DE212004000032U1

DE212004000032U1 - Diagnostischer Test für Analyte in einer Probe

Info

Publication number: DE212004000032U1
Application number: DE212004000032U
Authority: DE
Original assignee: Advantage Diagnostics Corp
Current assignee: Advantage Diagnostics Corp
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2014-03-20
Also published as: JP4851321B2; HK1084183A1; AU2004254558A1; US7393697B2; ATE492814T1; WO2005003732A3; CA2528108C; CA2528108A1; UA19871U; EP1658483A4; AU2010201632A1; BRPI0411059B8; DK200500290U1; CN1902489A; DK200500290U4; WO2005003732A2; PT2005003732W; BRPI0411059B1; BRPI0411059A; EP1658483B1

Abstract

Diagnostischer Teststreifen zum Nachweis eines Analyts von Interesse in einer flüssigen Probe, wobei der Teststreifen umfasst:
eine Konjugatausgangsfläche, umfassend ein Konjugat, das so konfiguriert ist, dass es den Analyt von Interesse bindet;
eine Probenaufbringfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche liegt und so konfiguriert ist, dass sie die flüssige Probe aufnimmt; und
eine Testfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche liegt und ein immobilisiertes Bindemittel umfasst, das für den Analyt von Interesse spezifisch ist.

Description

Hintergrund der Erfindung
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen schnellen, visuellen Lateral-Flow-Test zum Nachweis von Analyten in einer Probe.
Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Lateral-Flow-Testvorrichtungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in der klinischen Diagnose verwendet werden, um die Anwesenheit eines Analyts von Interesse in einer Probe wie einer Körperflüssigkeit nachzuweisen. Solche Vorrichtungen haben jedoch typischerweise ein relativ großes Probenvolumen und große Mengen an Konjugat benötigt. Sie haben auch eine lange Wartezeit gehabt, bevor die Ergebnisse des Tests abgelesen werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt wird ein immundiagnostischer Teststreifen für den Nachweis eines Analyts von Interesse in einer Probe bereitgestellt. In manchen Ausführungsformen ist der Analyt ein Antikörper wie ein Antikörper gegen das menschliche Immunschwächevirus (HIV) oder ein Anti-Hepatitis-C-Virus (HCV)-Antikörper. In anderen Ausführungsformen ist der Analyt ein Antigen wie menschliches Choriongonadotropin (hCG).
Der diagnostische Teststreifen umfasst vorzugsweise eine Konjugatausgangsfläche, umfassend ein Konjugat, das so konfiguriert ist, dass es den Analyt von Interesse bindet, eine Probenaufbringfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche lokalisiert ist und so konfiguriert ist, dass sie die flüssige Probe aufnimmt, und eine Testfläche. Die Testfläche ist stromabwärts der Konjugatausgangsfläche lokalisiert und umfasst ein immobilisiertes Bindemittel, das zu spezifischer Bindung an den Analyt von Interesse in der Lage ist. Zum Beispiel umfasst die positive Testfläche, wenn der Analyt von Interesse ein Antikörper ist, vorzugsweise ein immobilisiertes Antigen. Wenn der Analyt von Interesse ein Antigen ist, umfasst die positive Testfläche vorzugsweise einen immobilisierten Antikörper. Das Konjugat umfasst eine erste Bindekomponente, die den Analyt von Interesse und eine zweite Sichtbarmachungs-Komponente binden kann.
Die im Test verwendete Probe kann jede Flüssigkeit sein. Bevorzugte Proben schließen zum Beispiel Blut, Serum, Plasma, Speichel und Urin ein. Die Probe wird auf die positive Testfläche aufgetragen und das Konjugat wird dann von der Konjugatausgangsfläche zum Fließen gebracht. Das Konjugat fließt über die Membran und kontaktiert jeden Analyt, der an die positive Testfläche gebunden ist, was ein sichtbares Signal produziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Teststreifen eine Testfläche mit immobilisiertem HIV-Antigen und wird zum Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern verwendet. In dieser Ausführungsform ist der Test für den Nachweis einer HIV-Infektion in einem Patienten nützlich. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Teststreifen eine Testfläche mit immobilisiertem HCV-Antigen und wird zum Nachweis von Anti-HCV-Antikörpern in einer Probe verwendet. In dieser Ausführungsform ist der Test zur Diagnose einer HCV-Infektion in einem Patienten nützlich. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Teststreifen eine Testfläche mit immobilisierten Anti-hCG-Antikörpern. In dieser Ausführungsform ist der Test zum Nachweisen, ob ein Individuum schwanger ist, nützlich.
Die Konjugatausgangsfläche umfasst vorzugsweise getrocknetes Konjugat. Zum Beispiel kann die Konjugatausgangsfläche ein Konjugatpad sein, auf dem Konjugat getrocknet worden ist. Das Konjugatpad ist vorzugsweise durch eine Flüssigkeit mit der Membran in Verbindung. In manchen Ausführungsformen wird das Konjugatpad nach der Zugabe einer Probe auf die Probenaufbringfläche bewegt, so dass es durch eine Flüssigkeit mit der Membran verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform ist die Konjugatausgangsfläche ein Teil der Membran, auf der das Konjugat getrocknet worden ist.
Getrocknetes Konjugat wird vorzugsweise resuspendiert und durch Inkontaktbringen der Konjugatausgangsfläche mit Waschpuffer zum Fließen gebracht. In einer Ausführungsform umfasst der Waschpuffer etwa 0,1 Blockierungsmittel, vorzugsweise ein Blockierungsprotein wie Casein. Der Waschpuffer umfasst vorzugsweise auch etwa 0,1 % Detergens, vorzugsweise ein nicht-ionisches Detergens wie Triton X100^TM. In einer Ausführungsform umfasst der Waschpuffer etwa 0,025% HEPES, etwa 0,85% Natriumchlorid, etwa 0,1% EDTA, etwa 1 % Mannit, etwa 0,1 % Casein und etwa 1 % Triton X100^TM-Detergens.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Konjugat in einem Puffer suspendiert. Das Konjugat wird durch die Zugabe des Puffers, umfassend das Konjugat, auf die Konjugatausgangsfläche zum Fließen in die Testfläche gebracht.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst das Konjugat an kolloidales Gold konjugiertes Protein A. In anderen Ausführungsformen umfasst das Konjugat einen Antikörper, vorzugsweise einen monoclonalen Antikörper, der an kolloidales Gold konjugiert ist. Vorzugsweise hat das kolloidale Gold eine Partikelgröße von etwa 20 bis etwa 80 Nanometer.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Teststreifen zusätzlich eine Kontrollfläche, die auf der Membran stromabwärts der Testfläche lokalisiert ist. Die Kontrollfläche umfasst vorzugsweise ein Kontroll-Bindemittel, das das Konjugat binden kann. Zum Beispiel kann, wenn der Analyt von Interesse ein Antikörper ist und das Konjugat ein Antikörper-Bindemittel wie Protein A umfasst, das Kontroll-Bindemittel Kaninchen-IgG sein. Wenn der Analyt von Interesse ein Antigen ist und das Konjugat einen monoclonalen Antikörper umfasst, der spezifisch ist für das Antigen, kann das Kontroll-Bindemittel zum Beispiel Protein A sein.
Der Teststreifen kann einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfassen. Ein Pufferpad kann durch Flüssigkeit mit der Konjugatausgangsfläche verbunden sein, so dass die Zugabe von Waschpuffer auf das Pufferpad das Konjugat von der Konjugatausgangsfläche und über die Membran zum Fließen bringt, um die Testfläche zu kontaktieren. Ein Absorberstreifen und ein Absorberpad können stromabwärts der Membran lokalisiert sein, um überschüssigen Puffer zu absorbieren, wenn er über die Membran läuft. Eine Trockenmitteltablette kann auch in der Nähe der Membran sein, um überschüssige Flüssigkeit und Feuchtigkeit zu absorbieren.
Der Teststreifen kann gegebenenfalls in einem Gehäuse wie einem Plastikgehäuse vorliegen. Das Gehäuse umfasst vorzugsweise ein Probenfenster, das über den Test- und Kontrollflächen lokalisiert ist, und ein Pufferfenster, das stromaufwärts der Testfläche lokalisiert ist.
Ein Verfahren zum Nachweis eines Analytsin einer flüssigen Probe zum besseren Verständnis der beanspruchten Vorrichtungen auch beschrieben, umfassend das Aufbringen der Probe auf die Testfläche einer Membran und danach das Inkontaktbringen der Testfläche mit einem Konjugat, das den Analyt von Interesse binden und ein sichtbares Signal liefern kann, das die Bindung anzeigt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
1 zeigt eine Testkarte gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt eine Ansicht von oben auf eine Testkarte gemäß einem Aspekt der Erfindung.
3 zeigt eine Seitenansicht einer Testkarte gemäß einem Aspekt der Erfindung.
4 zeigt ein Schnittbild der Bestandteile, die ein Teststreifen gemäß einer Ausführungsform umfasst.
5 zeigt eine Testkarte mit einem positiven Ergebnis, das anzeigt, dass der Analyt von Interesse in der Probe nachgewiesen wurde.
6 zeigt eine Testkarte mit einem negativen Ergebnis, das anzeigt, dass der Analyt von Interesse in der Probe nicht nachgewiesen wurde.
7 zeigt einen Teststreifen mit einem Probenbecher gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Diagnostische Vorrichtung zum schnellen Nachweis der Anwesenheit eines Analyts in einer Probe werden bereitgestellt. Obwohl in Bezug auf eine immundiagnostische Vorrichtung zum Nachweis eines Antikörpers oder Antigens in einer Probe allgemein beschrieben, wird ein Fachmann erkennen, dass die vorliegende Erfindung leicht zum Nachweis jeglichen Analyts von Interesse modifiziert werden kann.
In der Vergangenheit beinhalteten immundiagnostische Vorrichtungen typischerweise das Vormischen eines Konjugats mit der Probe, die auf die Anwesenheit eines Antikörpers analysiert werden sollte. Zum Beispiel wurde in manchen Vorrichtungen das getrocknete Konjugat durch Zugabe einer flüssigen Probe gelöst, was Vormischen der Probe und des Konjugats ermöglichte. Der nachzuweisende Antikörper, falls vorhanden, band an das Konjugat, und wurde an einer stromabwärts liegenden Testfläche, umfassend ein immobilisiertes Antigen, sichtbar gemacht. In diesem System führte jedoch nicht-spezifische Wechselwirkung des Konjugats mit anderen Antikörpern oder anderen Verbindungen in der Probe zu einem Quenchen des Konjugat-Signals. Als eine Folge war eine große Menge an Konjugat nötig. Auf Grund der großen Menge an verwendetem Konjugat brauchte die Reaktion eine lange Zeit zum Klären, was die Zeit, die zum Erhalten der Ergebnisse des Tests nötig war, ausdehnte. Zusätzlich war die Empfindlichkeit des Tests so, dass eine signifikante Menge an Antigen auf der Testfläche nötig war, um ein sichtbares positives Signal zu produzieren.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme des Stands der Technik durch direktes Inkontaktbringen der Testfläche mit der Probe, was ermöglicht, dass jeder Analyt von Interesse spezifisch an das immobilisierte Bindemittel bindet. Zum Beispiel kann ein Antikörper von Interesse an immobilisiertes Antigen binden. Danach wird Konjugat mit Puffer auf die Testfläche aufgetragen. Die Lösungsmittelfront des Puffers drängt ungebundene Bestandteile aus der Testfläche hinaus, was nicht-spezifische Wechselwirkungen mit dem Konjugat reduziert. Als eine Folge wird die benötigte Menge an Konjugat signifikant reduziert, und die Geschwindigkeit der Reaktion wird dadurch erhöht. Zusätzlich wird die Empfindlichkeit der Reaktion erhöht, was die Verwendung von weniger Antigen auf der Testfläche ermöglicht.
