CN113804881A - 一种检测肺支原体抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肺支原体抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用，所述试纸条包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的肺支原体抗原，所述纤维素膜上设有一条包被葡萄球菌蛋白A的检测T线，以及一条包被羊抗小鼠IgG的质控C线。本发明基于以荧光微球作为示踪剂建立一种检测小鼠肺支原体抗体免疫荧光层析试纸条。与传统快速检测技术性能比较，具有很好的敏感性、特异性和稳定性，减少样本中干扰物质的影响，检测结果准确可靠，检测范围更宽，操作简单，快速，成本低廉，易于推广。

Description

一种检测肺支原体抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用

技术领域

本发明属于免疫荧光层析试纸检测领域，具体涉及一种检测肺支原体抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用。

背景技术

支原体(Mycoplasma pulmonis,简称MP)是支原体属中的一种微生物，支原体感染可以引起实验动物大、小鼠严重的疾病，有调查表明，60％屏障系统和100％普通环境饲养的大、小鼠可能感染一种甚至多种支原体，从大、小鼠体内分离到的支原体有5种：鼠肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、溶神经支原体(M.neurolytium)、关节炎支原体(M.arthritidis)、鼠支原体(M.muris)以及大肠支原体(M.collis)。其中鼠肺支原体可以引起大、小鼠呼吸系统疾病，包括鼻炎、中耳炎、气管炎和肺炎。此外还能侵犯生殖系统，引起动物繁殖力的下降。但是，尽管支原体具有致病性，多数时候是以隐性感染存在。这种隐性感染容易引起人们的忽视，而实际支原体炎症影响免疫调节，因而严重影响实验结果。

肺支原体是危害实验大、小鼠的重要病原微生物，严重影响实验动物的质量，我国国家标准规定，清洁级以上小鼠应排除肺支原体。要维持一个无支原体感染的鼠群，第一步就是要建立一套有效的常规的支原体检测系统。目前，对肺支原体的诊断最传统、最经典的方法是分离培养法，但该方法比较耗时、耗力。在我国的实验动物国家标准中也推荐了如酶联免疫吸附试验等血清学方法，针对抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)方法发展很快，ELISA检测肺支原体抗体，敏感性高，特异性好，但耗时比较久，只适用于实验室检测。因此，建立灵敏高、特异性好、快速、简便且成本低廉的新型检测方法是感染性疾病诊断的当务之急。

免疫层析试验作为即时检验(point-of-care testing，POCT)的一种主要方法，其产品已经从第一代胶体金定性免疫层析检测、第二代胶体金半定量色板卡比色或仪器阅读，向着第三代全定量、自动化、信息化、智能化方向发展。该技术独特的立体反应模式，具有酶联免疫吸附法、化学发光法、气相-液相色谱法、毛细管电泳等方法所不具备的优点，快速、简便、灵敏、直观、价格低廉，可进行现场检测，在检测技术中处于重要地位，是对传统和大型仪器检测方法的有力补充。传统示踪物为胶体金。胶体金也称金溶胶，是由金盐还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金具有胶体性质、呈色性及光吸收性。胶体金免疫层析技术已经在临床诊疗中广泛应用，在许多方面具有明显优势，但是在实际应用中也暴露出一些不足。胶体金试纸条/卡结果判定容易受环境、标本加样量多少，观察时间等因素影响；一些病原体检测存在交叉反应；检测中可出现假阳性和假阴性反应，存在前带现象，其敏感性和特异性不如ELISA和化学发光法；多数产品不能定量或定量不准确，检测范围有待进一步拓宽。

发明内容

本发明的第一个目的在于，针对现有试纸条检测范围小、灵敏度低等问题，提供一种灵敏度更高，检测范围更大的免疫荧光层析试纸条。

本发明的第二个目的在于提供上述试纸条在检测支原体抗体中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第四个目的在于提供一种检测系统。

