um
den offenen Kanal zu bilden. Geeignete Kunststoffe umfassen Nylon,
Molar, Acrylplatten, Polyesterplatten, Polyvinylplatten usw.
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In
der einfachsten Ausführungsform
der Erfindung wird ein einzelner kreisförmiger offener Kanal in die
obere Stützschicht
geschnitten, wie in 1, 2, 4a und 5a dargestellt,
der offene Kanal kann jedoch von jeder beliebigen anderen Form sein.
Eine einzelne obere Stützschicht
kann ebenfalls mehr als einen offenen Kanal aufweisen, um bei dem Zusammenbau
mehrere die Probe aufnehmende Löcher
zu bilden. Dies ermöglicht
einer einzelnen analytischen Vorrichtung zum Prüfen von mehreren Analsten in
einer einzelnen Probe und/oder mehreren Proben verwendet zu werden.
Somit wird anerkannt werden, dass die Konfiguration der/des offenen Kanals/Kanäle abhängig von
der gedachten Verwendung der analytischen Vorrichtung variieren
kann.
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Die
poröse
Reaktionsmembran ist an der unteren Fläche der oberen Stützschicht
abgedichtet, so dass der Rand, der den offenen Kanal umgibt, und die
freigelegte untere Fläche
der Reaktionsmembran ein die Probe aufnehmendes Loch definieren.
Somit ist unter Bezugnahme auf 2, die eine
Ausführungsform
der analytischen Vorrichtung nach dem Zusammenbau darstellt, ein
Abschnitt der oberen Fläche
(14) der Reaktionsmembran freigelegt, so dass, wenn der
analytische Assay durchgeführt
wird, die zu prüfende
Probe und die Assayreagenzien der Reaktionsmembran direkt zugefügt werden
können. Die
Reaktionsmembran ist bemessen, um den offenen Kanal vollständig abzudecken.
Vorzugsweise wird die Reaktionsmembran von der gleichen Form sein
wie der offene Kanal und lediglich geringfügig größer bemessen als der offene
Kanal, so dass sie an der unteren Fläche der oberen Stützschicht
an dem Umfang des offenen Kanals abgedichtet werden kann. Die Form
der Reaktionsmembran und die Form des offenen Kanals können unterschiedlich
sein, wie in 4 und 6–8 gezeigt.
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4 bis 11 zeigen
einige der unbeschränkten
möglichen
Konfigurationen für
den offenen Kanal (11) der oberen Stützschicht (10) und
oberen Fläche (14)
der Reaktionsmembran (13). In der einfachsten Ausführungsform,
unter Bezugnahme auf 4a und 4c, weist
die obere Stützschicht
einen kreisförmigen
offenen Kanal auf, und die Reaktionsmembran ist ebenfalls kreisförmig. Wie
in 4c gezeigt muss die Reaktionsmembran jedoch nicht
von der gleichen Form sein wie der offene Kanal. Der größere Punkt
(22) in dem Zentrum der Reaktionsmembran stellt die Stelle
dar, an der der Rezeptor immobilisiert wird, und der kleinere Punkt
(23) stellt dar, wo eine Steuersubstanz lokalisiert ist.
Die relativen Formen und Größen des
Rezeptors und der Steuerbereiche sind nicht wichtig, solange sie
voneinander differenziert werden können. Positionsmarkierungen
auf der Fläche
der oberen Stützschicht
können
dies eher bewerkstelligen als die Verwendung von unterschiedlichen
Größen von
Rezeptor- und Steuerpunkten.
In einigen Situationen besteht möglicherweise
kein Bedarf an einem Steuerbereich auf der Reaktionsmembran. Somit
kann es zweckdienlich sein, dass der Rezeptor auf der gesamten freigelegten
Fläche
der Reaktionsmembran immobilisiert ist. Dies ist in 4d dargestellt,
wo der innere Kreis den freigelegten Abschnitt der oberen Fläche der
Reaktionsmembran repräsentiert
und der nicht schattierte Bereich außerhalb des inneren Kreises
den nicht freigelegten Abschnitt der Reaktionsmembran, der an die
untere Fläche
der oberen Stützschicht
geklebt ist, repräsentiert.
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Während Punkte
die einfachste Konfiguration zum Immobilisieren des Rezeptors und/oder
der Steuerungen sind, weil sie lediglich durch das Zufügen von
Tropfen der Rezeptor- und/oder Steuerreagenzien zu der/den Membranfläche(n) gebildet
werden können,
können
ebenfalls andere Formen verwendet werden. In U.S. Pat. Nr. 4,916,056,
bildet der Rezeptorbereich zum Beispiel einen Balken, und die negative
Steuerung bildet einen Balken, der den Rezeptorbalken kreuzt, so
dass, nachdem der Immunassay durchgeführt wird, ein „Minus"-Zeichen die Abwesenheit
der Zielsubstanz in der geprüften
Probe anzeigt und ein „positives" Zeichen die Anwesenheit der
Zielsubstanz in der Probe anzeigt. 11b stellt eine
Probemembran mit mehreren Rezeptoren, die in der Form von parallelen
Balken immobilisiert sind, dar.
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Wie
oben erwähnt,
können
mehrere die Probe aufnehmende Löcher
gebildet werden, wie in 8, 9 und 10 dargestellt,
so dass eine einzelne Probe durch Impfen eines Anteils der Probe
in jedes die Probe aufnehmende Loch und Durchführen eines separaten Assays
für jede
Zielsubstanz auf mehr als eine Zielsubstanz geprüft werden kann. Alternativ dazu
kann eine einzelne analytische Vorrichtung mit mehr als einem die
Probe aufnehmenden Loch für das
Prüfen
auf die Anwesenheit der gleichen Zielsubstanz in unterschiedlichen
Proben verwendet werden. Eine separate Membran kann unterhalb jedes offenen
Kanals platziert werden, wie in 8b, 9b und 10b dargestellt. Alternativ dazu kann eine einzelne
Reaktionsmembran mit mehreren Rezeptor- und Steuerbreichen verwendet
werden, wie in 8c dargestellt.