Die beschriebenen Vorrichtungen können zum Beispiel verwendet werden, um eine Erkrankung oder Störung in einem Patienten wie menschliches Immunschwächevirus (HIV) oder Hepatitisvirus zu diagnostizieren. Sie können auch verwendet werden, um nachzuweisen, ob ein Individuum schwanger ist. Andere Verwendungen werden basierend auf der nachstehenden Offenbarung für Fachleute offensichtlich.
Definitionen
So weit nicht anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Alle Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen sind, die hierin beschrieben werden, können in der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden.
Ein „Analyt von Interesse" ist jedes Molekül oder jede Verbindung, dessen/deren Anwesenheit in einer Probe identifiziert werden soll. Analyte können ohne Einschränkungen virale Antigene, bakterielle Antigene, Hormone wie Insulin, Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyrotropin, Relaxin, Somatotropin und Gonadotropin, Enzyme, Immunglobuline, Cytokine, Arzneistoffe, Krebs-Antigene, antigene Polysaccharide und Nucleinsäuren einschließen. Andere Analyte, die in Proben unter Verwendung der gelieferten Verfahren und des Apparats identifiziert werden können, werden für einen Fachmann offensichtlich sein. Besonders bevorzugte Analyte von Interesse schließen Anti-HIV-Antikörper, Anti-HCV-Antikörper und menschliches Choriongonadotropin (hCG) ein.
Der Ausdruck „Konjugat" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die so konfiguriert ist, dass sie an einen Analyt von Interesse bindet und ein nachweisbares Signal produziert. Das Konjugat umfasst typischerweise ein Bindemittel, das an einen Marker konjugiert ist. Das Bindemittel ermöglicht dem Konjugat, an den Analyt von Interesse und gegebenenfalls an eine Kontrollverbindung zu binden. Der Marker produziert ein nachweisbares Signal, vorzugsweise ein sichtbares Signal. In einer Ausführungsform wird das sichtbare Signal nur bei Bindung des Konjugats an den Analyt produziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Analyt von Interesse ein Antikörper, und das Konjugat umfasst ein Bindemittel, das Antikörper binden kann. Zum Beispiel kann das erste Bindemittel Protein A sein, obwohl andere Moleküle verwendet werden können, die Antikörper binden können. In einer anderen Ausführungsform ist der Analyt von Interesse ein Antigen, und das Bindemittel des Konjugats umfasst einen Antikörper, der das Antigen binden kann. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.
Der Marker ist jedes Molekül oder jede Verbindung, das/die an das Bindemittel angehängt oder konjugiert werden kann, und das ein nachweisbares Signal produzieren kann. Ein bevorzugter Marker ist kolloidales Gold. Alternativ kann der Marker zum Beispiel gefärbte Latexpartikel, kolloidales Silber oder andere kolloidale Metalle, kolloidales Schwarz oder andere Bestandteile, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sein. Vorzugsweise hat der Marker eine solche Partikelgröße, dass sie nicht die Fähigkeit des Bindemittels, den Analyt von Interesse zu binden, beeinträchtigt. Zum Beispiel hat, wenn das Bindemittel Protein A ist, der Marker vorzugsweise eine Partikelgröße von etwa 5 bis etwa 120 Nanometer, mehr bevorzugt von etwa 20 bis etwa 80 Nanometer.
Das Konjugat wird vorzugsweise in einem „Konjugatpuffer" hergestellt, der das Konjugat stabilisieren und konservieren kann. In einer Ausführungsform kann das Konjugat nach Herstellung in einem Konjugatpuffer auf ein „Konjugatpad" getrocknet werden, wie unten detaillierter beschrieben. Konjugat, das auf ein Substrat getrocknet wird, wird als „diffusionsfähig gebunden" angesehen. Das Konjugat ist „diffusionsfähig gebunden", wenn es zum Diffundieren oder Fließen gebracht werden kann, wie durch dessen Inkontaktbringen mit einem Puffer. Zum Beispiel kann ein Konjugat, das durch Trocknen diffusionsfähig an die Konjugatausgangsfläche gebunden worden ist, mit Puffer gelöst werden, und so entlang der Membran des Teststreifens zum Fließen gebracht werden.
Ein „Kontrollkonjugat" ist ein Konjugat, in dem das Bindemittel spezifisch für eine Kontrollverbindung ist. Ein Kontrollkonjugat wird bevorzugt angewendet, wenn es wahrscheinlich ist, dass das ganze Konjugat auf der Testlinie an den Analyt gebunden und nicht verfügbar sein wird, um als eine Kontrolle zu dienen. Die Kontrollverbindung ist typischerweise eine, die in der Probe, die analysiert wird, bekannt ist und ist in der Lage, das Kontrollbindemittel auf dem Kontrollstreifen zu binden. Gegebenenfalls kann das Bindemittel des Kontrollkonjugats spezifisch für eine Verbindung sein, die in der Kontrollfläche der Testmembran vorhanden ist.
Das Konjugat ist vorzugsweise in einer „Konjugatausgangsfläche" vorhanden. Die Konjugatausgangsfläche umfasst typischerweise Konjugat, das daran diffusionsfähig gebunden ist, wie getrocknetes Konjugat. Alternativ kann die Konjugatausgangsfläche Konjugat umfassen, das in Puffer wie einem Waschpuffer oder Konjugatpuffer suspendiert worden ist. In einer Ausführungsform ist die Konjugatausgangsfläche ein Konjugatpad, umfassend getrocknetes Konjugat, das durch Flüssigkeit mit der Testmembran verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform ist die Konjugatausgangsfläche ein Teil der Testmembran, auf der das Konjugat getrocknet worden ist. In einer weiteren Ausführungsform ist die Konjugatausgangsfläche ein Pufferpad, zu der Puffer, umfassend Konjugat, zugefügt werden kann, der durch Flüssigkeit mit der Testmembran verbunden ist. Die Konjugatausgangsfläche ist typischerweise stromaufwärts der Testfläche auf der Testmembran lokalisiert, so dass bei Zugabe einer Lösung, umfassend Konjugat, oder Löslichmachen des diffundierfähig gebundenen Konjugats, Konjugat über die Testmembran fließt, um die Testfläche zu kontaktieren.
Das Konjugat wird vorzugsweise mit „Waschpuffer" wie detaillierter nachstehend beschrieben gelöst. Kurz, Waschpuffer ist eine gepufferte Lösung, die vorzugsweise ein „Blockierungsmittel" umfasst. Blockierungsmittel sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen alle Moleküle oder Verbindungen ein, die nicht-spezifische Wechselwirkungen wie nicht-spezifische Antikörperbindung reduzieren. Bevorzugte Blockierungsmittel sind Proteine wie Casein und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Blockierungsmittel, die verwendet werden können, sind kommerziell erhältlich und werden für eine Fachperson offensichtlich sein.
„Probenpuffer" ist eine gepufferte Lösung, die vorzugsweise kein Konjugat umfasst. In manchen Ausführungsformen umfasst der Probenpuffer ein Blockierungsmittel, während er das in anderen Ausführungsformen nicht tut. Probenpuffer können gegebenenfalls vor der Zugabe der Probe auf die Membran aufgebracht werden, wie nachstehend detaillierter diskutiert.
Eine „Testmembran" ist eine feste Unterlage, umfassend eine Testfläche und gegebenenfalls eine Kontrollfläche. Die zu analysierende Probe wird typischerweise direkt auf die Testmembran aufgebracht, so dass sie die Testfläche und Kontrollfläche kontaktiert. Die Testmembran kann jede feste Unterlage sein, an die ein Analyt-Bindemittel und ein Kontroll-Bindemittel gebunden werden kann. Vorzugsweise ist die Testmembran Nitrocellulose.
Eine Testmembran liefert einen lateralen Fließpfad für Flüssigkeiten. Die Testmembran und andere Bestandteile des Teststreifens gelten als „durch Flüssigkeit verbunden", wenn Flüssigkeit wie eine flüssige Probe oder ein Puffer von einer Komponente zu einer anderen fließen kann. Wenn Bestandteile des Teststreifens mit einander in Kontakt sind, sind sie durch Flüssigkeit verbunden. Es wird jedoch von einer Fachperson erkannt werden, dass direkter Kontakt zwischen zwei bestimmten Komponenten nicht nötig ist für Verbindung durch Flüssigkeit.
„Testfläche", „Teststreifen" und „Testlinie" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Fläche auf der Testmembran, an die ein Analyt-Bindemittel angeheftet ist.
Ein „Analyt-Bindemittel", „spezifischer Bindungspartner" oder „Bindekomponente" ist jedes Molekül oder jede Verbindung, das/die so konfiguriert ist, dass es spezifisch an einen Analyt von Interesse bindet. Zum Beispiel und ohne Einschränkung kann das Analyt-Bindemittel Antigene, Antikörper, Rezeptoren, andere Polypeptide, Peptide, Haptene, Lectine, Nucleinsäuren, einschließlich Oligonucleotide, oder kleine Moleküle umfassen. In einer Ausführungsform ist das Analyt-Bindemittel ein Antigen, das spezifisch für einen Antikörper ist, der in einer Probe nachgewiesen werden soll. In einer anderen Ausführungsform ist das Analyt-Bindemittel ein Antikörper, der spezifisch für ein Antigen von Interesse ist.
„Kontrollfläche", „Kontrollstreifen" und „Kontrolllinie" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Fläche auf der Membran, an die das Kontroll-Bindemittel angeheftet ist.
Ein „Kontroll-Bindemittel" ist jedes Molekül oder jede Verbindung, das/die in der Lage ist, spezifisch an das Konjugat oder ein Kontrollkonjugat zu binden.
„Teststreifen" bezieht sich auf einen vollständigen Apparat, der verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines Analyts in einer Probe nachzuweisen. Ein Teststreifen umfasst vorzugsweise mindestens eine Testmembran mit einer Testfläche und einer Kontrollfläche. Wie nachstehend beschrieben, kann der Teststreifen in einem Gehäuse wie einem Plastikgehäuse vorhanden sein. Alternativ kann der Teststreifen ohne ein Gehäuse verwendet werden. Wenn in einem Gehäuse vorhanden, können der Teststreifen und das Gehäuse zusammen als ein „Testkarte" bezeichnet werden.
„Testkartenfenster" und „Probenfenster" beziehen sich auf ein Loch im Plastikgehäuse einer Testkarte, durch das eine Probe aufgetragen werden kann. Das Testkartenfenster ist vorzugsweise über der Testfläche und Kontrollfläche lokalisiert. Das Testkartenfenster ermöglicht vorzugsweise auch Betrachtung der Testergebnisse.
„Pufferfenster" bezieht sich auf ein Loch im Plastikgehäuse einer Testkarte, durch das Puffer aufgetragen werden kann. In einer Ausführungsform ist das Pufferfenster vorzugsweise so lokalisiert, um zu ermöglichen, dass Puffer auf ein Pufferpad aufgetragen wird. In einer anderen Ausführungsform ist das Pufferfenster so lokalisiert, um direktes Auftragen von Puffer auf die Testmembran zu ermöglichen.
