CN110850092B - 小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法 - Google Patents

小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法 Download PDF

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Abstract

小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，包括；步骤一：制备培养基和溶液：步骤二：样品垫的制备：步骤三：胶体金的制备：步骤四：重组蛋白pGEX‑4T‑V、Nig75/1浓缩病毒和三株单抗的金标记：步骤五：反应膜的制备；步骤六：PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条的组装、分切和包装：步骤七：PPR双抗体夹心胶体金试纸条样品的检测：步骤八：PPR双抗原夹心胶体金试纸条样品的检测：步骤九：PPR双抗原夹心胶体金试纸与商品化试剂盒对样品检测的比对。本发明应用金标PPRV V蛋白、Nig 75/1疫苗毒和三株单抗建立的双抗体和双抗原胶体金检测方法，方法操作简单、快速，无需任何仪器，适用于大量临床样品的检测。

Description

小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法
技术领域
本发明涉及应用分子生物学检测PPR技术领域，特别涉及小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法。
背景技术
现有检测PPRV抗体应用N蛋白的McAb建立的c-ELISA方法；检测PPRV抗原应用的是RT-PCR或荧光定量RT-PCR，应用的靶基因是N基因。上述检测方法耗时、耗力。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，具有操作简单、快速，无需任何仪器，适用于大量临床样品的检测的特点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，包括以下步骤；
步骤一：制备培养基和溶液
(1)PBS缓冲液：50mL 20×PBS溶液加双蒸水定容至1L，常温保存备用；
(2)10％HAuCl4溶液：称取HAuCl4 10g，加入到盛有100mL玻璃瓶中，充分混匀4℃保存；
(3)1％Na3C6H5O7溶液：称取Na3C6H5O7 1g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(4)0.1M K2CO3溶液：称取K2CO3 1.38g，加入到盛有90mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀定容至100mL备用；
(5)10％BSA溶液：称取BSA 10g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(6)0.01M的PB缓冲液：称取Na2HPO4 2.28g，NaH2PO4·2H2O 0.593g溶于900mL双蒸水的中，充分混匀后用1M HCl或NaOH调pH为7.4定容至1L，4℃备用；
(7)C/T线包被液：100mL PB缓冲液里加2g海藻糖，充分混匀后4℃保存备用；
(8)0.05M硼砂：称取硼砂19.07g，加900mL双蒸水搅拌混匀定容至1L，4℃储存备用；
(9)0.2M硼酸：称取12.37g的硼酸溶于900mL双蒸水中，搅拌混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(10)0.2M硼酸硼砂缓冲液：量取0.05M的硼砂800mL，0.2M的硼酸200mL，充分混匀后pH值为9.0，4℃储存备用；
(11)样品垫处理液：称取BSA 10g，PEG 4000 20g，吸取Triton X-100 5mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(12)金复溶液：称取BSA 10g，蔗糖80g，吸取T-20 5mL，防腐剂1mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(13)Conjugate 1×：使用Dilution Buffer 4稀释Conjugate 10×为Conjugate1×，配制30mL Conjugate 1×，吸取3mL Conjugate 10×到100mL瓶子里，添加27mLDilution Buffer 4，混匀，现配现用，该试剂应用于ID.vet PPR c-ELISA；
步骤二：样品垫的制备
玻璃纤维膜即样品垫完全浸没在样品垫处理液中，浸泡10min，排除样品垫上的多余液体，在37℃鼓风干燥箱干燥16-18h后，将其裁成(21±1)mm×(300±5)mm，装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，4℃保存备用；
步骤三：胶体金的制备