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In
einigen Immunassays kann ein Assayvorgang durchgeführt werden,
um mehrere in einer einzelnen Probe anwesende Analyte zu prüfen, so
dass nur ein die Probe aufnehmendes Loch notwendig ist. 5, 6, 7 und 11 stellen
Ausführungsformen
der analytischen Vorrichtung dar, die bei einem Immunassay von dieser
Art verwendet werden kann.
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Die
Höhe des
Rands des die Probe aufnehmenden Lochs kann erhöht werden, um die Kapazität des die
Probe aufnehmenden Lochs zu erhöhen
oder die Möglichkeit
eines Verschüttens
der Probe zu verringern. Dies kann einfach durch das Erhöhen der
Dicke der oberen Stützschicht
vollzogen werden oder durch Befestigen eines einen Stauraum definierenden
Elements (17), wie in 2 und 3 dargestellt,
an die obere Fläche
der oberen Stützschicht. Das
einen Stauraum definierende Element ist aus jedem beliebigen wasserundurchlässigen Material
gebildet, das das gleiche oder unterschiedlich von dem Material
sein kann, das verwendet wird, um die obere Stützschicht zu bilden. Es weist
einen offenen Kanal mit dem gleichen Durchmesser und der gleichen Form
wie der offene Kanal der oberen Stützschicht auf. Unter Bezugnahme
auf 3 sind der offenen Kanal des einen Stauraum definierenden
Elements und der offenen Kanal der oberen Stützschicht zusammengepasst,
um einen Rand (18) eines die Probe aufnehmenden Lochs zu
definieren.
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Für die Reaktionsmembran
kann jedes beliebige geeignete poröse Material, das fähig ist,
das gebrauchte Rezeptorreagens in dem analytischen Assay zu immobilisieren,
verwendet werden. Geeignete Materialien umfassen Nitrocellulose,
Glasfaser, Polyester, Cellulosenitrat, Polyester, Polycarbon, Nylon und
andere natürliche
und synthetische Materialien, die direkt oder indirekt an den ausgewählten Rezeptor
gekoppelt werden können.
In der Regel wird die Membran positive und/oder negative Ladungen
beinhalten, die es dem Rezeptormolekül ermöglichen, sich zu binden. Gewisse
Membranmaterialien sind geladen wie etwa Cellulosenitrat, das zum
Teil negative Ladungen, die von Nitrogruppen geliefert werden, aufweist.
Andere Materialien können
vorbehandelt werden, um eine geladene Membran bereitzustellen. Polyester
kann zum Beispiel mit Carboxyl- oder Aminogruppen derivatisiert
werden, um entweder eine negativ oder positiv geladene Membran bereitzustellen.
Nylon kann mit Säure
behandelt werden, um Peptidbindungen zu spalten, um positive Ladungen
(aus den Aminogruppen) und negative Ladungen (aus den Carboxylgruppen)
bereitzustellen.
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Der
Begriff „Reaktionsmembran" ist so gedacht,
dass er sowohl das poröse
Material, an das das Rezeptorreagens, das in dem analytischen Assay
gebraucht wird, gebunden ist, als auch ein zusätzliches poröses stützendes
Material, falls vorhanden, dass die untere Fläche der Reaktionsmembran bildet,
umfasst. Eine bevorzugte Reaktionsmembran beinhaltet zum Beispiel
eine Platte aus Nitrocellulose, deren Rücken mit porösem Papier
verstärkt
ist. Im Handel erhältliche
von porösem
Polyester gestützte
Nitrocellulose kann ebenfalls verwendet werden. Ein repräsentatives
Beispiel von papierverstärkter
Nitrocellulose ist im Handel von EY Laboratories Inc. (San Mateo,
Kalifornien; Kat. Nr. PBNC15-1, PBNC15-10, PBNC15M-1 und PBNC15M-10)
erhältlich.
Diese bevorzugte Membran ist im Wesentlichen beständiger als
Nitrocellulose allein und kann ohne jede andere Stützkomponente
gebraucht werden. Dies gewährleistet
leichtere Handhabung und leichteren Vorrichtungszusammenbau. Zusätzlich dazu hat
es sich erwiesen, dass analytische Vorrichtungen, die papierverstärkte Nitrocellulose
für die
Reaktionsmembran gebrauchen, eine verbesserte Empfindlichkeit in
gewissen Immunassays aufweisen.
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Porosität der Membran
hat einen großen
Einfluss auf die Fließgeschwindigkeit
der Flüssigkeit
und die Empfindlichkeit des Assays. Je größer die Porenweite der Membran,
desto schneller die Fließgeschwindigkeit
für eine
gegebene Flüssigkeit.
Wenn sich die Fließgeschwindigkeit
erhöht,
mindert sich die Wechselwirkungszeit, die zwischen dem Zielmolekül in der
Probe und dem auf der Reaktionsmembran immobilisierten Rezeptor
erhältlich
ist, womit die Assayempfindlichkeit gemindert wird. Zusätzlich dazu
stellen große
Porenweiten weniger Flächenbereich
zum Immobilisieren des Rezeptormoleküls bereit, was ein weiterer
der Parameter ist, der der geminderten Assayempfindlichkeit zurechenbar
ist. Für
die meisten Assays liegt die Porosität der Membran vorzugsweise
in der Spanne von ungefähr
0,1 bis 12 μm
und besser 0,45 bis 3 μm.
