CN108226492A - A群猪轮状病毒快速elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，属于动物疫病血清学诊断技术领域，本发明试剂盒包括反应装置和样品处理液两部分，反应装置包括加样孔、按压键、观察窗、试纸板、试剂槽和钩刺；所述试剂槽内设有洗涤液和酶底物液。经样品处理液处理后的待测样品滴加于加样孔，待反应指示线出现后按下按压键，试剂池内的试剂将参与反应，若样品中含有目的抗原则在反应窗处将出现两个蓝色点，反之，只出现一个蓝色点。本发明可快速、准确的鉴别诊断A群猪轮状病毒感染，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简便等特点，具有良好的应用前景。

Description

A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒。

背景技术

猪轮状病毒（Porcine rotavirus, PoRV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）的双链RNA病毒。PORV感染时引起仔猪爆发肠道机能紊乱的一种急性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为主要特征，给养猪业带来严重的危害。据报道，美国断奶仔猪感染阳性率为80 %，病死率为15 %；在英国，猪场中1周龄～4周龄仔猪的轮状病毒性腹泻发病率超过80 %，死亡率为7 %～20 %；Barman N N 等对位于印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV的阳性率最高（51.1 %）。该病毒常与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、大肠杆菌（E.coli）等混合感染而加重病情。因此，轮状病毒对全世界人类健康和畜牧业生产造成巨大危害。

PoRV病毒粒子略呈圆形，具有双层衣壳，直径65 nm~75 nm。中央是一个电子致密六角形核心，为RV的芯髓，直径37 nm～40 nm；芯髓周围绕有一个电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳；外周是一层由光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20 nm，可能是在内质网膜上芽生时获得的。以核心为毂，以呈辐射状排列的内衣壳为轮辐，以外衣壳为辋，构成特征性的轮状结构。电子显微镜水平下可以对轮状病毒与呼肠孤病毒加以区分。电子显微镜观察发现，轮状病毒的内衣壳壳粒为棍棒状，向外呈辐射状排列，外周为一层由光滑薄膜构成的外衣壳，故而病毒粒子表面光滑；相反，呼肠孤病毒内衣壳的壳粒接近球形或呈短棱柱状，外衣壳的壳粒清楚可见，故整个病毒的表面呈粗糙颗粒状。PoRV存在多种血清型，我国猪群中轮状病毒感染以A群为主，在A群PoRV中VP6蛋白是群抗原，在各毒株中高度保守。我国PoRV的诊断主要依赖于实验室的常规诊断，这些常规的诊断技术有其优点，但也有其固有的缺点。成本高、需要特殊的昂贵的仪器、需要特殊技术人员、存在有害物质等因素影响了对PoRV的及时诊断，尤其是对PoRV的现地诊断，从而也影响了对PoRV的及时预防和治疗。目前，单克隆抗体已成为研究各种疾病的良好工具。单克隆抗体由于具有特异性强、均质性高、易于标准化以及可批量生产等优点，已被广泛应用于免疫学、肿瘤学、遗传学和其他学科中各种复杂现象的研究中，也广泛应用于诊断、治疗、生物材料的纯化等技术实践中，并以诊断应用居多。胶体金免疫层析技术具有快速简便优点，但也存在灵敏度低、准确性重复性较差、难以进行定量等缺点。本发明克服了胶体金和ELISA技术的不足，保留了胶体金的快速简便优势和ELISA高灵敏高特异优点，使其在现地有了很好的应用。

发明内容

本发明提供一种A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，该检测试剂盒可快速、准确的鉴别诊断A群猪轮状病毒感染，检测灵敏度高、特异性强，重复性和稳定性佳，使用快捷方便，具有良好的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其结构特点是包括样品处理液和反应装置两部分；反应装置包括顶部敞口的盒体，盒体的敞口上扣装有扣罩，扣罩内安装反应条且扣罩倾斜设置，扣罩的低端通过弹片连接在盒体上、扣罩的高端设置按压键，扣罩上在靠近按压键的位置上开设加样孔；所述反应条包括PVC底衬板、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和样品处理垫，硝酸纤维素膜、吸水滤纸和样品处理垫均粘贴在PVC底衬板上且硝酸纤维素膜位于中部、样品处理垫和吸水滤纸分别搭接在硝酸纤维素膜的高端和低端；硝酸纤维素膜的中部间隔设置一个包被有抗A群猪轮状病毒多抗的检测点和一个包被有羊抗鼠IgG二抗的质控点，并在靠近吸水滤纸的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线，扣罩上开设有正对硝酸纤维素膜的观察窗；盒体的内部设置有试剂槽，试剂槽位于PVC底衬板贴有样品处理垫一端的正下方，试剂槽的开口上封装有密封薄膜，PVC底衬板的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜刺破的钩刺。