量取100mL双蒸水倒入三角瓶中，加入10％HAuCl4溶液0.1mL，加入搅拌后在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入现配的1％Na3C6H5O7 2.5mL，继续加热搅拌至沸腾，液体由透明变成黑色，再变成紫红色透明，将加热温度400℃调为200℃，反应10min，冷却至室温待用；
步骤四：重组蛋白pGEX-4T-V、Nig 75/1浓缩病毒和抗V蛋白的三株单抗(Y3E6、4F2和4F11)的金标记
(1)取5个EP管，吸取1mL步骤三得到的胶体金溶液润洗每个EP管1次，弃掉胶体金溶液；
(2)润洗的5个EP管里再加入1mL的胶体金溶液，加入0.1M的K2CO3 10μL/管，迅速颠倒混匀；
(3)分别吸取纯化的重组蛋白pGEX-4T-V(2mg/mL)、浓缩的Nig 75/1病毒和三株单抗(腹水)5μL加入到EP管，放入到机器上150rpm旋转混匀30min；
(4)将步骤(3)的溶液混匀后，加入10μL/管10％BSA溶液，轻轻颠倒混匀，放入到机器上150rpm旋转终止10min；
(5)在4℃、10000rpm离心20min，可见管底有沉淀；
(6)用1mL枪头移除上清，避免悬起沉淀；
(7)每管加330μL金复溶液，轻轻混匀放置4℃备用；
步骤五：反应膜(滑膜)的制备
(1)PVC板上NC膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜CN140从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上；
(2)NC膜上质控线C线溶液配制：包被液将羊抗鼠和兔抗羊IgG抗体稀释至0.5mg/mL混匀，为C线的划线溶液，一块PVC板需要35μL溶液；
(3)NC膜上质控线T线溶液配制：分别吸取20μL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig 75/1病毒和三株单抗(腹水)加入到15μL包被液中混匀，为T线的划线溶液；
(4)NC膜上包被即滑膜：在NC膜的一端做好C线和T线的标记，C线和T线的间距为0.5cm，T线与NC膜下缘的距离为1cm，C线与NC膜上缘的距离为1cm，划线浓度均为1μL/cm，速度50mm/s；
(5)干燥：NC膜上滑膜完成后，将PVC板放置在45℃的烘箱中烘烤20-24h后，进行组装；
步骤六：PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条的组装、分切和包装
步骤五完成后，在密闭的房间里，湿度≤30％，温度18-25℃进行试纸条的组装；
(1)撕去步骤五PVC板背衬(PVC板子)上端2.5cm宽的隔离纸，黏贴上吸水纸，并使吸水纸下端与NC膜至少重叠2mm；
(2)撕去PVC板背衬下端所有的隔离纸，黏贴上样品垫，并使样品垫上端与NC膜至少重叠2mm；
(3)透明胶带轻轻密封NC膜与样品垫结合处。
(4)使用切割机切割成宽度为3mm左右的条状，放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封常温放置备用；
步骤七：PPR双抗体夹心胶体金试纸条样品的检测
将步骤五滑膜包被的三株单抗Y3E6、4F2和4F11与步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11两两进行配对检测Nig 75/1浓缩病毒，具体步骤如下：
(1)96孔板分别加入步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11各20μL，Nig 75/1病毒20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊的PPR阴性血清做对照；
(2)将步骤六的4F2、4F11和Y3E6胶体金试纸条分别插入到上述96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
(3)标记的Y3E6、4F2和4F11三株单抗，分别与4F2、4F11和Y3E6单抗包被的膜两两交叉配对进行胶体金试纸条检测；
步骤八：PPR双抗原夹心胶体金试纸条样品的检测
将步骤五滑膜包被的二种抗原pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒与金标的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒两两进行配对检测绵羊血清样品和单抗，具体步骤如下：
(1)步骤四金标记的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒，分别与步骤六Nig75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白包被的膜交叉进行样品检测；
(2)96孔板中分别加入步骤四标记的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1抗原各20μL，绵羊血清和三株单抗腹水分别20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊和老鼠阴性血清做对照；
