CN111505313A - 一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诊断试剂盒，具体涉及一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒。其包括单侧检测试纸条和双测检测试纸条，单测检测试纸条的结合垫上固定有时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体，第一检测线包被有肺炎支原体抗体，第一质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；双测检测试纸条的结合垫上固定有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，第二检测线和第三检测线均包被有天然MP‑Ag；第二质控线包被羊抗鼠IgG抗体。本发明通过时间分辨荧光微球作为显色标记，三测肺炎支原体IgM和IgG的检测试纸条，联合成整体，同时检测人肺炎支原体抗原以及肺炎支原体IgM和IgG，相对于胶体金法具有更高的灵敏度，较强的特异性。

Description

一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种诊断试剂盒，具体涉及一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒及其应用。
背景技术
肺炎支原体是一种介于病毒和细菌之间的病原微生物，能在无生命培养基上生长繁殖的最小原核细胞型微生物，可在任何年龄发生，其感染方式可通过气溶胶微粒的形式传播。在人群密集中易流行，在成人和儿童中产生呼吸道感染，引起肺炎和支气管炎等疾病。支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现胸部X线无法做出诊断，要明确诊断主要是精选病原体的检测，目前国内支原体肺炎的诊断主要是依靠血清学检测。
鉴于目前血清学检测的窗口期和机体免疫条件影响以及不同检测方法的敏感性特异性不同，采用一种检测方法无法达到最终确诊，因此病原学与血清学联合诊断仍然是目前提倡的MP感染诊断策略。
目前市面上主要是胶体金法测肺炎支原体IgM或肺炎支原体IgG的方法，而胶体金法灵敏度低，特异性差。核酸PCR法对检测人员要求高，而检测费用高。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种通过时间分辨荧光微球作为显色标记的、单卡三测的方式，可以实现快速高灵敏的同时检测人肺炎支原体抗原以及肺炎支原体IgM和IgG的诊断试剂盒；
相应的，本发明还提供上述肺炎支原体IgM和IgG的诊断试剂盒在联合检测支原体肺炎支原体及其IgM/IgG检测中的应用。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
本发明提供一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其包括均设有底板和设置在底板上的依次连接的样本垫、结合垫、反应膜和吸水垫的单侧检测试纸条和双测检测试纸条；
单测检测试纸条的结合垫上固定有时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体，
单测检测试纸条的反应膜上设有第一检测线和第一质控线，第一检测线包被有肺炎支原体抗体，第一质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
双测检测试纸条的结合垫上固定有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，
双测检测试纸条的反应膜上包括有第二检测线、第三检测线和第二质控线，第二检测线和第三检测线均包被有天然MP-Ag；第二质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，其还包括塑料卡壳，单侧检测试纸条和双测检测试纸条设置于塑料卡壳内，并塑料卡壳在两条检测试纸条的样本垫处均设有加样孔，塑料卡壳在第一检测线、第一质控线、第二检测线、第三检测线和第二质控线处均设有透明或设置有开口。
进一步的，其还包括加样装置，加样装置包括转动连接在塑料壳上的支撑杆，支撑杆上还转动连接有加样管，加样管管口设有可开合的管盖。