本发明的第五个目的在于提供一种检测支原体抗体的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种免疫荧光层析试纸条，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的肺支原体抗原，所述纤维素膜包含一条包被葡萄球菌蛋白A的检测T线。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光微球标记的肺支原体抗原的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述结合垫上荧光微球标记的肺支原体抗原的喷涂量为0.1～0.5μL/cm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光微球标记的肺支原体抗原的浓度为1mg/mL，所述结合垫上荧光微球标记的肺支原体抗原的喷涂量为0.3μL/cm。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白A的浓度为0.2～1.5mg/mL，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白A的划线量为0.5～1.2μL/cm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白A的浓度为1mg/mL，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白A的划线量为1μL/cm。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维素膜包含一条包被抗小鼠IgG的质控C线。

在本发明的一些优选实施方式中，所述抗小鼠IgG为羊抗小鼠IgG。

在本发明的一些优选实施方式中，所述羊抗小鼠IgG的浓度为0.5～2mg/mL，所述羊抗小鼠IgG的喷涂量为0.01～0.05μL/cm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述羊抗小鼠IgG的浓度为1mg/mL，所述羊抗小鼠IgG的喷涂量为0.05μL/cm。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光微球为羧基荧光微球。

在本发明的一些优选实施方式中，所述微球直径为100nm～400nm，微球激发波长365±10nm，发射波长610±10nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述微球直径为200nm。

在本发明的一些实施方式中，所述底板为PVC底板。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维素膜为硝酸纤维素膜。

在本发明的一些实施方式中，所述检测线和质控线之间的距离为1～4mm。

在本发明的一些实施方式中，所述样品垫含有1％BSA、0.9％NaCl、1％PEG4000、0.5％Triton X-100、和0.3‰Proclin300的0.2M硼砂-硼酸缓冲液，pH为9.0。

在本发明的一些实施方式中，所述吸水垫为普通吸水纸。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光微球标记的肺支原体抗原的制备方法为：

(1)活化：将荧光微球加入缓冲液中后再加入活化剂活化；

(2)偶联：离心弃上清后加缓冲液复溶，再加入肺支原抗原偶联1.5～2.5h；

(3)封闭：离心弃上清后加微球保护液复溶，再加BSA封闭后即可。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液的pH为8～9.5，优选为9；所述缓冲液为硼酸缓冲液，浓度为0.03～0.07mol/L，优选为0.05mol/L。

在本发明的一些实施方式中，所述活化剂为EDC和NHS，质量比为1:1。

在本发明的一些实施方式中，所述EDC和NHS的浓度均为0.8～1.2mg/ml，优选为1mg/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述活化时间为20～40min，优选为30min。

在本发明的一些实施方式中，所述离心条件为：11000rpm～13000rpm离心20～40min，优选为12000rpm离心30min。

在本发明的一些实施方式中，所述偶联时间为1～3h，优选为2h。

在本发明的一些实施方式中，所述微球保护液为0.01M PBS，2％蔗糖，0.5％BSA，0.3‰Proclin。

在本发明的一些实施方式中，所述BSA的浓度为8～12％。

在本发明的一些实施方式中，所述封闭的时间为0.5～2h，优选为1h。

在本发明的一些实施方式中，所述试纸条的制备方法包含以下步骤：

S1：制备荧光微球标记的肺支原体抗原；

S2：将步骤S1制备的荧光微球标记的肺支原体抗原喷涂于结合垫上，36～40℃干燥3～5h；葡萄球菌蛋白A和抗小鼠IgG分别包被与于硝酸纤维素膜上作为T线和C线，36～40℃干燥3～5h，将样品垫、微球结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序粘贴于底板上，切裁至3～5mm试纸条。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的试纸条在检测支原体抗体中的应用。

在本发明的一些优选实施方式，所述支原体为肺支原体。

本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一个方面所述的试纸条。

本发明的第四个方面，提供一种检测系统，所述检测系统包含本发明第一个方面所述试纸条。

在本发明的一些实施方式中，所述检测系统还包括荧光定量分析仪。

本发明的第五个方面，提供一种检测支原体抗体的方法，具体为在本发明第一个方面所述的试纸条样品垫上滴加样品，反应后检测荧光信号。

在本发明的一些实施方式中，所述支原体为肺支原体。

本发明的有益效果是：

本发明基于以荧光微球作为示踪剂建立一种检测小鼠肺支原体抗体免疫荧光层析试纸条。试纸条的检测范围为0～640TU/mL，与其他小鼠阳性血清没有交叉反应，可以减少样本中干扰物质的影响。最低检出量为1:3200，具有很高的灵敏度。批内批间的变异系数都在10％以下，重复性好。阳性符合率为100％，阴性符合率100％，总符合率100％。具有很好的敏感性、特异性和稳定性，检测结果准确可靠，检测范围更宽，操作简单，快速，成本低廉，易于推广。