(3)将步骤六制备的Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白胶体金试纸条分别插入到步骤(2)的96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
步骤九：PPR双抗原夹心胶体金试纸与商品化试剂盒对样品检测的比对；
采集92份绵羊血清样品进行检测，并用法国ID.vet公司的商品化c-ELISA试剂盒进行对比检测，c-ELISA具体实验步骤如下：
(1)ELISA板每孔吸取25μL Dilution Buffer 13；
(2)吸取25μL阳性对照加到A1和B1孔里；
(3)吸取25μL阴性对照加到C1和D1孔里；
(4)吸取25μL羊血清样品加到其余孔里，37℃ 45min；
(5)弃掉液体，添加300μL/孔的Wash Solution，洗涤3次，3min/次；
(6)100μL/孔添加Conjugate 1×，25℃ 30min；
(7)弃掉液体，添加300μL/孔的Wash Solution，洗涤3次，3min/次；
(8)100μL/孔添加Substrate Solution，25℃ 15min；
(9)100μL/孔添加Stop Solution，OD450nm读值。
本发明的有益效果：
本发明应用原核表达的PPRV V蛋白和抗V蛋白单抗建立的检测方法，该方法操作简单、快速，无需任何仪器，适用于大量临床样品的检测。
免疫胶体金标记技术是以胶体金为示踪标记物，应用于特异性抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。免疫胶体金标记技术可用于免疫电镜、光镜下的抗原定位、定量和定性研究，体外免疫层析分析中检测抗原或抗体的存在。
由于胶体金标记技术具有准确、简单、快速等优点，且检测不依赖昂贵的设备，肉眼可辨，因而适合于基层技术人员、大量检测和大面积普查等，具有广阔的应用前景和巨大的发展潜力。因此胶体金技术近年来发展迅速，日益广泛应用于疾病诊断。PPR是由副粘病毒科麻疹病毒属PPRV引起的以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性、高度接触性传染病，发病率达100％，在严重爆发时死亡率达100％以，给畜牧养殖业造成严重的经济损失。OIE将该病列为A类烈性传染病，我国将其列为I类动物疫病。因此制备和纯化了重组蛋白pGEX-4T-V，浓缩了Nig 75/1疫苗毒，制备了抗V蛋白的Y3E6、4F2和4F11三株单抗，以此为基础分别金标了重组蛋白pGEX-4T-V、Nig 75/1毒和三株单抗，建立了PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条诊断PPRV抗原和抗体，并用于了样品的检测。为PPR的诊断与预防提供技术支撑和保障，为后续新疫苗免疫动物建立新的检测方法提供技术支持。
附图说明
图1为滑膜包被的Y3E6单抗和金标4F2单抗检测Nig 75/1细胞毒示意图。
图2为滑膜包被的重组蛋白pGEX-4T-V和金标的Nig 75/1病毒检测Y3E6、4F2和4F11三株单抗示意图。
图3为滑膜包被的重组蛋白pGEX-4T-V和金标的Nig 75/1病毒检测绵羊血清样品的示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，包括以下步骤；
步骤一：制备培养基和溶液
(1)PBS缓冲液：50mL 20×PBS溶液加双蒸水定容至1L，常温保存备用；
(2)10％HAuCl4溶液：称取HAuCl4 10g，加入到盛有100mL玻璃瓶中，充分混匀4℃保存；
(3)1％Na3C6H5O7溶液：称取Na3C6H5O7 1g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(4)0.1M K2CO3溶液：称取K2CO3 1.38g，加入到盛有90mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀定容至100mL备用；
(5)10％BSA溶液：称取BSA 10g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(6)0.01M的PB缓冲液：称取Na2HPO4 2.28g，NaH2PO4·2H2O 0.593g溶于900mL双蒸水的中，充分混匀后用1M HCl或NaOH调pH为7.4定容至1L，4℃备用；
(7)C/T线包被液：100mL PB缓冲液里加2g海藻糖，充分混匀后4℃保存备用；
(8)0.05M硼砂：称取硼砂19.07g，加900mL双蒸水搅拌混匀定容至1L，4℃储存备用；
(9)0.2M硼酸：称取12.37g的硼酸溶于900mL双蒸水中，搅拌混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(10)0.2M硼酸硼砂缓冲液：量取0.05M的硼砂800mL，0.2M的硼酸200mL，充分混匀后pH值为9.0，4℃储存备用；