进一步的，加样管设有容置稀释液的容腔，加样管上沿其纵向平行设有一根以上的推杆，推杆从加样管的外侧延伸至容腔的壁面上，并推杆可向容腔内往返活动，推杆在其延伸端设有凸起，容腔的壁面上设有与凸起相配合卡扣的凹槽。
进一步的，推杆的外侧设有标志加样管管腔内容积的刻度。
进一步的，单侧检测试纸条和双测检测试纸条设置为相互独立不连接。
进一步的，其还包括连接于样本垫的加样板，加样板上设有加样凹槽和通道，加样凹槽上连通有两个通道，两个通道分部延伸至单侧检测试纸条和双测检测试纸条的样本垫上。
进一步的，时间分辨荧光微球用稀土元素铕包被的纳米微球。
本发明还提供上述联合检测支原体肺炎的检测试剂盒在联合检测支原体肺炎支原体及其IgM/IgG中的应用，将样品先加入到样本垫处，再加入稀释液后，静置观察反应膜上的显色反应。
进一步的，稀释液为磷酸盐、Tris、hepes、硼酸、表面活性剂吐温20、惰性蛋白和氯化钠中的一种或两种及其以上组合。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明通过时间分辨荧光微球作为显色标记，将单侧支原体肺炎抗原的检测试纸条、联合检测三测肺炎支原体IgM和IgG的检测试纸条，联合成整体，从而实现快速高灵敏的同时检测人肺炎支原体抗原以及肺炎支原体IgM和IgG，相对于胶体金法具有更高的灵敏度，较强的特异性，本发明的操作简单，检测窗口期短。
附图说明
图1为本发明检测试剂盒的结构示意图；
图2为本发明检测试剂盒带有塑料卡壳和加样板的结构示意图；
图3为本发明检测试剂盒中加样装置的结构示意图。
【附图标记说明】
1-单测检测试纸条；2-双测检测试纸条；3-吸水垫；4-结合垫；
5-反应膜；51-第一检测线；52-第一质控线；53-第二检测线；54-第三检测线；55-第二质控线；
6-样本垫；
7-塑料卡壳；71-加样孔；
8-加样装置；81-支撑杆；82-加样管；821推杆；822凸起；823凹槽；83管盖；
9-加样板；91-加样凹槽；92-通道。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
【实施方式一】
如图1所示，本实施方式提供一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其包括均设有底板和设置在底板上的依次连接的样本垫6、结合垫4、反应膜5和吸水垫3的单侧检测试纸条和双测检测试纸条2；
单测检测试纸条1的结合垫4上固定有时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体，
单测检测试纸条1的反应膜5上设有第一检测线51和第一质控线52，第一检测线51包被有肺炎支原体抗体，第一质控线52包被有羊抗鼠IgG抗体；
双测检测试纸条2的结合垫4上固定有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，
双测检测试纸条2的反应膜5上包括有第二检测线53、第三检测线54和第二质控线55，第二检测线53和第三检测线54均包被有天然MP-Ag；第二质控线55上包被有羊抗鼠IgG抗体。
其中，天然MP-Ag指的是人肺炎支原体抗原；
本实施方式通过时间分辨荧光微球作为显色标记，将单侧支原体肺炎抗原的检测试纸条、联合检测三测肺炎支原体IgM和IgG的检测试纸条，联合成整体，从而实现快速高灵敏的同时检测人肺炎支原体抗原以及肺炎支原体IgM和IgG，相对于胶体金法具有更高的灵敏度，较强的特异性，本发明的操作简单，检测窗口期短。本实施方式中的反应膜为硝酸纤维素膜。本实施方式中的单测检测试纸条1适用于检测咽拭子样本。双测检测试纸条2适用于检测血清、血浆或全血。
本实施方式的检测试剂盒，如图1和2所示，还包括塑料卡壳7，单侧检测试纸条和双测检测试纸条2设置于塑料卡壳7内，并塑料卡壳7在两条检测试纸条的样本垫6处均设有加样孔71，塑料卡壳7在第一检测线51、第一质控线52、第二检测线53、第三检测线54和第二质控线55处均设有透明或设置有开口。
进一步的，如图3所示，其还包括加样装置8，加样装置8包括转动连接在塑料壳上的支撑杆81，支撑杆81上还转动连接有加样管82，加样管82管口设有可开合的管盖83。使用时，打开管盖83，加样管82中的液体就会流出到样本垫6上参与反应，采用转动连接的目的是实现加样管82的灵活活动，便于加样。在未使用时，支撑杆81和加样管82可以折叠在塑料壳上。加样时，调整加样管82时管口对着加样孔71，就可以实现加样，加样管82上装有稀释液。加样管82可设置为可拆卸结构，血液、血清等样品可以通过加样管82向加样孔71先加样，再置换成新的加样管82加入稀释液。