„Volumenindikatorfenster" bezieht sich auf ein Loch im Plastikgehäuse einer Testkarte, durch das ein sichtbarer Probenvolumenindikator gesehen werden kann. Das Volumenindikatorfenster ist stromabwärts des Probenfensters lokalisiert. Der Probenvolumenindikator signalisiert, dass ein zulässiges Probenvolumen die Testfläche kontaktiert hat. Ein Probenvolumenindikator kann zum Beispiel Methylenblau oder eine andere Farbverbindung sein, die auf die Membran unmittelbar stromaufwärts des Volumenindikatorfensters aufgetragen worden ist. Der Probenvolumenindikator wird durch die Bewegung der Probe quer über das Volumenindikatorfenster getragen, was ein sichtbares Signal im Fester produziert. In anderen Ausführungsformen ist der Probenvolumenindikator eine Verbindung, die die Farbe ändert, wenn sie durch die Probe kontaktiert wird, wie ein pH-Indikator. Typischerweise wird ein Probenvolumenindikator verwendet, wenn ein großes Probenvolumen nötig ist, z.B. wenn angenommen wird, dass ein Analyt von Interesse in einer niedrigen Konzentration in einer Probe vorhanden ist. Zum Beispiel wird ein Probenvolumenindikator vorzugsweise verwendet, wenn Urin auf die Anwesenheit von hCG analysiert wird.
„Probe" bezieht sich auf jedes Material, das auf die Anwesenheit eines Analyt von Interesse untersucht werden soll. Die Probe ist vorzugsweise in flüssiger Form. Beispielhafte Proben schließen ohne Einschränkung Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Serum, Speichel und Urin ein. Wie nachstehend detaillierter beschrieben kann die Probe ein Feststoff sein. In diesem Fall wird die Probe jedoch vorzugsweise vor der Verwendung im Test gelöst oder extrahiert.
Die „Probenaufbringfläche" ist die Stelle auf der Membran, auf die die Probe aufgetragen wird. Die Probenaufbringfläche ist vorzugsweise stromabwärts der Konjugatausgangsfläche und stromaufwärts der Testfläche lokalisiert. Mehr bevorzugt umfasst die Probenaufbringfläche die Testfläche. Eine Probe kann direkt auf die Probenaufbringfläche aufgetragen werden, wie durch eine Pipette, oder indirekt, wie durch einen Docht, der in Kontakt ist mit der Membran.
Der Begriff „Antikörper" wird in seinem weitesten Sinn verwendet und schließt zum Beispiel und ohne Einschränkung vollständige Antikörper sowie Einzelketten-Antikörper, Antikörperfragmente und chimäre Antikörper ein, so lange sie die erwünschte Bindungsspezifität beibehalten.
Die Testkarte
Die hierin offenbarten diagnostischen Vorrichtungen umfassen vorzugsweise eine Testkarte 1, wie in 1–3 veranschaulicht. 1 illustriert eine Testkarte 1, umfassend eine Plastikgehäuse 10 mit einem oberen Teil 15 und einem unteren Teil 18, die zusammen einrasten. Es gibt zwei Öffnungen innerhalb des oberen Teils 15 des Plastikgehäuses 10: ein Probenfenster 20 und ein Pufferfenster 30. Das Probenfenster 20 ermöglicht das Aufbringen einer Probe auf die Probenaufbringfläche einer Membran, die innerhalb des Plastikgehäuses 10 enthalten ist. Die Probenaufbringfläche umfasst vorzugsweise eine Testfläche 140. Eine Kontrollfläche 150 ist vorzugsweise stromabwärts der Testfläche 140 auf der Membran lokalisiert. Das Pufferfenster 30 ermöglicht das Aufbringen von Puffer auf die Konjugatausgangsfläche 50. Die Membran ist Teil eines Teststreifens, der nachstehend im Detail beschrieben wird.
Ein weiteres fakultatives Volumenindikatorfenster (nicht gezeigt) ist in manchen Ausführungsformen stromabwärts der Testfläche lokalisiert. Das Volumenindikatorfenster, wenn vorhanden, ermöglicht dem Verwender, einen Indikator wie eine Farbänderung auf der Membran stromabwärts der Testfläche zu betrachten. Der Indikator signalisiert, dass ein ausreichendes Volumen der Probe die Testfläche kontaktiert hat, und dass der Verwender fortfahren kann, die Testfläche mit Konjugat in Kontakt zu bringen, um gebundenen Analyt wie nachstehend beschrieben nachzuweisen, wie durch Aufbringen von Puffer auf die Konjugatausgangsfläche.
2 illustriert eine Ansicht von oben auf die Testkarte 1, die das Probenfenster 20 und das Pufferfenster 30 innerhalb des Plastikgehäuses 10 zeigt. Die Testfläche der Membran 140 ist durch das Probenfenster 20 zugänglich, und die Konjugatausgangsfläche 50 ist durch das Pufferfenster 30 zugänglich. Eine Kontrollfläche 150 ist stromabwärts der Testfläche 140 lokalisiert. Obwohl mit einem Probenfenster 40, das rechteckig ist, und einem Pufferfenster 30, das rund ist, illustriert, kann das Fenster jede Form oder Größe haben. Sie sind jedoch vorzugsweise so geformt und in einer Größe, dass sie die Probe zur Probenaufbringfläche der Membran 40 und den Puffer zur Konjugatausgangsfläche 50 leiten. Zusätzlich ist das Probenfenster so konfiguriert, dass es das Betrachten der Testfläche 140, wenn ein positives Testergebnis erhalten wird, und der Kontrollfläche 150 ermöglicht.
3 illustriert eine Seitenansicht einer beispielhaften Testkarte 1. Der obere Teil 15 und untere Teil 18 des Plastikgehäuses 10 sind gezeigt. Das vergrößerte Ende (60) des oberen Teils 15 des Plastikgehäuses 10, das distal zum Pufferfenster (nicht gezeigt) ist, ermöglicht das Platzieren von Absorbermaterial wie einem Absorberpad oder einer Trockenmitteltablette innerhalb der Testkarte (1). Die Größe des vergrößerten Endes (60) wird abhängig von der Menge des verwendeten Absorbermaterials variieren, was wiederum vom Volumen der Probe und des Puffers, die im Test angewendet werden, abhängen wird.
Der Teststreifen
Ein Teststreifen umfasst eine Testmembran mit mindestens einer Testfläche. Ein Analyt-Bindemittel, das spezifisch für einen Analyt von Interesse ist, ist gebunden oder auf eine andere Weise auf der Testfläche immobilisiert. Mindestens ein Teil der Testfläche wird bei Beendigung des Tests sichtbar, wenn der Analyt von Interesse in der Probe vorhanden ist. In einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Testfläche immobilisiertes Antigen, und der Test ermöglicht die Identifizierung von bestimmten Antikörpern in einer Probe wie einer biologischen Flüssigkeit. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Testfläche gebundenen Antikörper, und der Test ermöglicht die Identifizierung eines bestimmten Antigens in einer Probe.
Die Probe wird auf die Probenaufbringfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche lokalisiert ist, zum Beispiel stromabwärts des Konjugatpads, aufgebracht. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probenaufbringfläche die Testfläche. In anderen Ausführungsformen ist die Probenaufbringfläche jedoch stromaufwärts der Testfläche lokalisiert, und die Probe fließt von der Probenaufbringfläche zur Testfläche.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Teststreifens ist in 4 graphisch dargestellt. Ein Teststreifen 100 zum Testen einer Probe auf die Anwesenheit eines Analyts von Interesse, wie einem Antikörper, umfasst vorzugsweise ein Pufferpad 110 in Kontakt mit einem Konjugatpad 120. Das Konjugatpad 120 ist wiederum in Kontakt mit einer Testmembran 130, umfassend eine Testfläche 140 und eine Kontrollfläche 150. Die Membran 130 ist wiederum in Kontakt mit einem Absorberpad 160. Das Absorberpad 160 ist gegebenenfalls in Kontakt mit einem weiteren Absorberpapier 170. Das Absorberpad 160 und/oder das fakultative Absorberpapier 170 können in weiterem Kontakt mit einem fakultativen Trockenmittel 180 wie einer Trockenmitteltablette sein.
In manchen Ausführungsformen ist eine entfernbare Filterhalterung 190 an den Teststreifen 100 angebracht. Die Filterhalterung 190 umfasst ein Filterpapier 200. Wenn die Filterhalterung 190 am Teststreifen 100 angebracht ist, ist das Filterpapier 200 direkt über der Probenaufbringfläche, die vorzugsweise die Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 umfasst, lokalisiert.
Genügend Probe muss an die Testfläche geliefert werden, um ein sichtbares, positives Ablesen bei Beendigung des Tests sicherzustellen, wenn der Analyt in der Probe vorhanden ist. Daher wird für Analyte, von denen angenommen wird, dass sie in einer niedrigen Konzentration in der Probe sind, zum Beispiel Antigene wie hCG im Urin, ein größeres Probenvolumen benötigt. Der Teststreifen 100 kann so konfiguriert sein, dass er die größeren Probenvolumina aufnimmt. Eine solche Ausführungsform ist in 7 illustriert, wo ein Probenbecher 500 am Teststreifen 100 angebracht ist. Der Probenbecher 500 umfasst einen Behälter zum Halten eines Volumens einer flüssigen Probe. Typischerweise wird der Probenbecher eine Öffnung im Boden haben, die ermöglicht, dass die Probe aus dem Probenbecher 500 fließt und die Testmembran 130 kontaktiert. Daher ist der Probenbecher 500 so lokalisiert, dass die Probe vom Probenbecher 500 in die Probenaufbringfläche der Testmembran 130 fließt und die Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 kontaktiert. Vorzugsweise umfasst die Probenaufbringfläche die Testfläche 140 und Kontrollfläche 150, und der Probenbecher 500 ist direkt über der Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 lokalisiert. Der Probenbecher 500 kann gegebenenfalls einen Filter umfassen, durch den die Probe vor dem Kontaktieren der Testmembran fließt.
Die Probe kann in den Probenbecher gegeben werden, während er an der Testkarte angebracht ist. In einer anderen Ausführungsform wird die Probe in den Testbecher platziert, und der Testbecher wird in der Folge an der Testkarte angebracht, und die Probe zur Probenaufbringfläche fließen gelassen.
Es ist wünschenswert, sicherzustellen, dass ein Volumen der Probe, umfassend eine nachweisbare Menge an Analyt, wenn vorhanden, die Testfläche 140 kontaktiert hat, bevor das Konjugat zu der Testfläche 140 zum Fließen gebracht wird. Ein Probenvolumenindikator wie ein Indikatorfarbstoff, der stromabwärts der Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 lokalisiert ist, kann verwendet werden, um nachzuweisen, dass eine ausreichende Menge der Probe die Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 kontaktiert hat. Zum Beispiel kann ein Indikatorfarbstoff wie Methylenblau auf das Absorberpad 160 oder das Absorberpapier 170 stromabwärts der Testmembran aufgetragen werden. Der Fluss der flüssigen Probe entlang des Absorberpads 160 oder des Absorberpapiers 170 lässt den Farbstoff fließen, was ein sichtbares Signal ergibt, zum Beispiel eine sichtbare blaue Farbe. Das Signal kann durch ein Volumenindikatorfenster in einem Fenster in der Testkarte (nicht gezeigt) beobachtet werden.