(11)样品垫处理液：称取BSA 10g，PEG 4000 20g，吸取Triton X-1005mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(12)金复溶液：称取BSA 10g，蔗糖80g，吸取T-20 5mL，防腐剂1mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(13)Conjugate 1×：使用Dilution Buffer 4稀释Conjugate 10×为
Conjugate 1×，配制30mL Conjugate 1×，吸取3mL Conjugate 10×到100mL瓶子里，添加27mL Dilution Buffer 4，混匀，现配现用，该试剂应用于ID.vet PPR c-ELISA；
步骤二：样品垫的制备
玻璃纤维膜即样品垫完全浸没在样品垫处理液中，浸泡10min，排除样品垫上的多余液体，在37℃鼓风干燥箱干燥16-18h后，将其裁成(21±1)mm×(300±5)mm，装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，4℃保存备用；
步骤三：胶体金的制备
量取100mL双蒸水倒入三角瓶中，加入10％HAuCl4溶液0.1mL，加入搅拌后在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入现配的1％Na3C6H5O7 2.5mL，继续加热搅拌至沸腾，液体由透明变成黑色，再变成紫红色透明，将加热温度400℃调为200℃，反应10min，冷却至室温待用；
步骤四：重组蛋白pGEX-4T-V、Nig 75/1浓缩病毒和三株单抗(Y3E6、4F2和4F11)的金标记
(1)取5个EP管，吸取1mL步骤三得到的胶体金溶液润洗每个EP管1次，弃掉胶体金溶液；
(2)润洗的5个EP管里再加入1mL的胶体金溶液，加入0.1M的K2CO3 10μL/管，迅速颠倒混匀；
(3)分别吸取纯化的重组蛋白pGEX-4T-V(2mg/mL)、浓缩的Nig 75/1病毒和三株单抗(腹水)5μL加入到EP管，放入到机器上150rpm旋转混匀30min；
(4)将步骤(3)的溶液混匀后，加入10μL/管10％BSA溶液，轻轻颠倒混匀，放入到机器上150rpm旋转终止10min；
(5)在4℃、10000rpm离心20min，可见管底有沉淀；
(6)用1mL枪头移除上清，避免悬起沉淀；
(7)每管加330μL金复溶液，轻轻混匀放置4℃备用；
步骤五：反应膜(滑膜)的制备
(1)PVC板上NC膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜CN140从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上；
(2)NC膜上质控线C线溶液配制：包被液将羊抗鼠和兔抗羊IgG抗体稀释至0.5mg/mL混匀，为C线的划线溶液，一块PVC板需要35μL溶液；
(3)NC膜上质控线T线溶液配制：分别吸取20μL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig 75/1病毒和三株单抗(腹水)加入到15μL包被液中混匀，为T线的划线溶液；
(4)NC膜上包被即滑膜：在NC膜的一端做好C线和T线的标记，C线和T线的间距为0.5cm，T线与NC膜下缘的距离为1cm，C线与NC膜上缘的距离为1cm，划线浓度均为1μL/cm，速度50mm/s；
(5)干燥：NC膜上滑膜完成后，将PVC板放置在45℃的烘箱中烘烤20-24h后，进行组装；
步骤六：PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条的组装、分切和包装
步骤五完成后，在密闭的房间里，湿度≤30％，温度18-25℃进行试纸条的组装；
(1)撕去步骤五PVC板背衬(PVC板子)上端2.5cm宽的隔离纸，黏贴上吸水纸，并使吸水纸下端与NC膜至少重叠2mm；
(2)撕去PVC板背衬下端所有的隔离纸，黏贴上样品垫，并使样品垫上端与NC膜至少重叠2mm；
(3)透明胶带轻轻密封NC膜与样品垫结合处。
(4)使用切割机切割成宽度为3mm左右的条状，放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封常温放置备用；
步骤七：PPR双抗体夹心胶体金试纸条样品的检测
将步骤五滑膜包被的三株单抗Y3E6、4F2和4F11与步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11两两进行配对检测Nig 75/1浓缩病毒，具体步骤如下：
(1)96孔板分别加入步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11各20μL，Nig 75/1病毒20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊的PPR阴性血清做对照；
(2)将步骤六的4F2、4F11和Y3E6胶体金试纸条分别插入到上述96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
(3)标记的Y3E6、4F2和4F11三株单抗，分别与4F2、4F11和Y3E6单抗包被的膜两两交叉配对进行胶体金试纸条检测；
步骤八：PPR双抗原夹心胶体金试纸条样品的检测