附图说明

图1为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条进行定量检测血清中肺支原体抗体的标准曲线。

图2为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条的特异性检测结果。

图3为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条的灵敏度检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1一种检测肺支原体抗体的免疫荧光层析试纸条的制备

材料：硝酸纤维素膜，玻璃纤维膜，吸水纸，PVC底板，划膜喷金仪，切条仪均购自于上海捷宁生物科技有限公司；葡萄球菌蛋白A(SPA)，羊抗鼠IgG均购自于索莱宝科技有限公司；羧基荧光微球，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自于赛默飞世尔科技有限公司等。小鼠肺支原体ELISA试剂盒购自美国EBI-xpress Biotech International公司。

其中肺支原体抗原的制备方法为：购买于ATCC的肺支原体以1：100的比例接种于支原体肉体培养基，培养收获300mL支原体培养液，13000rpm离心40min收集菌体沉淀，PBS洗3次，然后加入PBS，冰浴超声裂解100次(220w,6s/10s)，至溶液清澈透亮，14000rpm离心10min收集上清，即获得肺支原体抗原。

免疫荧光层析试纸条的制备：

S1：取20μl荧光微球加入500μL 0.05mol/L的硼酸缓冲液(PH＝9.0)旋涡振荡混匀后，加入50μL EDC溶液(1mg/ml)和50μL NHS(1mg/ml)作为活化剂混匀后，振荡活化30min，12000rpm离心30min，弃上清；加入800μL 0.05mol/L硼酸缓冲液(PH9.0)复溶沉淀后，再加入10μg肺支原体抗原，室温下振荡偶联2h，12000rpm离心30min，弃上清；加入400μL微球保护液复溶沉淀后，加入50μL 10％BSA溶液振荡封闭1h，置于4℃保存备用。

S2：将荧光微球标记的肺支原体抗原按0.3μL/cm的喷涂量喷涂于结合垫上，37℃干燥3h。1mg/mL葡萄球菌蛋白A和1mg/mL羊抗小鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜上作为T线和C线，37℃干燥3h，将样品垫、微球结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序粘贴于PVC底板上，切裁至4mm试纸条待检。

其中样品垫含有1％BSA、0.9％NaCl、1％PEG4000、0.5％Triton X-100、和0.3‰Proclin300的0.2M硼砂-硼酸缓冲液，pH为9.0；微球保护液为0.01M PBS，2％蔗糖，0.5％BSA，0.3‰Proclin。

实施例2效果例

实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条检测原理：采用样品稀释液将血清稀释10倍后，取100μL样品加样，10min后进行检测，记录荧光定量分析仪上的T值、C值。

1.线性范围

通过荧光值和浓度曲线关系可以计算出被检测样本的浓度，本实验血清作为真实建标基质建立标准曲线，以lg(T/C)为纵坐标，以自定义的标准品浓度(TU/mL-1)的对数为横坐标，血清样本在选定的线性范围10～640TU/mL的标准曲线为y＝-0.2782x²+1.7544x-2.439，线性关系R²为0.9985，如图1。结果显示，实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条的检测范围为0～640TU/mL。

2.特异性

使用实施例1中的荧光免疫层析试纸条对小鼠呼肠孤病毒III型(Reo-3)、小鼠肝炎病毒(MHV-A59)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠肺炎病毒(PVM)、鼠痘病毒(Ect)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠诺如病毒(MNV)、小鼠仙台病毒(SV)及小鼠肺支原体(Mpul)的阳性血清进行特异性检测，具体结果显示见表1和图2，其中图2从左到右依次为小鼠仙台病毒(SeV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠肝炎病毒(MHV-A59)、小鼠呼肠孤病毒III型(Reo-3)、鼠痘病毒(Ect)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠诺如病毒(MNV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)及小鼠肺支原体(Mpul)。结果见表1。