In manchen Ausführungsformen, besonders jenen, in denen ein großes Probenvolumen (größer als etwa 50 μl) aufgebracht werden soll, ist das Konjugatpad 120 nicht durch Flüssigkeit mit der Testmembran 130 verbunden. Eine solche Ausführungsform ist in 7 illustriert. Die Trennung des Konjugatpads 120 und der Testmembran 130 verhindert Mischen des Konjugats und der Probe, bevor die Probe die Testfläche 140 kontaktiert. Nachdem die Probe die Testfläche 140 und Kontrollfläche 150 kontaktiert hat, wird das Konjugatpad 120 so bewegt, dass es durch Flüssigkeit mit der Testmembran 130 verbunden ist. Puffer wird dann auf das Pufferpad 110 aufgebracht, um den Test zu starten. Puffer kann auf das Pufferpad 110 direkt durch ein Pufferfenster oder durch Aufbrechen einer Ampulle 300, die den Puffer enthält, aufgebracht werden, was so den Puffer zum Pufferpad 110 zum Fließen bringt. In einer Ausführungsform wird der Puffer auf das Pufferpad 110 aufgebracht, bevor das Konjugatpad 120 bewegt wird, um es durch Flüssigkeit mit der Membran 130 zu verbunden. In alternativen Ausführungsformen wird Puffer direkt auf das Konjugatpad 120 aufgebracht.
Das Verfahren, das als solches nicht Teil der gegenwärtigen Erfindung ist, durch das das Konjugatpad 120 veranlasst wird, in flüssige Verbindung mit der Membran 130 zu treten, ist in keiner Weise limitiert. In einer Ausführungsform verschiebt der Verwender einen beweglichen Teil des Gehäuses, an den das Konjugatpad 120 und gegebenenfalls das Pufferpad 110 angehängt sind, was so das Konjugatpad 120 mit der Membran 130 in Kontakt bringt. Der Mechanismus zum Bewegen des Konjugatpads 120, um es durch Flüssigkeit mit der Testmembran 110 zu verbinden, verursacht vorzugsweise auch das Aufbrechen der Pufferampulle 300. Der Mechanismus kann auch bewirken, dass der Probenbecher 500 vom Teststreifen 110 entfernt wird.
Eine Trockenmitteltablette 180 ist vorzugsweise durch Flüssigkeit mit dem Absorberpapier 170 verbunden. Die Größe der Trockenmitteltablette 180 wird gewählt, um das Gesamtvolumen der auf die Testmembran 130 aufgebrachten Probe absorbieren zu können. Die Trockenmitteltablette und jegliches andere Absorbermaterial ist stromabwärts der Probenaufbringfläche lokalisiert und ermöglicht das Fließen der Probe über die Testfläche.
In anderen Ausführungsformen wird der Probenbecher mit einem Docht ersetzt, der mit einer flüssigen Probe in Kontakt gebracht wird. Die Probe fließt entlang des Dochts zu der Probenaufbringfläche der Testmembran und kontaktiert die Testfläche und Kontrollfläche. In einer bestimmten Ausführungsform wird der Docht in den Urinstrahl platziert, um Urin auf die Anwesenheit eines Analyts wie hCG zu analysieren. In diesen Ausführungsformen ist das Konjugatpad während der Zeit, in der die Probe auf den Docht aufgebracht wird, vorzugsweise nicht durch Flüssigkeit mit der Testmembran verbunden. Nachdem genügend Probe die Testfläche kontaktiert hat, wird das Konjugatpad bewegt, um die Testmembran zu kontaktieren. Der Mechanismus zum Bewegen des Konjugatpads kann auch dazu dienen, um den Docht zu entfernen. Puffer wird in der Folge zum Pufferpad oder direkt auf das Konjugatpad zugefügt, um den Test zu starten. Der Puffer kann direkt auf das Pufferpad durch ein Pufferfenster wie vorstehend beschrieben zugefügt werden. Alternativ ist der Puffer in einer Ampulle innerhalb der Testkarte vorhanden und wird durch Aufbrechen oder anderweitiges Öffnen der Ampulle zum Fließen zum Pufferpad und/oder Konjugatpad gebracht.
Der Teststreifen ist vorzugsweise in einem Gehäuse enthalten, wie in 2 gezeigt und oben beschrieben.
5 illustriert ein positives Testergebnis, das die Anwesenheit des Analyts von Interesse in einer Probe anzeigt. Die Testfläche 140 der Membran 130 ist als eine Linie quer über das Probenfenster 20 sichtbar. Zusätzlich ist die Kontrollfläche 150 als eine Linie quer über das Probenfenster 20 sichtbar, was anzeigt, dass das Konjugat von der Konjugatausgangsfläche 50 über die Testfläche 140 geflossen ist. Im Gegensatz dazu ist ein negatives Ergebnis in 6 illustriert. Bei einem negativen Ergebnis ist nur die Kontrollfläche 150 als eine Linie quer über das Probenfenster 20 sichtbar. Die Kontrolle zeigt wiederum an, dass das Konjugat von der Konjugatausgangsfläche 50 über die Testfläche 140 geflossen ist. So ist das Fehlen einer Linie in der Testfläche 140 ein Ergebnis des Fehlens von gebundenem Analyt von Interesse.
Verwendung des Teststreifens
Eine Probe, die auf Anwesenheit eines bestimmten Analyst von Interesse getestet werden soll, wird auf die Probenaufbringfläche der Testmembran so aufgebracht, dass sie die Testfläche kontaktiert. In der bevorzugten Ausführungsform wird die Probe auf die Membran aufgebracht und mit der Testfläche kontaktieren gelassen, bevor das Konjugat die Testfläche kontaktiert. So hat der Analyt von Interesse in der Probe, wenn vorhanden, die Möglichkeit, an das Analyt-Bindemittel in der Testfläche vor Konjugatbindung zu binden.
Wenn der Teststreifen in einem Gehäuse ist, wird die Probe vorzugsweise durch ein Probenfenster aufgebracht. In diesem Fall umfasst die Membran eine Probenaufbringfläche, die durch das Probenfenster zugänglich ist. Vorzugsweise umfasst die Probenaufbringfläche mindestens eine positive Testfläche. Mehr bevorzugt umfasst die Probenaufbringfläche eine Testfläche und eine Kontrollfläche. Alternativ kann die Probe durch einen Docht oder einen Becher aufgebracht werden, so dass sie zur Probenaufbringfläche der Membran fließt und die Test- und Kontrollflächen kontaktiert.
Wenn der Teststreifen nicht in einem Gehäuse ist, kann die Probe direkt auf die Probenaufbringfläche der Membran aufgebracht werden, vorzugsweise umfassend die Testfläche und die Kontrollfläche. Alternativ kann die Probe auf die Membran auf einer Probenaufbringfläche stromaufwärts der Testfläche aufgebracht werden und über die Membran laufen gelassen werden, um die Testfläche zu kontaktieren. Der Probe wird jedoch vorzugsweise ermöglicht, die Testfläche vor der Zugabe von Konjugat zu der Membran zu kontaktieren.
In einer Ausführungsform wird die Probe in einen Probenbecher gesammelt oder platziert. Der Becher ist an das Gehäuse angebracht und ermöglicht der Probe, zu der Probenaufbringfläche der Membran zu fließen und die Testfläche und Kontrollfläche zu kontaktieren. Ein Probenbecher wird vorzugsweise verwendet, wenn ein Probenvolumen von mehr als etwa 10 μl verwendet werden soll. Der Probenbecher kann gegebenenfalls einen Filter umfassen, durch den die Probe vor dem Kontaktieren der Membran fließt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Probe auf einen Docht aufgebracht, der in Kontakt mit der Membran ist. Der Docht erlaubt der Probe, zu der Probenaufbringfläche der Membran zu fließen und die Test- und Kontrollflächen zu kontaktieren. Der Docht umfasst vorzugsweise Glaspapier, Polyester, Cellulose oder ein anderes Material, das der Probe ermöglichen wird, zu der Membran, umfassend die Testfläche, zu wandern. Wenn die Testkarte in einem Gehäuse ist, kann der Docht aus dem Gehäuse herausragen, so dass Zugang zum Docht zum Aufbringen der Probe möglich ist. Zum Beispiel, wenn die Anwesenheit eines bestimmten Analyts wie hCG im Urin nachgewiesen werden soll, kann der Docht in den Urinstrahl der Person, die getestet werden soll, platziert werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Docht mit der zu analysierenden Probe, zum Beispiel Körperflüssigkeiten wie Speichel, in Kontakt gebracht werden.
Die zu testende Probe wird vorzugsweise auf die Probenaufbringfläche der Membran in flüssiger Form aufgebracht. Beispielhafte Proben, die analysiert werden können, schließen ohne Einschränkung Serum, Plasma, Vollblut, Speichel und Urin ein. Feste oder halbfeste Proben können gelöst und auf die Membran aufgebracht oder vor dem Aufbringen extrahiert werden.
In anderen Ausführungsformen wird der Probenpuffer, die vorzugsweise kein Konjugat enthält, vor dem Aufbringen der Probe auf die Membran aufgebracht. In manchen Ausführungsformen umfasst der Probenpuffer ein Blockierungsmittel. Vorzugsweise wird der Probenpuffer auf die Membran an der Probenaufbringfläche aufgebracht. Etwa 1 bis etwa 25 μl Probenpuffer werden vorzugsweise auf die Membran aufgebracht, mehr bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 μl, noch mehr bevorzugt etwa 1 bis 5 μl. In einer bestimmten Ausführungsform werden 5 μl Probenpuffer auf die Probenaufbringfläche der Membran aufgebracht, gefolgt von 5 μl Serum, Plasma, Vollblut oder einer anderen flüssigen Probe. Die Zugabe von Probenpuffer vor dem Aufbringen des Waschpuffers wird besonders beim Testen auf HCV wie nachstehend beschrieben bevorzugt, und wenn viskose Proben verwendet werden. Die Verwendung von Probenpuffer erhöht die Empfindlichkeit des Tests und bewirkt, dass viskose Proben schneller fließen.
Probenpuffer umfasst vorzugsweise ein pufferndes Agens und ein Konservierungsmittel. Gegebenenfalls kann er auch ein oder mehrere Detergenzien und/oder Zucker umfassen. Jedes puffernde Agens kann verwendet werden, vorzugsweise in einer Menge, die den gewünschten pH-Wert des Probenpuffers beibehält. Vorzugsweise ist der pH-Wert des Probenpuffers etwa 7,2 bis etwa 7,6. Zum Beispiel und ohne Einschränkung kann der Puffer aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus HEPES, Tris und Phosphatpuffer. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Probenpuffer etwa 0,01 % bis etwa 0,5% HEPES, mehr bevorzugt etwa 0,02 bis etwa 0,05% HEPES. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Probenpuffer etwa 0,01 % bis etwa 0,5% Phosphat, mehr bevorzugt etwa 0,02 bis etwa 0,05% Phosphat. Ein Fachmann wird in der Lage sein, die Menge an pufferndem Agens anzupassen, um den gewünschten pH-Wert beizubehalten.
Der Probenpuffer umfasst auch vorzugsweise ein Konservierungsmittel wie Natriumazid oder Proclin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Probenpuffer etwa 0,1 % bis etwa 1,0% Natriumazid, mehr bevorzugt etwa 0,1 % bis etwa 0,2%, noch mehr bevorzugt etwa 0,2%.