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Die
Dochtwirkungskraft der Membran kann die Assayempfindlichkeit beeinträchtigen
und hängt von
der Dicke und Natur des Membranmaterials ab. Die Dochtwirkungskraft
kann als die Migration einer Standardlösung durch eine gewisse Entfernung
pro Zeiteinheit gemessen werden. Oftmals kann die Assayempfindlichkeit
durch Auswählen
einer Membran mit einer relativ niedrigen Dochtwirkungskraft erhöht werden.
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Unter
Bezugnahme auf 3 wird die nicht freigelegte
obere Fläche
der Reaktionsmembran an der unteren Fläche der oberen Stützschicht
mit einem wasserunlöslichen
Kleber (19) abgedichtet, um eine flüssigkeitsundurchlässige Dichtung
zwischen dem Rand (12) der oberen Stützschicht um den offenen Kanal
und der nicht freigelegten oberen Fläche (14) der Reaktionsmembran
zu bilden. Der Begriff „flüssigkeitsundurchlässige Dichtung" bedeutet, dass,
wenn die Probe und nachfolgende Reagenzien dem die Probe aufnehmenden
Loch zugefügt
werden, Flüssigkeit
tendenziell eher durch die Reaktionsmembran in den absorbierenden
Körper
darunter als lateral durch die Membran zu der nicht freigelegten
oberen Fläche
der Reaktionsmembran fließt.
Die flüssigkeitsundurchlässige Dichtung
minimiert somit den lateralen Fluss der Probe durch die Membran. Somit
wird der Bedarf, Kompression zwischen der Membran und dem absorbierenden
Körper
zu benutzen, um den Fluss der Probe nach unten durch die Membran
und in den absorbierenden Körper
herbeizuführen,
abgewandt. Der Fluss der Probe nach unten wirkt bei dem Konzentrieren
der Probe durch das Zentrum der Reaktionsmembran, wo der Rezeptor typischerweise
immobilisiert wird, nachdem das analytische Gerät zusammengebaut ist. Er verlangsamt ebenfalls
die Fließgeschwindigkeit
durch die Membran, was die Menge an Zeit erhöht, die die Zielsubstanz, wenn
sie in der Probe anwesend ist, mit dem Rezeptor in Kontakt steht.
Dies stellt erhöhte
Empfindlichkeit des Immunassays, der die analytische Vorrichtung
gebraucht, bereit.
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Jeder
beliebige wasserunlösliche
Kleber kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange
er fähig
ist, eine flüssigkeitsundurchlässige Dichtung
zwischen dem Rand des die Probe aufnehmenden Lochs und dem nicht
freigelegten Umfang der oberen Fläche der Reaktionsmembran zu bilden.
Aufgrund ihrer Leichtigkeit in der Handhabung werden Haftkleber
bevorzugt. Ein Haftkleber, mit dem eine Fläche beschichtet ist, kann eine
dauerhafte Klebefolienfläche
bilden, die bei Raumtemperatur unter leichtem Druck unmittelbar
an verschiedenen anderen Flächen
klebt. Im Haushalt gebräuchliches selbsthaftendes
Kreppband und Clear Tape der Marke ScotchTM sind
Beispiele von Produkten, die mit Haftklebern gefertigt werden. Beispiele
von geeigneten wasserunlöslichen
Haftklebern umfassen diejenigen, die auf Polyacrylsäure, oder
Polyvinylderivaten, natürlichem
oder künstlichem
Kautschuk und Polysiloxanen basieren. Die besondere Art des verwendeten
druckempfindlichen Klebers ist nicht wichtig, außer dass sich verschiedene
Kleber in den Kosten unterscheiden können, wodurch weniger teure
Kleber vorgezogen werden. Einseitiges Klebeband wie etwa im Haushalt
gebräuchliches
selbsthaftendes Kreppband oder chirurgisches Band kann bei der praktischen
Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die nichtklebende
Seite des Bands bildet die obere Fläche der oberen Stützschicht
und die Reaktionsmembran wird an die klebende Seite geklebt. Platten
aus klarem Kunststoff, die auf einer Seite mit Haftkleber beschichtet
sind, können
ebenfalls verwendet werden.
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Ein
absorbierender Körper
(15) wird nahe der unteren Fläche der Reaktionsmembran positioniert,
um in flüssiger
Kommunikation mit der Reaktionsmembran zu stehen. Somit kann die
obere Fläche des
absorbieren Körpers
unmittelbar an die untere Fläche
der Reaktionsmembran angrenzen. Alternativ dazu kann sich eine Zwischenschicht
zwischen der Reaktionsmembran und dem absorbierenden Körper befinden,
vorausgesetzt, dass die Zwischenschicht den Transfer von Flüssigkeit
aus der Reaktionsmembran zu dem absorbierenden Körper gewährleistet. Als ein Beispiel
einer Zwischenschicht kann ein poröses Material zwischen der Reaktionsmembran
und dem absorbierenden Körper
eingefügt
werden, um zusätzliche
Stütze
für die
Reaktionsmembran bereitzustellen. Als ein anderes Beispiel einer
Zwischenschicht kann eine flüssigkeitsundurchlässige Trennwand,
die Öffnungen
darin aufweist, um des Weiteren den Fluss der Probe durch das Zentrum
der Reaktionsmembran zu lenken verwendet werden Derartige Trennwände werden
in U.S. Pat. Nr. 5,006,464 beschrieben. Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei
denen Leichtigkeit in der Herstellung und reduzierte Kosten erwünscht sind,
befindet sich die obere Fläche
des absorbierenden Körpers
typischerweise unmittelbar angrenzend an der unteren Fläche der Reaktionsmembran.
