CN208443852U - 用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡；旨在提供一种灵敏度高，检测结果可靠的用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡；其技术要点包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线；属于动物疫病检测领域。

Description

用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡

技术领域

本实用新型公开了一种免疫荧光层析检测卡，具体地说，是一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡。

背景技术

C反应蛋白(CRP)是机体非免疫系统的组成成分，在多种哺乳动物疾病的急性期有重要的诊断警示作用。CRP在肝脏的合成反应主要由IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子所调节。CRP浓度受年龄、性别和体重的影响不大。在人类临床医学诊断中，CRP作为炎性或非炎性疾病的诊断标志物进行检测已超过30年。在兽医临床上，犬CRP的检测在临床应用中也比较广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断、手术后感染的监测、抗生素疗效的观察、病程监测及预后判断等。犬CRP对疾病敏感度高，能在疾病早期快速升髙，及时反映病情；而且CRP的浓度不受到抗生素及免疫抑制剂的影响，在治疗中可以准确地对疾病的发展进行监测，在临床诊疗中具有很高的价值。因此作为炎症标记物，CRP在兽医临床上的作用日趋显著，检测犬CRP对临床诊断、疗效及预后观察等具有重要价值。

CRP是由肝脏合成的一种能与肺炎链球菌C多糖反应形成复合物的急性时相反应蛋白。它由5个相同的亚基单位以非共价方式联接，与人CRP不同，犬CRP的5个亚基中有两个被糖基化。研究表明，各种抗其他物种CRP蛋白的抗血清，都不能和急性期犬血清或者分离的犬CRP发生交叉反应，说明其他物种CRP和犬CRP没有共同的抗原性，这种现象也说明犬CRP的快速检测方法不能依赖于人的商品化CRP快速检测试纸条。目前，临床中快速检测犬CRP的方法多是依赖于临床检测仪器，这在普通宠物医院并不具备。而且，对于动物疫病诊断行业，很多情况下，对于疾病的诊断需要在野外进行，这对于现行犬CRP 检测方法是没有办法完成的。时间分辨荧光免疫层析技术采用稀土元素(如Eu³⁺等)克服了荧光微球灵敏度较差的缺点。与放射性免疫分析相比，时间分辨荧光免疫层析技术无放射性污染，具有灵敏度高、抗基质干扰性好，稳定性强等优点。

中国专利ZL201710468621.6公开了一种犬C反应蛋白荧光检测试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬 C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体；但是该方法存在下述缺点:检测线包被抗体为多克隆抗体，可能会影响到检测的特异性；另外反应膜检测区和质控区发生免疫反应时，共用一种标记物：鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，当样本中C反应蛋白变化是，C线荧光值将相应变化，从而可能影响C值和T/C 值的稳定性，从而严重影响定量的准确性。

中国专利ZL201710468614.6公开了一种犬C反应蛋白胶体金免疫层析试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体。该方法选用了胶体金作为示踪物，免疫标记物依靠静电吸附，存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷，无法完全满足临床的检测需求。

实用新型内容

针对上述问题，本实用新型的目的是提供一种灵敏度高，检测结果重现性的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡。

为此，本申请提供的技术方案是这样的:

一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C 线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。

进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，还包括盒体，所述盒体内设有样品稀释瓶和用于检测犬CDV的免疫荧光层析检测卡。

进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述盒体内还设有吸管。

进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述的壳体上设有与样品垫相适配的加样孔，与结合垫相适配的观察窗口。

进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述的壳体上表面还设有防滑条。

与现有技术相比，本实用新型提供的技术方案具有如下优点：

1、本实用新型操作步骤简单，对样品预处理方法进行优化，只需要采集犬血清，稀释后加入到检测卡的加样孔中即可检测，检测速度快，10分钟出结果，结果即可定性观察又可定量测定，大大降低检测成本，减少工作量。

2、本申请提供的技术方案，通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化，相比传统工艺，灵敏度明显高，最低检测限(LOD)可达到0.86mg/L(原工艺1.56mg/L)，线性更好，剂量-反应曲线的决定系数由0.9874提升到0.9989。

3、本申请提供的技术方案对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化，进一步提高了检测卡的精密度。

附图说明

图1是本实用新型提供的检测试纸卡结构示意图；

图2是本实用新型提供的检测试纸条结构示意图；

图3是本实用新型提供的另一种检测试纸卡结构示意图；

图4是本实用新型提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；

图5是本实用新型提供的检测卡判定结果为阴性示意图；

图6是本实用新型本实用新型提供的检测卡判定结果为无效时一种示意图；

图7是本实用新型本实用新型提供的检测卡判定结果为无效时另一种示意图；

图8是本申请提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本实用新型的权利要求作进一步的详细说明。

实施例1

本实用新型提供的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图2，包括壳体7，所述的壳体7内设有用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括卡底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的 CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY；所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY 的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2 相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条，方便试剂卡的取出与放入。

实施例2

本申请提供的另一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图3，包括盒体9，所述的体9内设有样品稀释液瓶6，吸管8以及检测卡，所述检测卡位于壳体7内，所述用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY。所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条，方便试剂卡的取出与放入。

更为具体的说，所述的样品稀释液瓶中样品稀释液为含1％S9、1％SDS、0.1％Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液。

实施例3

实施例1或者2中提供的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法是在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下进行装配，在底板1上依次衔接有硝酸纤维膜4、吸水垫5、结合垫3和样品垫2；将粘贴好的大板切成4.0MM宽的试纸条，装入塑料卡壳内，即CDV检测卡；将每一检测卡置于铝膜袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。