本实施方式中，为了使加样管82根据不同的稀释程度精确的加样，加样管82设有容置稀释液的容腔，加样管82上沿其纵向平行设有一根以上的推杆821，推杆821从加样管82的外侧延伸至容腔的壁面上，并推杆821可向容腔内往返活动，推杆821在其延伸端设有凸起822，容腔的壁面上设有与凸起822相配合卡扣的凹槽823。当推动其中一根推杆821，使推杆821上的凸起822与其匹配的凹槽823卡扣后，推杆821将加样管82的上部分液体隔离在推杆821上方，打开管盖83后，推杆821以下的液体加入到目标样本垫6上，从而可以根据推杆821以下液体的体积实现精确定量加样。进一步的，推杆821的外侧设有标志加样管82管腔内容积的刻度。
加样管82可以与支撑杆81可拆卸连接。加样管82可以置换成新的加样管82，并且加样管82中可以装入血液样品，实现精确定量的加样，加样管82可以但不限于设置为透明。加样管82在未使用时，是可折叠起来的。
进一步的，推杆821的外侧设有标志加样管82管腔内容积的刻度。便于精确定量加样。
进一步的，单侧检测试纸条和双测检测试纸条2设置为相互独立不连接。
进一步的，其还包括连接于样本垫6的加样板9，加样板9上设有加样凹槽91和通道92，加样凹槽91上连通有两个通道92，两个通道92分部延伸至单侧检测试纸条和双测检测试纸条2的样本垫6上。加样凹槽91的高度高于样本垫6的高度。
这样可以实现加样板9中的样品可分别单向向两条检测试剂条的样本垫6加样，加样装置8的加样管82管口对着加样凹槽91血液等样品以及稀释液凹槽823加样即可。
进一步的，时间分辨荧光微球用稀土元素铕包被的纳米微球。相对于胶体金，与本发明检测的肺炎支原体及其IgM/IgG具有更强的显色反应，从而提高灵敏度。
【实施方式二】
本实施方式还提供上述联合检测支原体肺炎的检测试剂盒在联合检测支原体肺炎支原体及其IgM/IgG中的应用，将样品先加入到样本垫6处，再加入稀释液后，静置观察反应膜5上的显色反应。
进一步的，稀释液为磷酸盐、Tris、hepes、硼酸、表面活性剂吐温20、惰性蛋白和氯化钠中的一种或两种及其以上组合。
样本稀释液含有质量浓度分别为以下的组分：0.02M的磷酸盐缓冲液、0.02-0.05％表面活性剂吐温20、0.2-0.5％惰性蛋白BSA和0.85％氯化钠。
具体实施例：
实施例1
制备得到以下的试剂盒：
得到均设有底板和设置在底板上的依次连接的样本垫6、结合垫4、反应膜5和吸水垫3的单侧检测试纸条和双测检测试纸条2；单测检测试纸条1的结合垫4上固定有时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体，
单测检测试纸条1的反应膜5上设有第一检测线51和第一质控线52，第一检测线51包被有肺炎支原体抗体，第一质控线52包被有羊抗鼠IgG抗体；
双测检测试纸条2的结合垫4上固定有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，
双测检测试纸条2的反应膜5上包括有第二检测线53、第三检测线54和第二质控线55，第二检测线53和第三检测线54均包被有天然MP-Ag；第二质控线55上包被有羊抗鼠IgG抗体。
其中，天然MP-Ag指的是人肺炎支原体抗原；
还包括塑料卡壳7，单侧检测试纸条和双测检测试纸条2设置于塑料卡壳7内，并塑料卡壳7在两条检测试纸条的样本垫处均设有加样孔71，塑料卡壳7在第一检测线51、第一质控线52、第二检测线53、第三检测线54和第二质控线55处均设有透明或设置有开口。
分别在两条检测试纸条的加样孔71处加入样品后，再在加样孔71处加入稀释液，静置等显色反应。
原理是：
单测检测试纸条1的原理是：当阳性样本加入到样本垫6，样本中的抗原与结合垫处的时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体形成标记的抗原-抗体复合物，并在结合垫和反应膜上毛细管的作用下，标记的抗原-抗体复合物往第一检测线51处移动，被第一检测线51的肺炎支原体抗体固定形成抗体-抗原-抗体复合物进行显色，而结合垫处未形成复合物的至时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体移动到第一质控线52被羊抗鼠IgG抗体特异性结合固定从而显色。阴性样本，未形成时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体-抗原复合物，在第一检测线51处无显色。