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Jedes
beliebige herkömmlicherweise
gebrauchte Material, das fähig
ist, Flüssigkeit
durch eine poröse
Membran zu ziehen oder abzuziehen wie etwa zum Beispiel durch Kapillarwirkung,
kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verwendbare
bekannte Materialien umfassen Celluloseacetatfasern, Polyester,
Polyolefin oder andere derartige Materialien. Schichten von im Handel
erhältlichem Filterpapier
oder Toilettenpapier können
ebenfalls verwendet werden. Der absorbierende Körper stellt ein Mittel bereit,
um die Probe durch Bereitstellen von einheitlicher „Absaugung" anzunehmen, um die
Probe aus dem Loch durch die Reaktionsmembran und hinunter in den
absorbierenden Körper
zu liefern. Somit wirkt der absorbierende Körper ebenfalls als Stauraum,
um die Probe und verschiedene Reagenzien, die verwendet werden, wenn
der Assay durchgeführt
wird, zu halten. Demgemäß sollte
der absorbierende Körper,
wenn in Assays verwendet, bei denen relativ große Volumen von Flüssigkeit
verwendet werden, eine hohe absorbierende Kapazität aufweisen,
um die Möglichkeit
von Rückfluss
der Probe und der Reagenzien aus dem absorbierenden Körper zurück in die
Reaktionsmembran zu verhindern oder zu minimieren.
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Wie
bei der Reaktionsmembran kann die Dochtwirkungskraft des absorbierenden
Körpers
ein wichtiger Parameter sein. Die Dochtwirkungszeit wird bezüglich der
Zeit definiert, die erforderlich ist, damit Wasser eine definierte
Entfernung (7,5 cm) durch das absorbierende Papier zurücklegen
kann, und mit dem Basisgewicht, der Dicke und Komposition des Papiers
verbunden ist. Die Dochtwirkungskraft kann von einem Material zum
nächsten
stark variieren. Somit können
die Eigenschaften der analytischen Vorrichtung und die Fließgeschwindigkeit
der Probe und der Reagenzien durch Variieren des verwendeten absorbierenden
Materials modifiziert werden.
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Der
Flächenbereich
der oberen Fläche
des absorbierenden Körpers
wird in der Regel größer sein
als der der Reaktionsmembran, so dass die obere Fläche des
absorbierenden Körpers
an der unteren Fläche
der oberen Stützschicht
befestigt werden kann. Typischerweise wird der gleiche wasserunlösliche Kleber,
der verwendet wird, um die Reaktionsmembran an die obere Stützschicht
zu kleben, ebenfalls verwendet, um den absorbierenden Körper an die
obere Stützschicht
zu kleben. Der wasserunlösliche
Kleber hält
die Struktur mit minimalem Kompressionsdruck auf den absorbierenden
Körper
und die Reaktionsmembran zusammen, womit die Auswirkungen des bereits
erwähnten
Kompressionsdrucks vermieden werden.
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Unter
Bezugnahme wiederum auf die Reaktionsmembran können zusätzlich zu ihrer Porosität ihr Durchmesser
und ihre Dicke die Assayempfindlichkeit bewirken. Vorzugsweise weist
die Reaktionsmembran einen Flächenbereich
auf, der nur geringfügig
größer ist
als der offene Kanal der oberen Stützschicht, so dass die nicht
freigelegte Fläche
der Reaktionsmembran einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger
als 8 mm, vorzugsweise weniger als 3 mm, aufweist, wobei unter Bezugnahme
auf 3 der nicht freigelegte Bereich die Entfernung von
der freigelegten Fläche
der Reaktionsmembran zu der Seitenwand (20) der Reaktionsmembran
ist.
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Die
Dicke der Reaktionsmembran (d.h. „Seitenwand" (20), die
die Entfernung zwischen der oberen Fläche und der unteren Fläche der
Reaktionsmembran ist) kann abhängig
von den Fließcharakteristiken,
die für
einen gegebenen Immunassay benötigt
werden, variieren. Typischerweise reicht die Dicke von 0,05 mm bis
3,0 mm, und üblichererweise von
0,1 bis 1,0 mm. Es wurde herausgefunden, dass bei einigen Immunassays
eine höhere
Empfindlichkeit erzielt werden kann, wenn die Dicke der Reaktionsmembran
größer ist
als ungefähr
0,1 mm und vorzugsweise in der Spanne von 0,2 mm bis 1,0 mm liegt.
Wenn eine hinreichend dicke Reaktionsmembran verwendet wird, wird
ein Luftloch (21) durch die untere Fläche der oberen Stützschicht,
die Seitenwand der Reaktionsmembran und die obere Fläche des
absorbierenden Körpers
gebildet. Es wird angenommen, dass die verbesserte Empfindlichkeit
erzielt wird, da kein absorbierendes Material unmittelbar angrenzend
an die Seitenwand der Reaktionsmembran vorhanden ist, was die zugefügte Probe tendenziell
aus dem Zentrum der Membran ziehen würde. Somit erleichtert das
Luftloch des Weiteren den Fluss der zugefügten Probe nach unten durch die
Reaktionsmembran. Zusätzlich
dazu kann eine dickere Reaktionsmembran ermöglichen, dass mehrere Rezeptoren
zum Binden an die Zielsubstanz erhältlich sind, wodurch eine weitere
Zunahme der Assayempfindlichkeit bereitgestellt wird. Es wird angenommen,
dass die Vorrichtungen des Stands der Technik, die relativ dünne Reaktionsmembranen
aufweisen wie etwa weniger als 0,1 mm dicke Nitrocellulosemembranen,
die nicht papierverstärkt
sind, tendenziell ermöglichen,
dass die Probe eher seitwärts durch
die Reaktionsmembran fließt,
als nach unten durch die Mitte der Reaktionsmembran. Dies kann insbesondere
bei Vorrichtungen zutreffen, die unter Kompression zusammengehalten
werden und bei denen die Reaktionsmembran weniger Flächenbereich
aufweist als der unterliegende absorbierende Körper, so dass ein empfindlichkeitserhöhendes Luftloch
nicht erzielt wird und das absorbierende Material mit der Seitenwand
der Reaktionsmembran in Kontakt kommt, womit der Seitwärts-Fluss
der Probe durch die Reaktionsmembran und in das absorbierende Material
erleichtert wird.