具体制备方法如下：

1.1结合垫的制备

1.1.1 CRP单克隆抗体的标记

1)选择微球：微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。

2)稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL 0.1M的MES标记缓冲液(2-(N-吗啡啉) 乙磺酸，加入荧光微球1mg，涡旋混匀。

3)微球的活化：在上述离心管中加入(20-50)μl(优选30μl)50mg/mL标记活化剂A[50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]，涡旋混匀后加入(20-50)μl(优选30μl)50mg/mL标记活化剂B[50mg/mL1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]，旋转培养器上反应30min；

4)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2mL淬灭剂(含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液)，超声2s；

5)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20μg CRP单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；

6)封闭：加入200.0μl标记封闭液[含3％牛血清白蛋白(BSA)的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液]，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；

7)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入600.0 μl标记荧光微球稀释液[含1％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％牛丙种球蛋白、3％蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液]，超声，工作2S，间歇5S，重复3次。

1.1.2质控C线抗体的标记

1)稀释微球：取一离心管，加入1mL的标记缓冲液，取荧光微球0.5mg，涡旋混匀；

2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl(优选30μl)标记活化剂A[含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]和20 μl-50μl(优选30μl)标记活化剂B[含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]，旋转培养器上反应30min；

3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入1mL淬灭剂(含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液)，90W超声，工作2s，间歇5s，重复1次；

4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入0.25mg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；

5)封闭：加入标记封闭液[含3％牛血清白蛋白(BSA)的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液]，封闭30min；

6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入1mL标记荧光微球稀释液[含1％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％牛丙种球蛋白、3％蔗糖的pH9.0 0.1M 的甘氨酸缓冲液]，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次。

1.1.3喷膜

1)将璃纤维裁切为(10±1)mm×(300±10)mm大小为结合垫；

2)将标记后的T、C线抗体按20:1(V：V)混合均匀，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次；

3)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；

4)喷完后，37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。

1.2反应膜的制备

1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C线工作液。

2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将另一株CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T线工作液。

3)取PVC底板，粘贴硝酸纤维膜。

4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm。

5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。

1.3样品垫制备

1)配制样品垫处理液：含1％牛血清白蛋白(BSA)、2％聚乙二醇4000和0.5％Triton X-100的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液；

2)以10μl/cm的浓度将缓冲液喷涂于玻璃纤维上。

检测方法

为了便于使用本申请提供的检测卡，下面给出本申请提供的检测卡提供两种检测方法。

方法一：采用紫外灯照射，参阅图4至图7：用手持式紫外线灯照射观察窗口，当质控线和检测线都有量荧光出现时(图4)，说明样品中CRP抗原为阳性；当只有质控线有荧光而检测线无荧光出现时(图5)，说明样品中CRP抗原为阴性；质控线未出现荧光(图6、图7)，则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。

方法二：免疫荧光检测仪检测结果：

1)收集犬血清；

2)取10μl加入含有1.0mL样品稀释液(含1％S9和0.1％Triton X-100的的0.1M 的pH7.8Tris-盐酸缓冲液的样品管中，充分混匀；

3)取出检测卡，打开干式免疫荧光检测仪；

4)吸取稀释后的样本75μl，加入到检测卡的加样孔中，将检测卡放入到仪器的卡槽中，开始计时；

5)10min后，点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试；

6)荧光强度与样品中的CRP浓度成正比，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算，剂量反应曲线Log(Y)＝0.59476Log(X)–0.5267，R＝0.9994(R2＝0.9989)，参阅图3。

免疫荧光检测仪检测结果：

1、线性范围

1.1.1将CRP校准品用阴性血清分别稀释到0mg/L、2.5mg/L、7.5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L 和800mg/L；

1.1.2将以上各浓度样本分别取75μL，加入至制备好的犬CRP检测试剂中，每浓度重复测试2次；

1.1.3反应10min后，将试纸放入干式免疫荧光分析仪中，读取T/C值，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。

1.1.4测试结果显示：试剂在检测2.5～300mg/L的CRP线性拟合关系较好，r＞0.9900，当CRP浓度增加到400mg/L时，线性拟合r值小于0.9900，T/C增长减缓，CRP在 400～500mg/L时T/C值平缓，CRP达到600mg/L时，T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到300mg/L。

2、最低检出限

将阴性血清，重复测试20次，计算T/C均值，将其代入剂量-反应曲线中，得出本方法的最低检出限为0.86mg/L。具体见表1和图8；

表1

3、精密度

将CRP校准品用阴性血清稀释至10mg/L、30mg/L、100mg/L，用本方法检测卡每浓度重复测试10次，计算测试浓度的变异系数。结果表2所示，由此可以看出，本试剂盒检测的变异系数均小于10％(三个浓度分别为7.21％、6.24％和4.26％)，因此本检测方法具有较高的精密度。

表2

	浓度	CV
			质控Ⅰ	10mg/L	7.21％
质控Ⅱ	30mg/L	6.24％
			质控Ⅲ	100mg/L	4.26％

为了更好的说明本实用新型的有益效果，下面给出采用本实用新型提供的检测试剂与其他方法(胶体金法、荧光层析法)等在检测犬C-反应蛋白时的检测性能比较，见表3。

表3

上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板(1)，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于，所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32)，所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，还包括盒体(9)，所述盒体(9)内设有样品稀释瓶(6)和用于检测犬CDV的免疫荧光层析检测卡。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述盒体(9)内还设有吸管(8)。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的免疫荧光层析检测卡位于壳体(7)内，所述的壳体(7)上设有与样品垫(2)相适配的加样孔(72)，与结合垫(3)相适配的观察窗口(71)。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的壳体(7)上表面还设有防滑条(73)。