双测检测试纸条2的原理是：阳性样本加入到样本垫6，样本中的IgM和IgG抗体与结合垫处的时间分辨荧光微球标记的鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，分别形成标记的肺炎支原体IgM抗体-鼠抗人IgM单抗、肺炎支原体IgG抗体-鼠抗人IgG抗体；标记的肺炎支原体IgM抗体-鼠抗人IgM单抗、肺炎支原体IgG抗体-鼠抗人IgG抗体；移动到第二检测线53、第三检测线54处被天然的MP-Ag固定从而显色，未形成复合物的鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体与第二质控线55处的羊抗鼠IgG抗体固定从而显色。阴性样本，则在第二检测线53、第三检测线54处未显色。
实施例2
制备得到以下的试剂盒：其它同实施例1，其区别在于，
其还包括加样装置8，加样装置8包括转动连接在塑料壳上的支撑杆81，支撑杆81上还转动可拆卸连接有透明的加样管82，加样管82管口设有可开合的管盖83。加样管82设有容置稀释液的容腔，加样管82上沿其纵向平行设有一根以上的推杆821，推杆821的外侧设有标志加样管82管腔内容积的刻度，推杆821从加样管82的外侧延伸至容腔的壁面上，并推杆821可向容腔内往返活动，推杆821在其延伸端设有凸起822，容腔的壁面上设有与凸起822相配合卡扣的凹槽823。当推动其中一根推杆821，使推杆821上的凸起822与其匹配的凹槽823卡扣后，推杆821将加样管82的上部分液体隔离在推杆821上方，打开管盖83后，推杆821以下的液体加入到目标样本垫6上，从而可以根据推杆821以下液体的体积实现精确定量加样。
使用时，打开管盖83，加样管82中的液体就会流出到样本垫6上参与反应，采用转动连接的目的是实现加样管82的灵活活动，便于加样。在未使用时，支撑杆81和加样管82可以折叠在塑料壳上。加样时，调整加样管82时管口对着加样孔71，就可以实现加样，加样管82可设置为可拆卸结构，血液、血清等样品可以通过加样管82向加样孔71先加样，再置换成新的加样管82加入稀释液。
实施例3
其它同实施例2，不同点在于，其还包括连接于样本垫6的加样板9，加样板9上设有加样凹槽91和通道92，加样凹槽91上连通有两个通道92，两个通道92分部延伸至单侧检测试纸条和双测检测试纸条2的样本垫6上。加样凹槽91的高度高于结合垫4加样孔71的高度。这样可以实现加样板9中的样品可分别单向向两条检测试剂条的结合垫4加样，加样装置8的加样管82管口对着加样凹槽91血液等样品以及稀释液凹槽823加样即可。
本发明的实施例1-3中的时间分辨荧光微球用稀土元素铕包被的纳米微球。反应膜5为玻璃纤维素膜或硝酸纤维素膜，
自主提取得到：鼠抗人IgG，鼠抗人IgM，肺炎支原体抗体A/B，天然MP-Ag。鼠抗人IgG，鼠抗人IgM，肺炎支原体抗体，通过免疫小鼠，融合，筛选，亚克，定株，制备腹水，纯化一系列步骤制备而成。
MP-Ag是直接采购菌种回来培养，然后纯化。
实施例4
采用实施例1的试剂盒的检测方法及结果判定
检测方法，步骤如下：
步骤一、选择待测样品，包括全血，血清，血浆，咽拭子；
步骤二、加样：将全血、血清或血浆样品吸取10ul样品加入到双测检测试纸条2的加样孔71内，再吸取稀释液80-100ul加到同一加样孔71内；取咽拭子放到0.5ml的样本稀释液中混匀，然后将混匀液80-100ul加到单测检测试纸条1的加样孔71中。
步骤三、将反应后的测试卡插入到荧光免疫分析仪中进行检测；
当第一检测线51、第二检测线53、第三检测线54、第一质控区和第二质控区都显色时，判定为阳性；
当第一检测线51、第二检测线53、第三检测线54中一条或两条显色时，需要重新检测，若多次检测出现相同的情况，判定为疑似，则需要根据病患的具体情况判定阴性或阳性。
当第一质控区或第二质控区其中一个不显色时，为无效，需重新检测；
当第一检测线51、第二检测线53、第三检测线54均不显色，且第一质控区和第二质控区都显色时，则判定为阴性。
实验数据：