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Die
analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung beinhaltet des
Weiteren eine flüssigkeitsundurchlässige untere
Stützschicht
(16), die an der unteren Fläche des absorbierenden Körpers befestigt
ist. Die untere Stützschicht
beinhaltet typischerweise das gleiche Material wie die obere Stützschicht,
obwohl es unterschiedlich sein kann. Wie bereits vermerkt wurde,
beinhalten typische analytische Vorrichtungen des Stands der Technik
obere und untere Gehäuseelemente,
die zusammengepasst sind, um die Reaktionsmembran um den absorbierenden Körper unter Verwendung
von Kompression an der Verwendungsstelle zu halten. Da die Reaktionsmembran
und der absorbierende Körper
der analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
von wasserunlöslichem
Klebstoff an die obere Stützschicht
geklebt sind, besteht kein Bedarf am Benutzen von Kompression, um
sie zusammenzuhalten. Somit besteht kein Bedarf an der Verwendung
von gepassten oder anderweitig abgedichteten oberen und unteren
Gehäuseelementen,
obwohl abgedichtete oder gepasste Gehäuseelemente als die obere und
untere Stützschicht
der analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung dienen könnten, wenn
gewünscht.
In einer Ausführungsform
der Erfindung sind die obere und die untere Stützschicht nicht zusammengepasst
und stehen nicht miteinander in Kontakt, so dass jede Seite der
analytischen Vorrichtung „offen" ist und die Seiten
des absorbierenden Körpers
sichtbar sind. Dies wird in 2 gezeigt,
wobei der absorbierende Körper
(15) an den Seiten der analytischen Vorrichtung sichtbar
ist.
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Da
die Ausgestaltung der analytischen Vorrichtung im Vergleich zu der
von Vorrichtungen des Stands der Technik relativ einfach ist, sind
die Materialkosten niedriger und der Herstellungsprozess leichter.
Viele analytische Vorrichtungen können gleichzeitig vorbereitet
werden. Zum Beispiel kann, wenn biegsamer Kunststoff verwendet wird,
um die obere Stützschicht
zu bilden, ein Streifen des Kunststoffs, der lang genug ist, um
die gewünschte
Anzahl an Vorrichtungen zu bilden, erhalten werden. Zum Beispiel
kann ein Streifen, der lang genug ist, um 5 Stützschichten zu bilden, erhalten
werden. Anschließend
würden
5 gleichmäßig verteilte
Lücken
in den Kunststoff geschnitten werden. Die obere Stützschicht
kann mit wasserlöslichem
Kleber, der bereits an die untere Fläche geklebt ist, erworben werden, oder
der Kleber kann während
des Herstellungsprozesses aufgetragen werden.
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In
geeignetster Weise wird der Kleber auf die gesamte untere Fläche der
oberen Stützschicht
aufgetragen. Alternativ dazu kann der Kleber nur um den offenen
Kanal der oberen Stützschicht
und um den Umkreis der unteren Fläche der oberen Stützschicht aufgetragen
werden, so dass die Reaktionsmembran und der absorbierende Körper daran
kleben können.
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Bei
der Fortsetzung diese Beispiels würden 5 vorgeschnittene Reaktionsmembranen über dem
offenen Kanal platziert werden. Ein Streifen des absorbierenden
Materials würde
dann an die freigelegte untere Fläche der oberen Stützschicht
geklebt werden, wobei der absorbierende Körper gebildet wird. Schließlich würde, wenn
eine untere Stützschicht verwendet
würde,
Material, dass verwendet wird, um die untere Stützschicht zu bilden, an die
untere Fläche
des absorbierenden Körpers
geklebt, vorzugsweise mit einem wasserunlöslichen Kleber. Schließlich würde der
zusammengebaute Streifen geschnitten werden, um 5 individuelle analytische
Vorrichtungen zu bilden.
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Als
eine Variation des obigen Herstellungsverfahrens könnte das
Material, dass verwendet wird, um die untere Stützschichten zu bilden, darauf aufgetragenen
Kleber aufweisen. Anschließend könnte das
Material, dass die absorbierenden Körper bildet, befestigt werden.
Ein separater Streifen, der das Material beinhaltet, das die oberen
Stützschichten
und die Reaktionsmembranen bildet, könnte vorbereitet werden. Das
Material für
die oberen Stützschichten
würde vorgeschnittene
Lücken
für den
offenen Kanal und wasserunlöslichen
Kleber, der auf die untere Fläche
des oberen Stützmaterials
aufgetragen ist, aufweisen. Die Reaktionsmembranen könnten dann über den
offenen Kanälen
platziert und durch den Kleber an die untere Fläche des oberen Stützmaterials
geklebt werden. Der Streifen des absorbierenden Materials und des
unteren Stützmaterials
könnte
dann an der unteren Fläche
der oberen Stützschicht/dem
Reaktionsmembranstreifen befestigt werden. Der zusammengebaute Schichtstoffverbund
würde dann
in individuelle analytische Vorrichtungen geschnitten werden. Ein
Fachmann würde natürlich anerkennen,
dass viele verschiedene Art und Weisen, auf die die Vorrichtungen
zusammengebaut werden könnten,
vorhanden sind. Zum Beispiel könnten
eher große
Quadrate an Material verwendet werden als Streifen zu verwenden,
wo eine Reihe an analytischen Vorrichtungen gleichzeitig zusammengebaut
ist, so dass die Reihen und Spalten der analytischen Vorrichtungen
gleichzeitig vorbereitet werden und dann danach in individuelle
Vorrichtungen geschnitten werden.