将步骤五滑膜包被的二种抗原pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒与金标的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒两两进行配对检测绵羊血清样品和单抗，具体步骤如下：
(1)步骤四金标记的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒，分别与步骤六Nig75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白包被的膜交叉进行样品检测；
(2)96孔板中分别加入步骤四标记的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1抗原各20μL，绵羊血清和三株单抗腹水分别20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊和老鼠阴性血清做对照；
(3)将步骤六制备的Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白胶体金试纸条分别插入到步骤(2)的96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
步骤九：PPR双抗原夹心胶体金试纸与商品化试剂盒对样品检测的比对；
采集的昌吉部分地区92份绵羊血清样品进行检测，并用法国ID.vet公司的商品化c-ELISA试剂盒进行对比检测，c-ELISA具体实验步骤如下：
(1)ELISA板每孔吸取25μL Dilution Buffer 13；
(2)吸取25μL阳性对照加到A1和B1孔里；
(3)吸取25μL阴性对照加到C1和D1孔里；
(4)吸取25μL羊血清样品加到其余孔里，37℃ 45min；
(5)弃掉液体，添加300μL/孔的Wash Solution，洗涤3次，3min/次；
(6)100μL/孔添加Conjugate 1×，25℃ 30min；
(7)弃掉液体，添加300μL/孔的Wash Solution，洗涤3次，3min/次；
(8)100μL/孔添加Substrate Solution，25℃ 15min；
(9)100μL/孔添加Stop Solution，OD450nm读值。
结果与分析
PPR双抗体夹心胶体金试纸条的样品检测
金标记的Y3E6、4F2和4F11三株单抗，分别与滑膜包被的4F2、4F11和Y3E6三株单抗两两配对进行胶体金试纸条检测样品，试验结果表明三株单抗对检测Nig 75/1细胞毒，C和T线均显示，阴性对照也成立。详见图1。
PPR双抗原夹心胶体金试纸条检测三株单抗和绵羊血清样品
金标记的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1病毒，分别与滑膜包被的Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白进行胶体金试纸条检测，试验结果表明两两配对的双抗原夹心胶体金试纸条检测三株单抗腹水和绵羊血清样品，C和T线均显示，阴性对照C线显示T线未显示，均成立。详见图2和图3。
PPR双抗原夹心胶体金试纸与商品化试剂盒对样品检测的比对
双抗原夹心胶体金试纸的敏感性和特异性与商品化试剂盒c-ELISA进行了比较分析，结果表明92份羊血清样本2份为PPRV抗体阴性，两种检测方法的符合率为98.9％。详见表1。
表1为双抗原夹心胶体金和c-ELISA检测92份绵羊血清样品的特异性和敏感性符合率比较的示意图。
单抗筛选是随机的，可以制备出针对不同表位的单抗，直接应用于ELISA、Western-blot和间接免疫荧光试验等。Y3E6单抗是以纯化的重组蛋白pGEX-4T-V作为抗原制备的单抗；4F2和4F11是以PPRV V蛋白的一段多肽作为抗原制备的单抗，多肽是通过DNAStar软件的表位预测存在于该蛋白分子表面的序列，也就是表位。由于多肽的这个特点，可以通过表位的设计制备出特异性强的单抗；但也由于这一点，无论你筛选出几株杂交瘤细胞可能都是针对同一个表位的。采用多肽做抗原关键是做好表位预测，如果预测的不准确，就无法得到想要的单克隆抗体。
为了建立特异性、敏感性更好的诊断PPRV的双抗体夹心胶体金试纸条，分别金标了三株单抗Y3E6、4F2和4F11，滑膜包被的三株单抗Y3E6、4F2和4F11与金标的单抗两两进行配对检测Nig 75/1浓缩病毒，PPR阴性血清做对照。试验结果表明，Nig 75/1病毒样品C和T线均显示，阴性对照也均成立，滑膜包被的Y3E6单抗敏感性和特异性高于4F2和4F11。初步建立了以Y3E6作为抗原包被，4F2单抗标记的PPR双抗体夹心胶体金试纸条诊断PPRV。
实验室诊断PPRV的主要方法有RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒分离、血清学检测等，国标GB/T 27982-2011检测方法为RT-PCR和荧光定量RT-PCR。病毒中和试验和病毒分离能够有效和准确地诊断出PPRV感染，不足之处是费时和费力。琼脂免疫扩散试验特异性和敏感性较低。RT-PCR和荧光定量RT-PCR等分子生物学技术，优点是灵敏度高、特异性强和耗时短，但是在提取病毒RNA的时候，影响因素较多，容易出现RNA降解或者假阳性结果，对仪器的要求也较高。此外上述提到的检测方法难以用于大量样品的临床诊断和流行病学调查，但是我们建立的双抗体夹心胶体金试纸条能检测大量样品，是一种特异性、敏感性和简便检测PPRV的方法。在我们建立的这种检测PPRV的方法，胶体金检测方法更简便，不需要任何仪器，眼观即可。目前已经有PPR N蛋白的双抗体夹心ELISA报道，关于V蛋白的还未报道。