收集50例阳性样本(为亚辉龙试剂测定阳性样本)，用本发明实施例1检测试剂盒测试IgM,结果49例为阳性，与对比试剂符合率98％。收集随机样本200例，本试剂测试结果10例出现IgM阳性，其它阴性；用厦门为正试剂复测以上10例阳性样本，结果显色全部阳性，与本发明实施例1检测试剂盒测试结果一致。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于，其包括均设有底板和设置在底板上的依次连接的样本垫(6)、结合垫(4)、反应膜(5)和吸水垫(3)的单侧检测试纸条和双测检测试纸条(2)；
所述单测检测试纸条(1)的结合垫(4)上固定有时间分辨荧光微球标记的肺炎支原体抗体，
所述单测检测试纸条(1)的反应膜(5)上设有第一检测线(51)和第一质控线(52)，第一检测线(51)包被有肺炎支原体抗体，第一质控线(52)包被有羊抗鼠IgG抗体；
所述双测检测试纸条(2)的结合垫(4)上固定有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgM单抗和鼠抗人IgG抗体，
所述双测检测试纸条(2)的反应膜(5)上包括有第二检测线(53)、第三检测线(54)和第二质控线(55)，所述第二检测线(53)和第三检测线(54)均包被有天然MP-Ag；第二质控线(55)上包被有羊抗鼠IgG抗体。
2.如权利要求1所述联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于，其还包括塑料卡壳(7)，所述单侧检测试纸条和双测检测试纸条(2)设置于塑料卡壳(7)内，并塑料卡壳(7)在两条检测试纸条的样本垫(6)处均设有加样孔(71)，塑料卡壳(7)在第一检测线(51)、第一质控线(52)、第二检测线(53)、第三检测线(54)和第二质控线(55)处均设有透明或设置有开口。
3.如权利要求2所述的联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于，其还包括加样装置(8)，所述加样装置(8)包括转动连接在塑料壳上的支撑杆(81)，所述支撑杆(81)上还转动连接有加样管(82)，所述加样管(82)管口设有可开合的管盖(83)。
4.如权利要求3所述的联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于：所述加样管(82)设有容置稀释液的容腔，所述加样管(82)上沿其纵向平行设有一根以上的推杆(821)，所述推杆(821)从加样管(82)的外侧延伸至容腔的壁面上，并推杆(821)可向容腔内往返活动，所述推杆(821)在其延伸端设有凸起(822)，所述容腔的壁面上设有与所述凸起(822)相配合卡扣的凹槽(823)。
5.如权利要求4所述的联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于：所述推杆(821)的外侧设有标志加样管(82)管腔内容积的刻度。
6.如权利要求4所述的新联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于：所述单侧检测试纸条和双测检测试纸条(2)设置为相互独立不连接。
7.如权利要求1所述的联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于，其还包括连接于样本垫(6)的加样板(9)，所述加样板(9)上设有加样凹槽(91)和通道(92)，加样凹槽(91)上连通有两个通道(92)，两个通道(92)分部延伸至单侧检测试纸条和双测检测试纸条(2)的样本垫(6)上。
8.如权利要求1所述的联合诊断支原体肺炎的诊断试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光微球用稀土元素铕包被的纳米微球。
9.如权利要求1联合检测支原体肺炎的检测试剂盒在联合检测支原体肺炎支原体及其IgM/IgG中的应用，其特征在于：将样品先加入到样本垫(6)处，再加入稀释液后，静置观察反应膜(5)上的显色反应。
10.如权利要求7所述的诊断试剂盒在联合检测支原体肺炎支原体及其IgM/IgG中的应用，其特征在于：所述稀释液为磷酸盐、Tris、hepes、硼酸、表面活性剂吐温20、惰性蛋白和氯化钠中的一种或两种及其以上组合。
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