Abhängig von der Art der zu testenden Probe wird die Probe gegebenenfalls durch einen Filter auf die Membran aufgebracht. Beispielhafte Probenmaterialien, die vorzugsweise gefiltert werden, schließen Vollblut, Kotproben, Urin, Nahrungsmittelextrakte und Schmutzextrakte ein. In einer Ausführungsform wird Vollblut durch einen Membranfilter aufgebracht. Der Filter entfernt Kontaminanten und ermöglicht Analyten wie Antikörpern, hindurch zu passieren, was so die Empfindlichkeit des Tests erhöht. Der Filter ist vorzugsweise in einer Halterung eingeschlossen, die wenn nötig an die Testkarte oder den Teststreifen angebracht werden kann. Wenn an eine Testkarte angebracht, ist der Filter vorzugsweise direkt über dem Probenfenster angebracht. Filtermedium wird basierend auf der Art der zu filternden Probe ausgewählt werden. Eine solche Auswahl liegt innerhalb des Könnens eines Fachmanns. Zum Beispiel kann das Filtermaterial für Vollblutproben ohne Einschränkung Pall BTS-SP300^TM sein.
Wie vorstehend diskutiert ist der Filter vorzugsweise an den Teststreifen durch eine entfernbare Filterhalterung angebracht, obwohl der Filter für besondere Anwendungen permanent befestigt sein könnte. Die Filterhalterung ist typischerweise eine Vorrichtung, die auf dem Gehäuse der Testkarte einrastet. Das Design und die Art der Vorrichtung können variieren, aber es ist typischerweise aus Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen oder einem anderen Kunststoff gebildet.
Die Testfläche ist ein Teil der Membran, die mit einem Bindemittel beschichtet ist, vorzugsweise einem Protein, das zu spezifischer Bindung an den Analyt von Interesse fähig ist. Zum Beispiel kann die positive Testfläche mit Antigen beschichtet sein, das spezifisch für einen Antikörper von Interesse ist. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Testfläche gebundenes HIV-Antigen oder Hepatitis-Antigen, wie detaillierter in den Beispielen nachstehend beschrieben. Wenn die Testfläche Antigen umfasst, werden vorzugsweise etwa 0,025 bis etwa 0,4 μg Antigen verwendet.
In anderen Ausführungsformen wird ein Antikörper, der spezifisch ist für ein Antigen von Interesse, auf der Testfläche immobilisiert. Der Antikörper kann ein polyclonaler oder monoclonaler Antikörper sein. Wenn die Testfläche einen Antikörper umfasst, werden vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 20 μg Antikörper aufgebracht, mehr bevorzugt etwa 0,2 bis etwa 2 μg, noch mehr bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 1 μg. In einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Testfläche einen Antikörper gegen hCG, vorzugsweise einen monoclonalen Antikörper gegen hCG.
Das Bindemittel kann auf die Membran in jedem gewünschten Muster aufgebracht werden; daher kann das sichtbare Ergebnis eines positiven Tests jede Gestalt haben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Testfläche linear, eine Linie formend, die sich von einer Seite der Membran zu der anderen erstreckt, so dass eine vertikale Linie quer über das Probenfenster erscheint, wenn ein positives Ergebnis erhalten wird, was die Anwesenheit des Analyts in der Probe anzeigt. In anderen Ausführungsformen ist die Testfläche ähnlich einem Symbol wie einem „+" geformt.
Es ist möglich, auf mehr als eine Art von Analyt in einem einzelnen Teststreifen zu testen. In diesem Fall werden zusätzliche positive Testflächen auf der Testmembran hergestellt. Zum Beispiel kann eine zweite positive Testfläche ein Antigen gegen einen zweiten Typ von Antikörper oder einen Antikörper gegen eine zweiten Typ von Antigen umfassen. Das Bindemittel auf einer zusätzlichen positiven Testfläche ist nicht notwendigerweise vom gleichen Typ wie das Bindemittel auf der ersten Testfläche. So kann das Bindemittel auf einer ersten Testfläche ein Antikörper sein, während ein Bindemittel auf einer zweiten Testfläche ein Antigen sein kann. Auf diese Weise kann eine Probe auf die Anwesenheit von mehr als einer Art von Analyt analysiert werden.
Jede zusätzliche posititve Testfläche kann eine Form haben, die unterschiedlich zu der der ersten Testfläche ist, um dem Verwender zu ermöglichen, leicht die Art des positiven Ergebnisses zu unterscheiden. Abhängig von der Art der zusätzlichen Analyte, auf die getestet werden soll, können zusätzliche Konjugate, die die verschiedenen Analyte binden, notwendig sein. Zum Beispiel, wenn die Analyte von Interesse zwei unterschiedliche Antikörper sind, kann ein einziges Konjugat, umfassend Protein A, verwendet werden. Wenn jedoch ein Analyt ein Antikörper ist und ein zweiter Analyt ein Antigen ist, würden zwei unterschiedliche Konjugate benötigt werden, eines, das spezifisch den Antikörper bindet, und eines, das spezifisch das Antigen bindet.
Die Kontrollfläche umfasst vorzugsweise ein Kontroll-Bindemittel, das an das Konjugat binden wird. Durch Lokalisieren der Kontrollfläche stromabwärts der positiven Testfläche wird eine Reaktion auf der Kontrollfläche anzeigen, dass das Konjugat über die Testfläche gewandert ist, wo es verfügbar war, um zu reagieren, wenn der Analyt von Interesse vorhanden war. Wenn das Konjugat gestaltet ist, um einen Antikörper zu erkennen, umfasst die Kontrollfläche vorzugsweise ein Immunglobulin wie Kaninchen-IgG. Wenn das Konjugat einen Antikörper umfasst, umfasst die Kontrollfläche vorzugsweise ein Antikörper-Bindemittel wie Protein A. Die Kontrollfläche kann jegliche erwünschte Form haben, wie eine Linie oder ein Symbol, zum Beispiel „-".
In anderen Ausführungsformen umfasst die Kontrollfläche ein Kontroll-Bindemittel, das an ein Kontroll-Konjugat bindet. Zum Beispiel kann die Kontrollfläche β-Gal umfassen, und das Kontroll-Konjugat kann an Gold konjugierte β-Galactosidase umfassen.
Das Bindemittel und Kontroll-Bindemittel können auf die Testmembran durch jegliches, auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren aufgebracht werden. Sie werden typischerweise durch Inkontaktbringen der Testmembran mit dem Bindemittel aufgetragen, wie durch Sprayen oder Inkontaktbringen auf der Testmembran unter Verwendung eines Pumpendispensier-Systems. Solche Systeme sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Kinematic Automation.
Wenn die Probe die Testfläche kontaktiert, wenn der Analyt von Interesse in der Probe vorhanden ist, wird sie an das Bindemittel auf der Testfläche binden. Überschüssiger, ungebundener Analyt wird von der Testfläche durch das Wandern des Puffers entlang der Membran wie unten beschrieben weggewaschen.
Nachdem die Probe auf die Membran aufgebracht worden ist, wird Waschpuffer auf die Testmembran aufgebracht. Vorzugsweise werden anfänglich etwa 1 bis etwa 20, mehr bevorzugt etwa 1 bis 5 Tropfen Waschpuffer aufgebracht. Zusätzlicher Waschpuffer kann in der Folge aufgetragen werden, wenn es nötig ist, um die Reaktion zu klären.
Der Waschpuffer trägt vorzugsweise das Konjugat zu der Testfläche. Waschpuffer kann direkt auf die Testmembran aufgebracht werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird jedoch Waschpuffer auf ein stromaufwärts liegendes Pufferpad aufgebracht, von dem er zu der Testmembran fließt. Das Pufferpad kann aus jeglichem Material gemacht sein, das den Puffer enthalten kann und ihn durch die Membran in einer gewünschten Rate fließen lässt. Zum Beispiel kann das Pufferpad ein oder mehrere Materialien umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glaspapier, Cellulose und Polyester. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Pufferpad Whatman GF/DVA-Glaspapier. Der Fachmann wird in der Lage sein, ein geeignetes Material für das Pufferpad basierend auf solchen Faktoren auszuwählen, wie dem Gehäusedesign des Lateral-Flow-Teststreifens, der gewünschten Flussrate und der Menge an Puffer, die vom Pufferpad gehalten werden soll.
Der Waschpuffer kann direkt auf das Pufferpad aufgebracht werden, wie mit einer Pipette oder einem Tropfglas. In einer anderen Ausführungsform ist jedoch die passende Menge an Waschpuffer in einem Behälter vorhanden, der benachbart zu dem Pufferpad ist. Zum Beispiel kann der Waschpuffer in einer Glas- oder Plastikampulle enthalten sein. Nach Zugabe der Testprobe wird der Behälter, umfassend den Waschpuffer, aufgebrochen oder auf andere Weise geöffnet, was dem Waschpuffer ermöglicht, das Pufferpad zu kontaktieren.
Die Zusammensetzung des Waschpuffers kann variiert werden, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen. Vorzugsweise umfasst der Waschpuffer ein pufferndes Agens, ein Konservierungsmittel, ein Detergens, Zucker und andere Materialien, die wirken, um Hintergrund und/oder nicht-spezifische Bindung zu reduzieren.
Jedes puffernde Agens kann verwendet werden, das den gewünschten pH-Wert des Puffers, vorzugsweise etwa 7,2 bis etwa 7,6, aufrechterhält. Zum Beispiel und ohne Einschränkung kann der Puffer ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus HEPES, Tris und Phosphatpuffer. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Waschpuffer etwa 0,01 % bis etwa 0,5% HEPES, mehr bevorzugt etwa 0,02 bis etwa 0,2% HEPES und noch mehr bevorzugt etwa 0,02 bis etwa 0,05% HEPES. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Waschpuffer 0,025% HEPES.
Der Waschpuffer kann auch ein Konservierungsmittel wie Natriumazid oder Proclin umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Waschpuffer etwa 0,1 bis etwa 0,5% Natriumazid, mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 0,2%.
Natriumchlorid oder ein vergleichbares Salz ist vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1%, mehr bevorzugt etwa 0,85% vorhanden. EDTA kann vorhanden sein, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1%. Ein Zucker wie Mannit kann auch vorhanden sein. Bevorzugte Mannit-Konzentrationen sind von etwa 1% bis etwa 5%. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mannit-Konzentration etwa 1%.
Ein Blockierungsmittel ist vorzugsweise auch im Waschpuffer vorhanden. Das Blockierungsmittel kann jegliches Blockierungsmittel sein, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Vorzugsweise ist das Blockierungsmittel ein Protein wie Casein oder Rinderserumalbumin (BSA). Das Blockierungsmittel ist vorzugsweise im Waschpuffer in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5% vorhanden, mehr bevorzugt von etwa 0,02 bis etwa 0,2%. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist Casein im Waschpuffer in einer Konzentration von etwa 0,1% vorhanden.
Der Waschpuffer umfasst typischerweise auch ein Detergens, vorzugsweise ein nicht-ionisches Detergens wie Triton X100^TM oder Tween. Vorzugsweise ist das Detergens in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 1 % vorhanden, mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 0,5%. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Waschpuffer Triton X100 in einer Konzentration von etwa 0,1%.
Der pH-Wert des Waschpuffers wird auf etwa 7 und 8 angepasst, mehr bevorzugt auf etwa 7,2 und 7,6. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert des Waschpuffers etwa 7,2.