所述样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30%的条件下密封干燥处理。其中，所述处理液为含有0.2%Tween-20、0.1%BSA和0.5%阻断剂的0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液。

所述检测点和质控点以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的两种抗体溶液分别为将抗A群猪轮状病毒多抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液和将羊抗鼠IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液，两种抗体溶液于室温相对湿度不高于30%的条件下干燥、密封保存。

所述试剂池内设有试剂，试剂包括洗涤液和酶底物液。

所述洗涤液包括0.5-1% Tween-20、0.05-0.1%Proclin300、pH7.0-7.4的0.02MPBS溶液100uL。

所述酶底物液包括0.3mg/mLN，N-二甲基甲酰胺、0.1-0.5%过氧化物、0.05-0.1%Proclin300、的5mM、pH4.0-5.0的柠檬酸钠溶液100uL。

所述样品处理液包括0.5-1%的Triton100、0.2-0.5%的BSA、0.1-0.2%的Casein、0.05-0.1%的Proclin300、0.1-0.5%的酶稳定剂及1:5000-1:20000稀释浓度的HRP标记抗A群猪轮状病毒单抗的0.02M PBS缓冲液1mL。

本发明试剂盒的使用过程为：首先，将待检测样品（如粪便等）经样品处理液37℃预处理10min后吸取150uL样品液从加样孔中逐滴加入，样品液被试纸板的样品垫吸收并在毛细作用下沿硝酸纤维素膜向前层析，待反应指示线出现后按下反应键，钩刺刺穿试剂槽的密封薄膜，样品垫浸入试剂槽内，洗涤液和酶底物液试剂依次沿试纸板向前层析并参与反应，若样品中含有PoRV目的抗原则在反应窗处将出现两个蓝色点，反之，只出现一个蓝色点。

本发明的有益效果是：将待检样本于反应前经样品处理液特殊预处理，降低了特殊样本对检测结果的干扰，提高了检测结果的准确性。同时样品处理液的独特设计极大增强了试剂盒整体性能的稳定。本发明的检测试剂盒可快速、准确的鉴别诊断A群猪轮状病毒感染，检测灵敏度高、特异性强，重复性和稳定性佳，使用快捷方便，具有良好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

图1为本发明试剂盒的结构示意图；

图2为本发明中试纸板的结构示意图。

具体实施方式

参照附图，本发明的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒包括样品处理液和反应装置两部分。样品处理液用于对样品进行预处理。反应装置为包括顶部敞口的盒体1，盒体的敞口上扣装有扣罩2，扣罩2内安装反应条3且扣罩2倾斜设置，扣罩2的低端通过弹片4连接在盒体1上、扣罩2的高端设置按压键5，扣罩2上在靠近按压键5的位置上开设加样孔6；所述反应条3包括PVC底衬板7、硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9和样品处理垫14，硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9和样品处理垫14均粘贴在PVC底衬板7上且硝酸纤维素膜8位于中部、样品处理垫14和吸水滤纸9分别搭接在硝酸纤维素膜8的高端和低端；硝酸纤维素膜8的中部间隔设置一个包被有抗A群猪轮状病毒多抗的检测点D-T和一个包被有羊抗鼠IgG二抗的质控点D-C，并在靠近吸水滤纸9的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线L-I，扣罩2上开设有正对硝酸纤维素膜8的观察窗13；盒体1的内部设置有试剂槽10，试剂槽10位于PVC底衬板7贴有样品处理垫14一端的正下方，试剂槽10的开口上封装有密封薄膜11，PVC底衬板7的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜11刺破的钩刺12。

其中，样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30%的条件下密封干燥处理。处理液为含有0.2%Tween-20、0.1%BSA和0.5%阻断剂的0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液。

检测点D-T和质控点D-C以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的两种抗体溶液分别为将抗A群猪轮状病毒多抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液和将羊抗鼠IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液，两种抗体溶液于室温相对湿度不高于30%的条件下干燥、密封保存。