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Die
einfache Ausgestaltung der analytischen Vorrichtung macht es möglich, Rollen
für den
Zusammenbau zu verwenden, wie in 12 gezeigt.
Das Material, das die biegsame obere Stützschicht bildet, die auf einer
Seite mit druckempfindlichem Kleber beschichtet ist und vorgeschnittene
Lücken
(für das
die Probe aufnehmende Loch) aufweist, befindet sich auf einer Rolle
(101). Die nächste
Rolle (102) enthält
das Material für
die Reaktionsmembran, zugeschnitten auf eine geeignete Breite. Eine
dritte Rolle (103) ist für das Material, das den absorbierenden
Körper
bildet, und eine vierte Rolle (104) ist für das Material, das
die untere Stützschicht
bildet, die auf einer Seite ebenfalls mit einem druckempfindlichen
Kleber beschichtet ist. Die verschiedenen Komponenten werden unter
Verwendung einer Muldenpresse (105) zusammengebaut. Nachdem
vier Komponenten zusammengefügt
sind, kann die obere Stützschicht
mit einer Markierungs- oder Strichcodevorrichtung (106) markiert
werden, um die Art der Prüfung
anzuzeigen, für
die die Vorrichtung verwendet werden soll. Ein Injektionsgerät (107)
kann die Reaktionsmembran der zusammengebauten analytischen Vorrichtung
mit dem entsprechenden Rezeptor beimpfen. Schließlich kann eine Schneidvorrichtung
(108) individuelle analytische Vorrichtungen schneiden.
Andere Änderungen
oder Behandlungen der analytischen Vorrichtung, die nicht in 12 dargestellt
sind, können während des
Zusammenbaus oder nach dem Schneiden auftreten. Zum Beispiel können die
Reaktionsmembranen der analytischen Vorrichtungen dann weiteren
Behandlungen wie etwa Blockierungsschritten unterzogen werden. Schließlich würden verschiedene
Qualitätskontrollprozeduren
vor dem Verpacken der Vorrichtungen folgen bis sie fertig zur Verwendung
sind.
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Der
Rezeptor ist in dem Fall von Immunassays fähig, sich an die Zielsubstanz
in einer biologischen Probe wie etwa Urin, Blut oder Speichel besonders
zu binden. Ein gewöhnlicher
Fachmann wird anerkennen, dass sich der Begriff „besonders binden" auf das Miteinander-Verbinden
von Substanzen, die zusammenpassen, wie etwa ein Antigen und einen
darauf gerichteter Antikörper,
bezieht. Es wird ebenfalls anerkannt werden, dass sich der Begriff „Rezeptor" je nach Kontext
auf ein einzelnes Molekül, das
fähig ist,
sich an eine Zielsubstanz, die in einer flüssigen Probe anwesend sein
kann, besonders zu binden, beziehen kann. Der Begriff kann sich
jedoch ebenfalls auf eine hinreichende Anzahl oder Konzentration
an Rezeptormolekülen,
die notwendig sind, um die Erfassung der Zielsubstanz zu erzielen,
beziehen. Wenn das Zielmolekül
ein besonderer Antikörper
ist, wird der Rezeptor das Antigen sein, für das der Antikörper spezifisch
ist. Somit bezieht sich der Begriff „Antigen", wie hierin verwendet, auf jede beliebige
Substanz, die fähig
ist, eine Immunreaktion hervorzurufen und Humane Immundefizienz-Virus-Antigene
(HIV-Antigene), Hepatitisvirus-Antigene
(HCV, HBV, HAV), Toxoplasmose gondii, Cytomegalovirus, Helicobacterpylori,
Röteln
und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.
In einigen Fällen wird
das Zielmolekül
ein Antigen sein, und der Rezeptor wird ein Antikörper sein,
der sich an das Antigen besonders bindet. Der Rezeptor kann direkt
auf die Reaktionsmembran angewandt und darauf immobilisiert werden
oder mit ihm können
Mikropartikel wie etwa Latexkügelchen
beschichtet werden, die dann von der Reaktionsmembran gefangen werden.
Geeignete Verfahren zum Anwenden des Rezeptors auf die Reaktionsmembran
sind auf dem Stand der Technik bekannt.
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Zusätzlich zu
dem Rezeptor kann ein definierter Bereich der freigelegten Reaktionsmembran ebenfalls
ein Steuermolekül
enthalten. Zum Beispiel kann Protein A als eine geeignete Steuerung
verwendet werden, um zu bestimmen, ob der Immunassay richtig durchgeführt wurde.
Die Verwendung von Protein A als eine Kontrolle wird in U.S. Pat.
Nr. 5,541,059 offenbart. Andere geeignete Kontrollen sind auf dem
Stand der Technik wohl bekannt.
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Wie
oben vermerkt werden der Rezeptor und Kontrollen, falls verwendet,
typischerweise nur auf definierte Regionen der freigelegten Membranfläche angewandt.