Der Teststreifen umfasst auch eine Konjugatausgangsfläche. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Teststreifen ein Konjugatpad, auf dem das Konjugat wie nachstehend beschrieben getrocknet worden ist. Waschpuffer fließt vom Pufferpad zum Konjugatpad, mit dem es in Kontakt ist. Das Konjugatpad ist im Gegenzug in Kontakt mit der Testmembran. In manchen Ausführungsformen wird das Konjugatpad jedoch nach Zugabe der Probe mit der Membran in Kontakt gebracht. Insbesondere, wenn ein großes Probenvolumen verwendet wird, wird das Konjugatpad vorzugsweise mit der Membran in Kontakt gebracht, nachdem die Probe die Testfläche kontaktiert hat.
Ausreichend Waschpuffer wird auf das Pufferpad aufgebracht, um das Konjugat zu lösen, das diffusionsfähig an das Konjugatpad gebunden ist, und das Konjugat entlang der Testmembran zu der Testlinie und Kontrolllinie zum Fließen zu bringen. Die Menge Puffer, die verwendet werden soll, kann durch einen Fachmann basierend auf solchen Faktoren wie der Menge an Konjugat, das auf dem Konjugatpad gebunden ist, der Größe der Membran und der Menge der zu analysierenden Probe bestimmt werden. Vorzugsweise werden 1 bis 10 Tropfen Pufferlösung auf das Pufferpad aufgebracht, wenn das Pufferpad ungefähr 2 cm mal 5 mm ist, mehr bevorzugt 2 bis fünf Tropfen und noch mehr bevorzugt 3 bis 4 Tropfen.
In alternativen Ausführungsformen ist kein Konjugatpad vorhanden. In einer alternativen Ausführungsform ist das Konjugat im Waschpuffer in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,2 OD bis etwa 1,0 OD/ml vorhanden. Der Waschpuffer, der das Konjugat enthält, kann auf das Pufferpad aufgebracht werden. Das Konjugat fließt so mit dem Waschpuffer vom Pufferpad zu der Membran, wo es die Testfläche und Kontrollfläche kontaktiert. In einer anderen Ausführungsform wird der Waschpuffer, der das Konjugat enthält, direkt auf die Testmembran aufgebracht. Der Waschpuffer, der das Konjugat enthält, kann in einer Ampulle vorhanden sein und durch Aufbrechen oder anderweitiges Öffnen der Ampulle zum Fließen zu der Membran gebracht werden. Der Waschpuffer, der das Konjugat enthält, wird vorzugsweise an einem Punkt stromaufwärts der Testfläche auf die Membran aufgebracht. In manchen Ausführungsformen wird jedoch der Waschpuffer, umfassend das Konjugat, direkt auf die Testfläche aufgebracht, nachdem die Probe aufgebracht worden ist.
In einer anderen Ausführungsform ist das Konjugat diffundierfähig wie durch Trocknen direkt an die Membran gebunden, die die Testfläche und Kontrollfläche umfasst. Waschpuffer kann dann auf ein Pufferpad, das in Kontakt ist mit der Membran, oder direkt auf die Testmembran aufgebracht werden. Der Waschpuffer löst das getrocknete Konjugat und trägt es entlang der Testmembran zur Testfläche und Kontrollfläche.
Der Waschpuffer, umfassend Konjugat, kontaktiert vorzugsweise die Testfläche, nachdem die Probe aufgebracht worden ist und jeglicher vorhandene Analyt in der Probe die Möglichkeit gehabt hat, das immobilisierte Bindemittel zu binden. Daher wird der Waschpuffer vorzugsweise auf den Teststreifen aufgebracht, nachdem die Probe auf die Testfläche aufgebracht wurde.
Das vorstehend im Detail beschriebene Konjugat wird zur Verwendung im Test durch Verdünnung in Konjugatpuffer hergestellt. Vorzugsweise wird Arbeitskonjugat durch Verdünnen des Konjugats in Konjugatpuffer auf ungefähr 3 OD/ml hergestellt. Die Zusammensetzung des Konjugatpuffers kann abhängig von der Art des Konjugats variiert werden. Ein beispielhafter Konjugatpuffer umfasst einen Puffer wie HEPES, Tris, Phosphat oder einen anderen ähnlichen Puffer, der auf dem Fachgebiet bekannt ist. Ein bevorzugter Konjugatpuffer umfasst etwa 0,02 bis 0,2% HEPES-Puffer, mehr bevorzugt etwa 0,025% HEPES. Der Konjugatpuffer kann auch ein Salz umfassen, vorzugsweise Natriumchlorid. Natriumchlorid wird zu einer Konzentration von etwa 0,1% zugefügt, mehr bevorzugt etwa 0,85%. Ein Konservierungsmittel wie Natriumazid oder Proclin kann auch in den Konjugatpuffer in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,2% eingeschlossen sein.
Der Konjugatpuffer umfasst auch vorzugsweise EDTA (etwa 0,1%), Casein in einer Konzentration von etwa 0,02 bis etwa 0,2%, mehr bevorzugt etwa 0,15%, Rinderserumalbumin (BSA) in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3%, mehr bevorzugt etwa 1%, Mannit in einer Konzentration von etwa 1% bis etwa 5%, mehr bevorzugt etwa 1%, Saccharose in einer Konzentration von etwa 1 % bis etwa 5%, mehr bevorzugt etwa 1%. Triton X100 kann in den Puffer eingeschlossen sein, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,5%, mehr bevorzugt etwa 0,1%.
Der Konjugatpuffer wird vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 7,2 bis etwa 7,6 eingestellt, mehr bevorzugt auf einen pH-Wert von etwa 7,2.
In einer Ausführungsform wird nach der Herstellung des Arbeitskonjugats durch Verdünnen des Konjugats im Konjugatpuffer das Arbeitskonjugat auf ein Konjugatpad getrocknet, wie durch Vakuumtrocknung. Das Konjugatpad wird vorzugsweise in Streifen von geeigneter Größe für die Verwendung im Teststreifen geschnitten. In den nachfolgenden Beispielen wird das Konjugatpad in 5 mm × 5 mm-Streifen geschnitten.
Das Konjugatpad umfasst vorzugsweise Glasfaser, Glaspapier, Polyester oder Cellulosepapier. Solche Materialen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind zum Beispiel von Millipore, S&S und Whatman erhältlich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Konjugatpad ein kommerziell erhältliches Glasfaser-Konjugatpad GFCP203000 (Millipore).
Wie vorstehend beschrieben, löst der Waschpuffer das getrocknete Konjugat und bringt es vom Konjugatpad und entlang der Testmembran über die Testfläche und Kontrollfläche zum Fließen.
Die Testmembran kann jedes Material sein, an das ein Protein oder ein anderes Bindemittel entweder kovalent oder nicht-kovalent gebunden werden kann, und entlang dem das Konjugat mit dem Waschpuffer fließen kann. Die Testmembran ist vorzugsweise eine Nitrocellulosemembran. Andere Membranen mit höheren oder niedrigeren Flussraten können für die Verwendung als die Testmembran durch einen Fachmann basierend auf solchen Faktoren wie der gewünschten Empfindlichkeit und Testzeit und Kosten ausgewählt werden.
Wenn das Konjugat mit dem Waschpuffer über die Membranen fließt, kontaktiert es die Testfläche. Wenn der Analyt von Interesse vorhanden und auf der Testfläche an das Bindemittel gebunden ist, wird das Konjugat im Puffer an den Analyt binden.
Der Waschpuffer umfassend Konjugat, das nicht an die Testfläche gebunden hat, wird weiter über die Membran zu der Kontrollfläche fließen. Konjugat wird an das Kontrollbindemittel binden. Der Waschpuffer wird auch ungebundene Probe von den Test- und Kontrollflächen tragen.
Waschpuffer einschließlich ungebundenem Konjugat und ungebundener Probe werden dann zu einem Absorberpad fließen, das mit dem stromabwärts liegenden Ende der Membran in Kontakt ist. Das Absorberpad kann aus jedem absorbierenden Material, dass auf dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt sein. Vorzugsweise ist das Absorberpad ein Absorberpapier wie S&S 900^TM-Papier. Andere Absorberpapiere sind in dem Fachbereich wohlbekannt und können durch einen Fachmann abhängig von der endgültigen Konfiguration des Teststreifens gewählt werden.
Der Waschpuffer kann weiter durch das Absorberpad und in ein Absorberpapier fließen, das mit dem Absorberpad in Kontakt ist. Das Absorberpapier wird vorzugsweise verwendet, wenn eine große Menge an Puffer absorbiert werden muss.
Eine Molekularsieb-Trockenmitteltablette kann auch in den Teststreifen inkorporiert sein. In einer Ausführungsform fließt der Puffer mit ungebundenem Konjugat vom Absorberpapier in die Trockenmitteltablette, mit der das Papier in Kontakt ist. Die Trockenmitteltablette hält die absorbierte Flüssigkeit und verhindert das Zurückfließen in den Teststreifen.
Die Trockenmitteltablette kann auch den Teststreifen vor der Verwendung trocken halten. Eine bevorzugte Trockenmitteltablette ist eine 0,395 g Tri-Sorb-Tablette, erhältlich von Sud-Chemie (Produktnummer 43-01).
Ein Fachmann kann die geeignete Größe und das Material für das Absorberpad, Absorberpapier und die Trockenmitteltablette abhängig von der endgültigen Konfiguration des Teststreifens, einschließlich dem Gesamtvolumen von Probe und Puffer, die verwendet werden sollen, auswählen.
Der gesamte Teststreifen ist vorzugsweise in einem Gehäuse wie einem Plastikgehäuse enthalten. Wie vorstehend beschrieben, umfasst in einer Ausführungsform das Gehäuse ein Probenfenster, durch das die Probe zu der Membran, die die Test- und Kontrollflächen enthält, zugefügt werden kann. Das Gehäuse kann auch ein Pufferfenster umfassen, durch das Puffer auf das Pufferpad oder die Membran aufgebracht werden kann. Das Gehäuse kann auch ein Volumenindikatorfenster umfassen, durch das ein Signal gesehen werden kann, das anzeigt, dass ein ausreichendes Probenvolumen die Testfläche kontaktiert hat. Ein ausreichendes Probenvolumen ist ein Volumen der Probe, von dem angenommen wird, dass es genug Analyt von Interesse, wenn vorhanden, enthält, dass ein sichtbares Signal auf der Testfläche bei Beendigung des Tests produziert wird, wenn der Analyt in der Probe vorhanden ist. Zum Beispiel ist für einen Test, um hCG im Urin nachzuweisen, ein ausreichendes Probenvolumen etwa 200 μl Urin.
Die Ergebnisse des Tests werden vorzugsweise etwa 1 bis etwa 5 Minuten nach Zugabe von Waschpuffer zu dem Teststreifen abgelesen. In einer Ausführungsform werden Ergebnisse etwa 2 bis 4 Minuten nach Zugabe von Waschpuffer abgelesen, mehr bevorzugt etwa 3 bis 4 Minuten nach Zugabe von Waschpuffer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Ergebnisse 1 Minute nach Zugabe von Waschpuffer abgelesen. Wie in 7 gezeigt, wird für ein positives Ergebnis die Testlinie (300) sichtbar. Ein sichtbarer Kontrollstreifen (400) zeigt an, dass der Test korrekt funktioniert hat. Wie in 6 illustriert, wird ein negatives Ergebnis angezeigt, wenn die Kontrolllinie (400) sichtbar ist, nicht aber die Testlinie.