试剂池内设有试剂，试剂包括洗涤液和酶底物液。其中，洗涤液包括0.5-1%Tween-20、0.05-0.1%Proclin300、pH7.0-7.4的0.02M PBS溶液100uL。酶底物液包括0.3mg/mLN，N-二甲基甲酰胺、0.1-0.5%过氧化物、0.05-0.1%Proclin300的5mM、pH4.0-5.0的柠檬酸钠溶液100uL。

待检测样品在滴入加样孔前要经样品处理液处理，样品处理液包括0.5-1%的Triton100、0.2-0.5%的BSA、0.1-0.2%的Casein、0.05-0.1%的Proclin300、0.1-0.5%的酶稳定剂及1:5000-1:20000稀释浓度的HRP标记抗A群猪轮状病毒单抗的0.02M PBS缓冲液1mL。

本发明试剂盒的使用过程为：首先，将待检测样品（如粪便等）经样品处理液37℃处理10min后吸取150uL样品液从加样孔中逐滴加入，样品液被试纸板的样品垫吸收并在毛细作用下沿硝酸纤维素膜向前层析，待反应指示线出现后按下按压键，钩刺刺穿试剂槽的密封薄膜，样品垫浸入试剂槽内，洗涤液和酶底物液试剂依次沿试纸板向前层析并参与反应，若样品中含有PoRV目的抗原则在反应窗处将出现两个蓝色点，反之，只出现一个蓝色点。

综上所述，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可做若干的更改或修饰。上述更改或修饰均落入本本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是包括样品处理液和反应装置两部分；反应装置包括顶部敞口的盒体（1），盒体的敞口上扣装有扣罩（2），扣罩（2）内安装反应条（3）且扣罩（2）倾斜设置，扣罩（2）的低端通过弹片（4）连接在盒体（1）上、扣罩（2）的高端设置按压键（5），扣罩（2）上在靠近按压键（5）的位置上开设加样孔（6）；所述反应条（3）包括PVC底衬板（7）、硝酸纤维素膜（8）、吸水滤纸（9）和样品处理垫（14），硝酸纤维素膜（8）、吸水滤纸（9）和样品处理垫（14）均粘贴在PVC底衬板（7）上且硝酸纤维素膜（8）位于中部、样品处理垫（14）和吸水滤纸（9）分别搭接在硝酸纤维素膜（8）的高端和低端；硝酸纤维素膜（8）的中部间隔设置一个包被有抗A群猪轮状病毒多抗的检测点（D-T）和一个包被有羊抗鼠IgG二抗的质控点（D-C），并在靠近吸水滤纸（9）的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线（L-I），扣罩（2）上开设有正对硝酸纤维素膜（8）的观察窗（13）；盒体（1）的内部设置有试剂槽（10），试剂槽（10）位于PVC底衬板（7）贴有样品处理垫（14）一端的正下方，试剂槽（10）的开口上封装有密封薄膜（11），PVC底衬板（7）的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜（11）刺破的钩刺（12）。

2.根据权利要求1所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30%的条件下密封干燥处理。

3.根据权利要求2所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述处理液为含有0.2-1%%Tween-20、0.1-2%BSA和0.5-1%阻断剂的0.02M、pH7.0-8.0的Tri-Cl缓冲液。

4.根据权利要求2所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述检测点（D-T）和质控点（D-C）以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的两种抗体溶液分别为将抗A群猪轮状病毒多抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液和将羊抗鼠IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的抗体溶液，两种抗体溶液于室温相对湿度不高于30%的条件下干燥、密封保存。

5.根据权利要求1所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述试剂池内设有试剂，试剂包括洗涤液和酶底物液。

6. 根据权利要求5所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述洗涤液包括0.5-1% Tween-20、0.05-0.1%Proclin300、pH7.0-7.4的0.02M PBS溶液100uL。

7.根据权利要求6所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述酶底物液包括0.3mg/mLN，N-二甲基甲酰胺、0.1-0.5%过氧化物、0.05-0.1%Proclin300、的5mM、pH4.0-5.0的柠檬酸钠溶液100uL。

8. 根据权利要求1所述的A群猪轮状病毒快速ELISA检测试剂盒，其特征是所述样品处理液包括0.5-1%的Triton100、0.2-0.5的BSA、0.1-0.2%的Casein、0.05-0.1%的Proclin300、0.1-0.5%的酶稳定剂及一定浓度HRP标记抗A群猪轮状病毒单抗的0.02M PBS缓冲液1mL。