金标重组蛋白pGEX-4T-V和浓缩的Nig 75/1病毒，滑膜包被重组蛋白pGEX-4T-V和浓缩的Nig 75/1病毒两两配对建立了PPR双抗原夹心胶体金试纸条，检测绵羊血清和三株单抗腹水，并用羊和老鼠阴性血清做对照，检测结果均成立。在这个试验中，滑膜包被的重组蛋白pGEX-4T-V建立的胶体金试纸条比Nig 75/1病毒建立的特异性和敏感性好。对羊的血清样品检测结果表明，建立的该方法与商品化试剂盒比对同源性达到98.9％。本研究建立的双抗原夹心胶体金试纸条检测方法适用于大量临床样品的检测。该检测方法简单、快速，无需任何仪器，从而满足大量临床样品监测的需要。目前我国有行业标准SN/T 3971-2014，小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法，应用的是N蛋白多抗建立的检测方法。

Claims (4)

1.小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤一：制备培养基和溶液：
步骤二：样品垫的制备：
步骤三：胶体金的制备：
步骤四：重组蛋白pGEX-4T-V、Nig 75/1浓缩病毒和抗V蛋白的三株单抗的金标记：
步骤五：滑膜的制备；
步骤六：PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条的组装、分切和包装
步骤七：PPR双抗体夹心胶体金试纸条样品的检测
步骤八：PPR双抗原夹心胶体金试纸条样品的检测
将步骤五滑膜包被的二种抗原pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒与金标的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1浓缩病毒两两进行配对检测绵羊血清样品和单抗；
所述的步骤四包括；
(1)取5个EP管，吸取1mL步骤三得到的胶体金溶液润洗每个EP管1次，弃掉胶体金溶液；
(2)润洗的5个EP管里再加入1mL的胶体金溶液，加入0.1M的K2CO3 10μL/管，迅速颠倒混匀；
(3)分别吸取2mg/mL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig75/1病毒和三株单抗5μL加入到EP管，放入到机器上150rpm旋转混匀30min；
(4)将步骤(3)的溶液混匀后，加入10μL/管10％BSA溶液，轻轻颠倒混匀，放入到机器上150rpm旋转终止10min；
(5)在4℃、10000rpm离心20min，可见管底有沉淀；
(6)用1mL枪头移除上清，避免悬起沉淀；
(7)每管加330μL金复溶液，轻轻混匀放置4℃备用；
所述的步骤五包括；
(1)PVC板上NC膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜CN140从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上；
(2)NC膜上质控线C线溶液配制：包被液将羊抗鼠和兔抗羊IgG抗体稀释至0.5mg/mL混匀，为C线的划线溶液，一块PVC板需要35μL溶液；
(3)NC膜上质控线T线溶液配制：分别吸取20μL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig75/1病毒和三株单抗加入到15μL包被液中混匀，为T线的划线溶液；
(4)NC膜上包被即滑膜：在NC膜的一端做好C线和T线的标记，C线和T线的间距为0.5cm，T线与NC膜下缘的距离为1cm，C线与NC膜上缘的距离为1cm，划线浓度均为1μL/cm，速度50mm/s；
(5)干燥：NC膜上滑膜完成后，将PVC板放置在45℃的烘箱中烘烤20-24h后，进行组装；
所述的步骤六为，步骤五完成后，在密闭的房间里，湿度≤30％，温度18-25℃进行试纸条的组装；
(1)撕去步骤五PVC板背衬上端2.5cm宽的隔离纸，黏贴上吸水纸，并使吸水纸下端与NC膜至少重叠2mm；
(2)撕去PVC板背衬下端所有的隔离纸，黏贴上样品垫，并使样品垫上端与NC膜至少重叠2mm；
(3)透明胶带轻轻密封NC膜与样品垫结合处；
(4)使用切割机切割成宽度为3mm左右的条状，放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封常温放置备用；
所述的步骤七具体为，将步骤五滑膜包被的三株单抗4F2、4F11和Y3E6与步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11两两进行配对检测Nig 75/1浓缩病毒，具体步骤如下：