Der Rezeptor wird oft auf das Zentrum der Reaktionsmembran geimpft,
so dass der Umkreis der freigelegten Fläche der Reaktionsmembran keine Rezeptormoleküle daran
gebunden aufweist. In einigen Situationen kann es jedoch angemessen
sein, die gesamte freigelegte Fläche
der Reaktionsmembran mit dem Rezeptor abzudecken. Wenn der Rezeptor
auf eine beschränkte
Region der freigelegten Membranfläche geimpft wird, kann die
Reaktionsmembran mit einer Blockierkomposition behandelt werden,
die verhindert, dass sich die Zielsubstanz und andere Komponenten
der Probe an die Reaktionsmembran nicht spezifisch binden. Für Assays,
bei denen nicht spezifisches Binden nicht problematisch ist, wird
eine Blockierungsschritt nicht notwendig sein. Die Verwendung einer
papierverstärkten
Nitrocellulose von guter Qualität
kann in einigen Assays ebenfalls einen Blockierungsschritt nicht
notwendig machen. Falls ein Blockierungsschritt benötigt wird, beinhaltet
eine gewöhnliche
Blockierungskomposition Rinderserumalbumin (BSA) und/oder Proteinsolubilisationsdetergenzien
wie etwa diejenigen, die in chemischen Katalogen (z.B. VWR Scientific
Inc., Philadelphia, PA) offenbart werden. BSA wird in der Regel
in Mengen von ungefähr
1 bis 10% verwendet und Detergenzien werden in der Regel in Mengen von
ungefähr
0,01 bis ungefähr
5% verwendet. Geeignete Detergenzien umfassen Polyoxyethylensorbitanderivate
und Polyoxyethylenether. Ein geeignetes Polyoxyethylenesorbitanderivat
ist Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat (verkauft als TWEEN 20 von
ICI Americas, Inc.). Geeignete Polyoxyethylenether umfassen diejenigen,
die unter dem Markennamen TRITON von Rohm & Haas wie etwa TRITON X-100 verkauft
werden.
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Die
Membranblockierungsbehandlung tritt typischerweise auf, nachdem
die analytische Vorrichtung bereits zusammengebaut wurde und der
Rezeptor an der Reaktionsmembran immobilisiert wurde. Eine hinreichende
Menge an Blockierungskomposition, um die freigelegte Fläche der
Reaktionsmembran abzudecken, wird auf das Reaktionsloch angewandt. Falls
das Reaktionsloch einem Durchmesser von 1 cm aufweist, sollten ungefähr 50 μl der Blockierungskomposition
hinreichend sein. Nachdem die Blockierungskomposition getrocknet
ist, ist die analytische Vorrichtung fertig zur Verwendung. Die
analytische Vorrichtung kann verpackt werden bis sie fertig zur Verwendung
ist.
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Die
Immunassays, die die analytische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
verwenden, können
sehr einfach und schnell sein, können
qualitativ oder quantitativ sein. Viele unterschiedliche Arten von
Immunassays, die auf dem Stand der Technik bekannt sind, können unter
Verwendung dieser analytischen Vorrichtungen durchgeführt werden.
Die analytischen Vorrichtungen können
zur Verwendung bei vielen unterschiedlichen Arten von Assays angepasst
werden. Die Zielsubstanz kann zum Beispiel ein Hormon, ein Antikörper, ein
Antigen, ein Protein usw. sein. Eine nicht eingeschlossene Liste
von möglichen
Zielsubstanzen ist in U.S. Pat. Nr. 5,006, 464 bereitgestellt. Das
Immunassayformat wird von der Zielsubstanz abhängen, die erfasst werden soll.
Diese sind wiederum auf dem Stand der Technik bekannt.
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Es
wird anerkannt werden, dass verschiedene Komponenten der analytischen
Vorrichtung und/oder Assayprozedur wie etwa die für die Reaktionsmembran
verwendete Porosität,
die Dicke oder die Art von Material modifiziert werden können, um die
Empfindlichkeit für
die Erfassung einer bestimmten Zielsubstanz zu vergrößern. Die
Blockierungs- und Waschlösungen
und die Rezeptor- und Erfassungsreagenzien (z.B. ein Antkörper oder
Protein A, markiert mit erfassbaren Markierungen wie etwa Enzymen,
kolloidalem Gold, fluoreszenten Markierungen, chemilumineszenten
Markierungen, biolumineszenten Markierungen usw.) werden ebenfalls
die Assayempfindlichkeit beeinflussen. Die analytischen Vorrichtungen
können
in Assays verwendet werden, die wenig bis gar keine Manipulation
der Probe erfordern, und die in weniger als 1 Minute durchgeführt werden
können.
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Die
folgenden Beispiele und Zeichnungen sind nur für Darstellungszwecke.
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Beispiel 1: Zusammenbau
der analytischen Vorrichtung
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass die analytischen Vorrichtungen aus leicht
erhältlichen
Materialien vorbereitet werden können.
Kunststoffplatten, die auf einer Seite mit druckempfindlichem Kleber
beschichtet sind (Cleer-Adheer® gefertigt von C-LINE Products,
Inc.), werden aus einer Schreibwarenhandlung erhalten und in 1'' × 1''-Quadrate
geschnitten, um die oberen Stützschichten
der analytischen Vorrichtung zu bilden. Eine 1/8''-Lücke wird
unter Verwendung eines Lochers in die Mitte jedes Quadrats geschnitten.
Reaktionsmembranmaterial, das ebenfalls aus einer Schreibwarenhandlung
erhalten wird (z. B. Cellulosepapier wie etwa gewöhnliche
Haushaltspapierhandtücher,
poröse
Nylonplatten, poröses Celluloseacetatpapier,
Tintenlöschpapier
oder jedes beliebige andere Material mit guter Filterqualität), wird
unter Verwendung eines 1/4''-Lochers in 1/4''-Kreise geschnitten. Der Reaktionsmembrankreis
ist an der klebenden Seite der oberen Stützschicht befestigt, um die
1/8''-Lücke abzudecken. Das
absorbierende Material wird mit einer geeigneten Dicke erhalten
und in 1'' × 1''-Quadrate
geschnitten und an die klebende Seite der oberen Stützschicht
geklebt, um den absorbierenden Körper
zu bilden. Eine untere Stützschicht
wird aus dem gleichen druckempfindlichen mit Kleber beschichteten Kunststoff
vorbereitet, der für
die obere Stützschicht verwendet
wird und an die untere Fläche
des absorbierenden Körpers
geklebt wird.