Beispiel 1 Konstruktion einer HIV-Testkarte
Ein schneller, visueller Lateral-Flow-Test zum Nachweis von Antikörpern gegen menschliches Immunschwächevirus wurde hergestellt. Die Anordnung der Teststreifen war im Wesentlichen wie in 1 illustriert.
Die Teststreifen umfassten eine Plastikunterlage (6 cm × 5 mm) mit Klebemittel an beiden Seiten. Die Plastikunterlage war zwischen etwa 2 mil und etwa 20 mil dick.
Eine Testlinie und eine Kontrolllinie wurde auf einer Nitrocellulosemembran (Millipore HF09004) durch Sprayen mit einem Pumpendispensier-System (Kinematic Automation) hergestellt. Die Testlinie umfasste eine vertikale Linie von HIV-Antigen. Das HIV-Antigen war ein Gemisch von rekombinanten HIV-1-Glycoproteinantigenen (GP120 (etwa 0,15 mg/ml) und P24 (etwa 0,1 mg/ml)) und rekombinantem HIV-2-Glycoproteinantigen (GP36 (etwa 0,5 mg/ml) in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 1,0 mg/ml, hergestellt in PBS, umfassend 5% Trehalose. Eine Gesamtmenge von etwa 0,1 bis etwa 0,5 μg Antigen wurde auf die Testfläche in einer vertikalen Linie aufgebracht.
Andere Teststreifen wurden hergestellt, umfassend ein einzelnes HIV-1- oder HIV-2-Antigen auf der Testlinie.
Für alle Teststreifen umfasste die Kontrollfläche eine vertikale Linie von Kontrollantikörper. Der Kontrollantikörper war Kaninchen-IgG, verdünnt auf 1 mg/ml in PBS, umfassend 5% Trehalose. Eine Gesamtmenge von Kontrollantigen, die ausreichend war, um eine sichtbare Kontrolllinie bei Konjugatbindung zu produzieren, wurde auf die Kontrollfläche aufgebracht.
Für jeden Teststreifen wurde die geeignete Nitrocellulosemembran auf eine Größe von etwa 2,5 cm × 5 mm geschnitten und an der Plastikunterlage angebracht.
An kolloidales Gold gebundenes Protein A, kommerziell erhältlich von Sigma, wurde als das Konjugat für den Test verwendet. Das Konjugat wurde in Konjugatpuffer auf eine Konzentration von ungefähr 3 OD/ml verdünnt. Der Konjugatpuffer umfasste 0,25% HEPES, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% Natriumazid, 0,1% EDTA, 0,1% Casein, 1% Rinderserumalbumin, 1% Mannit, 5% Saccharose und 0,1% Triton X100. Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.
Konjugat wurde auf ein Glasfaser-Konjugatpad (Millipore GFCP203000) aufgebracht, das getrocknet und in 5 mm × 5 mm-Streifen geschnitten wurde. Ein Streifen wurde an das Ende der Nitrocellulosemembran am nächsten zu der Testfläche von jedem Teststreifen angebracht.
Ein Whatman GF/DVA-Glaspapier-Pufferpad (2 cm × 5 mm) wurde dann an das getrocknete Konjugatpad von jedem Teststreifen angebracht, um als das Pufferpad zu dienen.
Ein Absorberpad (2 cm × 5 mm), hergestellt aus S&S 900-Papier, wurde an das Ende der Nitrocellulosemembran am nächsten zu der Kontrollfläche angebracht, und ein weiteres Absorberpapier (2,5 cm × 5 mm; S&S 470) wurde an das Absorberpad angebracht. Das Absorberpapier war im Gegenzug in Kontakt mit einer 0,395 g Trockenmitteltablette (Tri-Sorb, Sud-Chemie).
Der Teststreifen wurde in ein Plastikgehäuse platziert, um eine Testkarte ähnlich zu jenen, die in 1–6 illustriert sind, zu produzieren. Das Plastikgehäuse (10) umfasste ein Testfenster (20), das die Testfläche (140) und Kontrollfläche (150) offenlegte, sowie ein Pufferfenster (30) direkt über einem Pufferpad. Das Plastikgehäuse wurde auch markiert, um die Lokalisierung der Testlinie und der Kontrolllinie anzuzeigen.
Die Testkarten wurden individuell in Folie verpackt.
Beispiel 2 Test auf HIV
Serum oder Plasma wurde von einer Vollblutprobe hergestellt, die von einem Patienten erhalten wurde, der unter Verwendung von geeigneten Venenpunktionsverfahren auf HIV getestet werden soll. Proben wurden bei 2°C bis 8°C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verwendet oder bei –20°C zur Verwendung innerhalb von 2 Wochen gefroren. Gefrorene Proben wurden vor der Verwendung aufgetaut.
Eine wie in Beispiel 1 beschriebene HIV-Testkarte, umfassend ein Gemisch von HIV-1- und HIV-2-Antigenen auf der Kontrollfläche, wurde aus der Folienverpackung entfernt.
Ungefähr 5 μl Probenpuffer, umfassend 0,025% HEPES und 0,2% Natriumazid wurde auf die Membran durch das Zentrum des Testkartenfensters aufgebracht.
Eine Probenpipette, enthaltend das zu testende Serum oder Plasma, wurde in einer vertikalen Position über dem Testfenster auf der Testkarte gehalten, und 5 μl Probe wurde auf die Membran im Zentrum des Fensters platziert.
Vier Tropfen Waschpuffer-Lösung (0,025% HEPES, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% EDTA, 1% Mannit, 0,1% Casein, 1% Triton X100, pH 7,2) wurden zum Pufferpad zugefügt. Wenn die Reaktion nicht geklärt war, wurde nach 3 Minuten ein weiterer Tropfen Puffer zum Pufferpad hinzugefügt.
Die Ergebnisse des Tests wurden 1 bis 5 Minuten nach Zugabe des ersten Puffers abgelesen.
Wie in 5 gezeigt, umfasst ein positives Ergebnis zwei sichtbare Linien quer über das Probenfenster: eine Testlinie (140) und eine Kontrolllinie (150). Ein positives Ergebnis wird erhalten, wenn zwei Linien sichtbar sind, sogar wenn eine der Linien dunkler ist als die andere. Ein negatives Ergebnis wird durch eine einzige Kontrolllinie, die quer über das Probenfenster sichtbar ist, angezeigt, wie in 6 illustriert.
Beispiel 3 HCV-Testkarte
Ein Teststreifen für die Diagnose von Hepatitis-C-Virus wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Ein Hepatitis-C-Antigen-Gemisch, umfassend Kern (0,3 mg/ml), NS3 (0,4 mg/ml) und NS4 (0,1 mg/ml), wurde jedoch statt dem HIV-Antigen in einer Testlinie auf die Membran aufgesprüht, um die Testfläche zu produzieren. Insgesamt wurde etwa 0,4 μg HCV-Antigen-Gemisch auf die Testlinie aufgebracht. Kaninchen-IgG, verdünnt auf 1 mg/ml wurde auf eine Kontrolllinie gesprüht.
Beispiel 4 Test auf HCV
Eine HCV-Testkarte wie in Beispiel 3 beschrieben, umfassend ein HCV-Antigen auf der Testfläche, wurde aus der Folienverpackung entfernt.
Ungefähr 5 μl Probenpuffer, umfassend Phosphatpuffer und 0,2% Natriumazid, wurde auf die Membran durch das Zentrum des Testkartenfensters aufgebracht.
Serum oder Plasma wurde von einer Vollblutprobe hergestellt. Eine Probenpipette, enthaltend das zu testende Serum oder Plasma, wird in einer vertikalen Position über das Testfenster auf der Testkarte gehalten, und 5 μl Probe wird auf die Membran im Zentrum des Fensters platziert.
Vier Tropfen Waschpuffer-Lösung (0,025% Phosphat, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% EDTA, 1% Mannit, 0,1% Casein, 1% Triton X100, pH 7,2) wurden zu dem Pufferpad zugefügt. Wenn die Reaktion nicht geklärt war, wurden nach 3 Minuten 2 weitere Tropfen Puffer zum Pufferpad zugefügt.
Die Ergebnisse des Tests wurden von 1 bis 5 Minuten nach Zugabe des ersten Puffers abgelesen.
Wie in 5 gezeigt, umfasst ein positives Ergebnis zwei sichtbare Linien quer über das Probenfenster: eine Testlinie (140) und eine Kontrolllinie (150). Ein positives Ergebnis wird erhalten, wenn zwei Linien sichtbar sind, auch wenn eine der Linien dunkler ist als die andere. Ein negatives Ergebnis wird durch eine einzelne Kontrolllinie, die quer über das Probenfenster sichtbar ist, angezeigt, wie in 6 illustriert.
Beispiel 5 Schwangerschaftstest
Schnelle, visuelle Lateral-Flow-Schwangerschaftstests wurden hergestellt. Die Anordnung der Teststreifen ist im Wesentlichen wie in 7 illustriert.
Jeder Teststreifen umfasst eine Plastikunterlage (6 cm × 5 mm) mit Klebemittel auf beiden Seiten. Die Plastikunterlage ist zwischen etwa 2 mil und etwa 20 mil dick.
Eine Testlinie und eine Kontrolllinie werden auf einer Nitrocellulosemembran (Millipore HF09004) durch Sprayen mit einem Pumpendispensier-System (Kinematic Automation) hergestellt. Die Testlinie umfasst eine vertikale Linie eines Antikörpers gegen menschliches Choriongonadotropin (hCG), vorzugsweise einen monoclonalen Antikörper. Antikörper gegen hCG sind verbreitet kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Research Diagnostics Inc. (RDI-CBL74; New Jersey, USA), Charles River Labs und anderen Quellen, oder können unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Eine Gesamtmenge von etwa 0,2 bis etwa 1 μg Antikörper wird auf die Testfläche in einer vertikalen Linie aufgebracht.
Die Kontrolllinie umfasst eine vertikale Linie von Protein A. Eine Gesamtmenge an Protein A, die ausreichend ist, um bei Konjugatbindung ein sichtbares Signal zu produzieren, wird auf die Kontrolllinie aufgebracht, typischerweise etwa 0,25 μg.
Für jeden Teststreifen wird die geeignete Nitrocellulosemembran auf eine Größe von etwa 2,5 cm × 5 mm geschnitten und an die Plastikunterlage angebracht.
Ein zweiter Antikörper gegen hCG wird für das Konjugat für den Test an kolloidales Gold angebunden. Kolloidale Gold-hCG-Antikörperkonjugate sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Research Diagnostics Inc. Alternativ können hCG-Antikörperkonjugate unter Verwendung von wohlbekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. U.S. Patent No. 6,485,982, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Das Konjugat wird in Konjugatpuffer auf eine Konzentration von ungefähr 3 OD/ml verdünnt. Der Konjugatpuffer umfasst vorzugsweise 0,25% HEPES, 0,85% Natriumchlorid, 0,1% Natriumazid, 0,1% EDTA, 0,1% Casein, 1% Rinderserumalbumin, 1% Mannit, 5% Saccharose und 0,1% Triton X100. Der Puffer wird auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.
Konjugat wird auf ein Glasfaser-Konjugatpad (Millipore GFCP203000) aufgebracht, das getrocknet und in 5 mm × 5 mm-Streifen geschnitten wird.