表1肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条特异性检测结果

病原	荧光值(TU/mL)	结果判断
			SeV	＜10	阴性
PVM	＜10	阴性
			MHV-A59	＜10	阴性
Reo-3	＜10	阴性
			Ect	＜10	阴性
MVM	＜10	阴性
			MNV	＜10	阴性
Mad	＜10	阴性
			TMEV	＜10	阴性
Mpul	114.56	阳性

从结果可以看出，SeV，PVM，MHV-A59，Reo-3，Ect，MVM，MNV，Mad，TMEV，阳性血清检测均为阴性，只肺支原体阳性血清检测为阳性，表明实施例1中的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条特异性良好并与其他小鼠阳性血清没有交叉反应。

3.灵敏度检测

将肺支原体高免阳性血清稀释6个梯度(1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400)，其中肺支原体高免阳性血清的来源为将肺支原体免疫6周龄的小鼠，免疫三次获得的血清即为高免血清。使用实施例1中的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条进行灵敏度检测。结果见图3和表2。

表2肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条灵敏度检测结果

从结果可以看出，实施例1中的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条对肺支原体高免血清的最低检出量为1:3200，具有很高的灵敏度。

4.重复性实验

选取稀释度为1:200，1:800，1:3200的血清作为质控品，分别对同批次的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测，计算批内变异系数。对3个不同批次的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测，计算批间变异系数。结果如表3所示。

表3肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条重复性检测结果

从表3可以看出，批内变异系数分别为2.00％，0.78％，1.92％；批间变异系数分别为3.66％，4.39％，9.74％，批内批间的变异系数都在10％以下，证明实施例1中制备得到的试纸条重复性好。

5.临床样品检测

将采集的感染肺支原体的不同感染时间段小鼠血清15份和临床小鼠血清样本50份，分别用小鼠肺支原体ELISA试剂盒和实施例1中的肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测对15份人工感染肺支原体不同时间段小鼠血清(编号为MI-1～MI-15)和50份临床小鼠血清样本(标号为1～50)进行检测，检出15份肺支原体阳性样本，50份肺支原体阴性样本，结果见表4。

表4肺支原体抗体免疫荧光层析检测试纸条与ELISA试剂盒检测临床样品结果

注：荧光值＞10TU/mL为阳性，荧光值＜10TU/mL为阴性；OD值＞0.3为阳性，OD值＜0.3为阴性。

从表4可以看出，实施例1中所制备的试纸条与ELISA检测结果对比，检测结果完全一致，阳性符合率为100％，阴性符合率100％，总符合率100％，说明实施例1中的试纸条具有很好的准确率。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种免疫荧光层析试纸条，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上设有荧光微球标记的肺支原体抗原，所述纤维素膜上包括一条包被葡萄球菌蛋白A的检测T线。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的肺支原体抗原的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述结合垫上荧光微球标记的肺支原体抗原的喷涂量为0.1～0.5μL/cm。

3.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白A的浓度为0.2～1.5mg/mL，所述纤维素膜上肺支原体抗原的划线量为0.2～1.5μL/cm。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述纤维素膜还包括一条包被抗小鼠IgG的质控C线；优选地，所述抗小鼠IgG为羊抗小鼠IgG；优选地，所述羊抗小鼠IgG的浓度为0.5～2mg/mL；更优选地，所述羊抗小鼠IgG的喷涂量为0.01～0.05μL/cm。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球为羧基荧光微球。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述底板为PVC底板；优选地，所述纤维素膜为硝酸纤维素膜。

7.权利要求1至6任一项所述的试纸条在检测支原体抗体中的应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至6任一项所述的试纸条。

9.一种检测系统，其特征在于，包含权利要求1至6任一项所述的试纸条；优选地，还包括荧光定量分析仪。

10.一种检测支原体抗体的方法，其特征在于，在权利要求1至6任一项所述的试纸条样品垫上滴加样品，反应后检测荧光信号。

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