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Beispiel 2: Immunassay
unter Verwendung einer analytischen Vorrichtung zur Prüfung von
IgG
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Die
analytischen Vorrichtungen wurden unter Verwendung der folgenden
Komponenten vorbereitet und wurden wie in 1–3 gezeigt:
Die oberen Stützschichten,
die 3,8 Quadratzentimeter messen, wurden aus biegsamem, aber unnachgiebigem
Polyvinylchlorid(PVC-Kunststoff (Einzelhandel Tap Plastics), der
einen wasserunlöslichen
druckempfindlichen Kleber auf einer Seite aufwies, geschnitten.
Lücken
mit 8 mm Durchmesser wurden in das Zentrum der oberen Stützschichten
gelocht. Kreisförmige
Reaktionsmembranen mit 11 mm Durchmesser wurden aus papierverstärkter Nitrocellulose
mit einer Dicke von etwa 0,8 mm gelocht (EY Laboratories Inc. Kat. #
PBNC15-1) und an die obere Stützschicht
geklebt, um die Lücke
abzudecken. Ein absorbierender Körper,
der ein Quadrat von 3,8 cm eines absorbierenden Materials beinhaltet
(aus Whatman, Kat. Nr. F427-05), wurde an die klebende Seite der
oberen Stützschicht
geklebt. Eine untere Stützschicht,
die 3,8 Quadratzentimeter misst und das gleiche Kunststoffmaterial
und den gleichen Kleber wie die obere Stützschicht beinhaltet, wurde
an die untere Fläche des
absorbierenden Körpers
geklebt. Ein einen Stauraum definierendes Element, das das gleiche
Kunststoffmaterial und den gleichen Kleber wie die obere Stützschicht
beinhaltet, die ungefähr
3,8 cm × 1,5
cm misst und eine in das Zentrum gelochte Lücke von 8 mm Durchmesser aufweist,
wurde auf die Oberseite der oberen Stützschicht positioniert, wie
in 2 gezeigt.
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Eine
Lösung
von 1 mg/ml Kaninchen-IgG (EY Katalog # AF541-1) wurde in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(0,05 M pH 7,4) vorbereitet, die 1% Rinderserumalbumin (PBS/BSA-Verdünnungsmittel)
enthält.
Ein Tropfen von 1/2 μl
wurde auf das Zentrum der freigelegten Fläche der Reaktionsmembran getüpfelt. Es
wurde keine weitere Behandlung der Reaktionsmembran (z.B. Blockierungsbehandlung)
vorgenommen. Es wurde ermöglicht,
dass die IgG-Lösung
trocknet. Eine Lösung
von 6 μg/ml
Protein A/kolloidalem Gold (erhältlich
von EY-Laboratories Inc, Kat. # GP-01, GP-01-100 oder FC-PRO-5)
wurde in 0,5% Tween 20 vorbereitet, und 50 μl wurden der Reaktionsmembran
zugefügt.
Ein violett-rötlicher Punkt
erschien, wo die IgG hingetüpfelt
wurde. Der Rückstand
der Reaktionsmembran blieb weiß.
Dies demonstriert, dass die analytische Vorrichtung verwendet werden
kann, um niedrige Konzentrationen von IgG zu erfassen.
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Die
Lösung
von IgG kann serienmäßig verdünnt und
jede verdünnte
Lösung
auf die Membran einer analytischen Vorrichtung getüpfelt werden. Eine
Standardkurve kann erzeugt werden, und der oben beschriebene Endpunkt
der Erfassung des Assay kann durch Durchführen der Assayschritte bestimmt
werden, und durch Bestimmen der niedrigsten Konzentration von IgG
kann dies veranschaulicht werden. Proben, die unbekannte Quantitäten von IgG
enthalten, können
wie oben geprüft
werden, und die Intensität
des entstehenden rötlich-violetten Punkts
(falls vorhanden) kann mit der Standardkurve verglichen werden,
um halbquantitative Ergebnisse zu erhalten.
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Beispiel 3: Immunassay
unter Verwendung einer analytischen Vorrichtung zur Prüfung von
IgG
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Analytische
Vorrichtungen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, zusammengebaut.
Die Reaktionsmembranen jeder Vorrichtung wurden mit 0,5 μl einer 1
mg/ml-Protein-A-Lösung
beimpft. Reihenverdünnungen
einer bekannten Konzentration von menschlichem Serum wurden bei
dem in Beispiel 2 beschriebenen PBS/BSA-Verdünnungsmittel vorgenommen. Ein
80 μl-Tropfen
von jeder verdünnten
Lösung
von menschlichem Serum wurde der Reaktionsmembran zugefügt, und
konnte gänzlich
absorbieren. Ein 80 μl-Tropfen
der in Beispiel 2 beschriebenen Protein A-/kolloidalen Gold-Lösung wurde
der Reaktionsmembran zugefügt
und konnte gänzlich absorbieren.
Destilliertes Wasser (120 μl)
wurde der Reaktionsmembran zugefügt,
um ungebundene Reagenzien durch die Membran zu waschen. Am Ende des
Assays war ein violettrötlicher
Fleck auf der analytischen Vorrichtung sichtbar, die verwendet wurde, um
die Anwesenheit von IgG in einer verdünnten 1/1000-Lösung von
normalem menschlichem Serum zu prüfen, wobei angezeigt wurde,
dass unter Verwendung der analytischen Vorrichtung und der obigen
Assayprozeduren IgG anwesend und an dieser verdünnten Lösung erfassbar war.