Ein Whatman GF/DVA-Glaspapier-Pufferpad (2 cm × 5 mm) wird an das getrocknete Konjugatpad von jedem Teststreifen angebracht, um als das Pufferpad zu dienen.
Ein Absorberpad (2 cm × 5 mm), hergestellt aus S&S 900-Papier, wird an das Ende der Nitrocellulosemembran am nächsten zu der Kontrollfläche angebracht, und ein weiteres Absorberpapier (2,5 cm × 5 mm; S&S 470) wird an das Absorberpad angebracht. Das Absorberpapier ist wiederum in Kontakt mit einer Trockenmitteltablette (z.B. Tri-Sorb, Sud-Chemie), die einen signifikanten Teil des Probenvolumens absorbieren und so Probe und Analyt über die Testfläche ziehen kann.
Methylenblau oder eine anderer Indikator wird entweder auf das Absorberpad oder Absorberpapier stromabwärts der Testfläche aufgebracht. Die Bewegung dieses Volumenindikators ist ein Signal, dass ausreichend Probe die Testfläche kontaktiert hat, um einen exakten Test zu ermöglichen.
Der Teststreifen wird in einem Plastikgehäuse platziert, um eine Testkarte zu produzieren. Das Plastikgehäuse umfasst ein Testfenster über der Testfläche und Kontrollfläche, um das Betrachten der Testergebnisse zu ermöglichen. Das Gehäuse umfasst auch ein Volumenindikatorfenster, durch das die Bewegung des Volumenindikators beobachtet werden kann.
In manchen Testkarten ist ein Probenbecher über dem Testfenster angebracht. Der Testbecher umfasst einen Behälter zum Halten der Probe mit einem Auslass, um die Probe zur Probenaufbringfläche der Testmembran durch das Probenfenster fließen zu lassen. Der Probenbecher kann auch einen Filter im Auslass umfassen. Nach Zugabe der Probe auf die Membran wird der Becher entfernt, so dass die Ergebnisse des Tests gesehen werden können.
In anderen Testkarten ist ein Docht vorhanden, der aus dem Ende oder der Seite des Gehäuses herausragt. Der Docht liefert einen Pfad, entlang dem Probe zur Probenaufbringfläche und zur Testfläche fließen kann.
Das Gehäuse hat auch einen Mechanismus, der ermöglicht, das Konjugatpad zu bewegen, um es durch Flüssigkeit mit der Membran zu verbinden.
In manchen Testkarten ist auch eine Ampulle, die Waschpuffer enthält, im Gehäuse stromaufwärts des Konjugatpads lokalisiert. In anderen Testkarten wird Puffer zum Pufferpad durch ein Pufferfenster zugefügt.
Die Aktivierung des Mechanismus, der das Konjugatpad bewegt, um es mit der Testmembran in Kontakt zu bringen, bricht die Ampulle auf, was den Puffer zum Konjugatpad fließen lässt. Vorzugsweise kontaktieren etwa 5 Tropfen Waschpuffer das Konjugatpad. Die Aktivierung des Mechanismus entfernt auch den Probenbecher oder Docht vom Gehäuse.
Das Plastikgehäuse ist markiert, um die Lokalisierung der Testlinie und der Kontrolllinie im Probenfenster anzuzeigen.
Beispiel 6 Verwendung des Schwangerschaftstests mit Probenbecher
Schnelle, visuelle Lateral-Flow-Schwangerschaftstests mit einem Probenbecher werden wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt.
Urin der Testperson wird gesammelt, und ungefähr 500 μl werden in den Probenbecher zugefügt, der an die Testkarte über dem Probenfenster angebracht ist. Wenn eine blaue Farbe im Volumenindikatorfenster beobachtet wird, wird der Mechanismus aktiviert, der das Konjugatpad mit der Membran durch Flüssigkeit in Verbindung bringt. Dies bricht die Ampulle auf, die den Puffer enthält, und startet den Test. Der Probenbecher wird entfernt, und die Ergebnisse des Tests werden im Probenfenster 1 bis 5 Minuten später betrachtet.
Wie in 5 gezeigt, umfasst ein positives Ergebnis zwei sichtbare Linien quer über das Probenfenster: eine Testlinie 140 und eine Kontrolllinie 150. Ein positives Ergebnis wird angezeigt, wenn zwei Linien sichtbar sind, auch wenn eine der Linien dunkler ist als die andere. Ein negatives Ergebnis wird durch eine einzige Kontrollline 150 angezeigt, die quer über das Probenfenster sichtbar ist, wie in 6 illustriert.
Beispiel 6 Verwendung des Schwangerschaftstests mit Docht
Schnelle, visuelle Lateral-Flow-Schwangerschaftstests mit einem Docht werden wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt.
Die Testperson platziert den Docht in ihren Urinstrahl. Eine blaue Farbe, die im Volumenindikatorfenster beobachtet wird, zeigt an, dass ein ausreichendes Probenvolumen die Testfläche kontaktiert hat.
Ein Mechanismus am Gehäuse wird aktiviert, was das Konjugatpad durch Flüssigkeit mit der Membran in Verbindung bringt. Dies bricht auch die Ampulle auf, die Puffer innerhalb des Gehäuses enthält, und startet den Test dadurch, dass es den Puffer zum Fließen zum Konjugatpad bringt. Der Docht wird entfernt, und die Ergebnisse des Tests werden im Probenfenster 1 bis 5 Minuten später betrachtet.
Wie in 5 gezeigt, umfasst ein positives Ergebnis zwei sichtbare Linien quer über das Probenfenster: eine Testlinie 140 und eine Kontrolllinie 150. Ein positives Ergebnis wird angezeigt, wenn zwei Linien sichtbar sind, auch wenn eine der Linien dunkler ist als die andere. Ein negatives Ergebnis wird durch eine einzige Kontrollline angezeigt, die quer über das Probenfenster sichtbar ist, wie in 6 illustriert.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird von Fachleuten verstanden werden, dass verschiedene Änderungen gemacht werden können, und Äquivalente für Elemente davon ersetzt werden können, ohne vom Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Zusätzlich können viele Modifikationen gemacht werden, um die Lehren hierin auf eine bestimmte Situation anzupassen, ohne vom wesentlichen Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Daher soll die Erfindung nicht auf irgendeine bestimmte offenbarte Ausführungsform limitiert sein, sondern die Erfindung wird alle Ausführungsformen einschließen, die in den Schutzbereich der angefügten Ansprüche fallen.

Claims

Diagnostischer Teststreifen zum Nachweis eines Analyts von Interesse in einer flüssigen Probe, wobei der Teststreifen umfasst: eine Konjugatausgangsfläche, umfassend ein Konjugat, das so konfiguriert ist, dass es den Analyt von Interesse bindet; eine Probenaufbringfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche liegt und so konfiguriert ist, dass sie die flüssige Probe aufnimmt; und eine Testfläche, die stromabwärts der Konjugatausgangsfläche liegt und ein immobilisiertes Bindemittel umfasst, das für den Analyt von Interesse spezifisch ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei die Probenaufbringfläche die Testfläche umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt von Interesse ein Antikörper ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 3, wobei der Analyt von Interesse ein Antikörper des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 3, wobei das Analyt von Interesse ein Antikörper des Hepatitis-C-Virus (HCV) ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt von Interesse ein Antigen ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 6, wobei der Analyt von Interesse ein menschliches Choriongonadotropin (hCG) ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei die Konjugatausgangsfläche getrocknetes Konjugat umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 8, wobei die Konjugatausgangsfläche ein Konjugatpad umfasst, das getrocknetes Konjugat umfasst und durch eine Flüssigkeit mit dem Teststreifen verbunden ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 8, wobei die Konjugatausgangsfläche einen Teil des Teststreifens darstellt.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei das Konjugat durch Inkontaktbringen der Konjugatausgangsfläche mit Waschpuffer zum Fließen zur Testfläche gebracht wird.
Teststreifen gemäß Anspruch 11, wobei der Waschpuffer ein Blockerprotein und ein nicht-ionisches Detergens umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 12, wobei der Waschpuffer 0,1% Casein und 1% Triton X100 umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei das Konjugat eine Bindekomponente und einen Marker umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 14, wobei die Bindekomponente Protein A ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 14, wobei der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kolloidalem Gold, kolloidalem Silber, kolloidalem Schwarz und gefärbten Latexpartikeln.
Teststreifen gemäß Anspruch 16, wobei der Marker kolloidales Gold ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 17, wobei das kolloidale Gold eine Partikelgröße von etwa 20 bis etwa 80 nm hat.
Teststreifen gemäß Anspruch 3, wobei das Konjugat an kolloidales Gold konjugiertes Protein A umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 6, wobei das Konjugat einen an kolloidales Gold konjugierten Antikörper umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei der Teststreifen eine Nitrocellulosemembran umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, wobei der Teststreifen zusätzlich eine Kontrollfläche besitzt, die stromabwärts der Testfläche angeordnet ist, wobei die Kontrollfläche ein immobilisiertes Kontrollbindemittel umfasst, das in der Lage ist, das Konjugat zu binden.
Teststreifen gemäß Anspruch 22, wobei die Kontrollfläche immobilisiertes Kaninchen-IgG umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 22, wobei die Kontrollfläche immobilisiertes Protein A umfasst.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, zusätzlich umfassend ein Pufferpad, das durch eine Flüssigkeit mit der Konjugatausgangsfläche verbunden ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, zusätzlich umfassend ein Absorberpad, das durch eine Flüssigkeit mit der Membran verbunden ist, in einer Position stromabwärts der Testfläche.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, zusätzlich umfassend einen Probenfilter, der sich direkt über der Probenaufbringfläche befindet.
Teststreifen zum Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern in einer Probe, umfassend: eine Testfläche und eine stromaufwärts der Testfläche gelegene Konjugatausgangsfläche; immobilisiertes Antigen, das an die Testfläche gebunden ist, wobei das immobilisierte Antigen etwa 0,1 bis etwa 0,5 mg HIV-Antigen umfasst; und ein diffundierbar an die Konjugatausgangsfläche gebundenes Konjugat, wobei das Konjugat so konfiguriert ist, dass es an einen Antikörper bindet.
Teststreifen gemäß Anspruch 28, wobei das HIV-Antigen ein oder mehrere Antigene umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GP120, P24 und GP36.
Teststreifen gemäß Anspruch 28, wobei das Konjugat Protein A umfasst.
Immunodiagnostischer Schwangerschaftsteststreifen umfassend: eine Probenaufbringfläche zur Aufnahme einer flüssigen Probe; eine Testfläche umfassend einen immobilisierten ersten Anti-hCG-Antikörper; und eine Konjugatausgangsfläche umfassend ein Konjugat, das so konfiguriert ist, dass es an hCG bindet, wobei die Konjugatausgangsfläche stromaufwärts der Probenaufbringfläche und der Testfläche angeordnet ist.
Schwangerschaftsteststreifen gemäß Anspruch 31, zusätzlich umfassend ein Gazetampon, der durch eine Flüssigkeit mit der Probenauftragsfläche in Verbindung steht.
Schwangerschaftstest gemäß Anspruch 31, zusätzlich umfassend einen Becher zum Sammeln der Urinprobe.
Schwangerschaftstest gemäß Anspruch 31, wobei das Konjugat einen zweiten hCG-Antikörper umfasst.
Schwangerschaftstest gemäß Anspruch 34, wobei der zweiter hCG-Antikörper mit kolloidalem Gold konjugiert ist.