(1)96孔板分别加入步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11各20μL，Nig 75/1病毒20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊的PPR阴性血清做对照；
(2)将步骤六的4F2、4F11和Y3E6胶体金试纸条分别插入到上述96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
(3)标记的4F2、4F11和Y3E6三株单抗，分别与4F2、4F11和Y3E6单抗包被的膜两两交叉配对进行胶体金试纸条检测；
所述的步骤八具体步骤如下：
(1)步骤四金标记的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒，分别与步骤六Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白包被的膜交叉进行样品检测；
(2)96孔板中分别加入步骤四标记的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1抗原各20μL，绵羊血清和三株单抗腹水分别20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊和老鼠阴性血清做对照；
(3)将步骤六制备的Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白胶体金试纸条分别插入到步骤(2)的96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；
该方法不用于疾病的诊断方法。
2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，其特征在于，所述的步骤一为：
(1)PBS缓冲液：50mL 20×PBS溶液加双蒸水定容至1L，常温保存备用；
(2)10％HAuCl4溶液：称取HAuCl4 10g，加入到盛有100mL玻璃瓶中，充分混匀4℃保存；
(3)1％Na3C6H5O7溶液：称取Na3C6H5O7 1g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(4)0.1M K2CO3溶液：称取K2CO3 1.38g，加入到盛有90mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀定容至100mL备用；
(5)10％BSA溶液：称取BSA 10g，加入到盛有100mL双蒸水的玻璃瓶中，充分混匀4℃保存备用；
(6)0.01M的PB缓冲液：称取Na2HPO4 2.28g，NaH2PO4·2H2O 0.593g溶于900mL双蒸水的中，充分混匀后用1M HCl或NaOH调pH为7.4定容至1L，4℃备用；
(7)C/T线包被液：100mL PB缓冲液里加2g海藻糖，充分混匀后4℃保存备用；
(8)0.05M硼砂：称取硼砂19.07g，加900mL双蒸水搅拌混匀定容至1L，4℃储存备用；
(9)0.2M硼酸：称取12.37g的硼酸溶于900mL双蒸水中，搅拌混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(10)0.2M硼酸硼砂缓冲液：量取0.05M的硼砂800mL，0.2M的硼酸200mL，充分混匀后pH值为9.0，4℃储存备用；
(11)样品垫处理液：称取BSA 10g，PEG 4000 20g，吸取Triton X-100 5mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(12)金复溶液：称取BSA 10g，蔗糖80g，吸取T-20 5mL，防腐剂1mL，0.2M硼酸硼砂缓冲液900mL，充分搅拌溶解，混匀后定容至1L，4℃储存备用；
(13)Conjugate 1×：使用Dilution Buffer 4稀释Conjugate 10×为Conjugate 1×，配制30mL Conjugate 1×，吸取3mL Conjugate10×到100mL瓶子里，添加27mL DilutionBuffer 4，混匀，现配现用，该试剂应用于ID.vet PPR c-ELISA。
3.根据权利要求1所述的小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，其特征在于，所述的样品垫的制备具体为，玻璃纤维膜即样品垫完全浸没在样品垫处理液中，浸泡10min，排除样品垫上的多余液体，在37℃鼓风干燥箱干燥16-18h后，将其裁成(21±1)mm×(300±5)mm，装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，其特征在于，所述的步骤三为量取100mL双蒸水倒入三角瓶中，加入10％HAuCl4溶液0.1mL，加入搅拌后在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入现配的1％Na3C6H5O7 2.5mL，继续加热搅拌至沸腾，液体由透明变成黑色，再变成紫红色透明，将加热温度400℃调为200℃，反应10min，冷却至室温待用。
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