CN113156131A - 新型冠状病毒（covid-19）中和抗体检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

新型冠状病毒（covid-19）中和抗体检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒(COVID‑19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：检测卡，所述检测卡包括卡壳及设置于所述卡壳中的试纸条，所述试纸条包括样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背衬板，所述荧光结合垫上包含检测线荧光偶合物和质控线荧光偶合物，检测线荧光偶合物为荧光微球标记的重组新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)，硝酸纤维素膜上包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)构成的检测线，所述硝酸纤维素膜上还包被有IgY、IgG或DNP抗体构成的质控线。该试剂盒通过与荧光免疫分析仪结合，进行对样本的检测，该试剂盒检验灵敏度高、重现性好、稳定性强、操作便捷。

Description

新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)有四种主要的结构蛋白：棘突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。棘突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，其中受体结合结构域(RBD)位于S1亚基上。RBD是棘突蛋白抗原的独特区域，可与人类的ACE2受体结合，COVID-19通过RBD与ACE-2受体的结合，介导病毒进入细胞内部繁殖，从而出现症状，导致发病。
新冠病毒中和抗体可以特异性识别并且结合新冠病毒的RBD位点，在血液中和病毒结合，抢先阻断病毒与人ACE-2结合，从而防止病毒进入细胞繁殖产生症状。对新冠病毒中和抗体检测可以为疫苗研发和效果评价提供有力支撑，可以指导检测人群是否需要加强针、加强接种等。当然，新冠病毒中和抗体检测结果仅供临床参考，不能单独作为诊断或排除病例的依据。
目前，常规的抗体检测(IgG、IgM)方法不能用于新冠疫苗接种人群中和抗体的检测问题。对新冠中和抗体的检测的主要可分为胶体金、免疫荧光法(层析法，LFA)，酶联免疫吸附检测(ELISA)和化学发光法。其中胶体金法和免疫荧光法的灵敏度和精密度较差，准确度低，容易受到其他杂光的干扰。ELISA和化学发光法具有更高的检测灵敏性和特异性，但操作复杂、耗时长、需要大型设备和专业操作人员，在灵活性、使用便捷性、检测及时性上存在不足，而且相关试剂需要冷藏保存，在运输及保存条件上要求较高。
CN112051400A公开了一种POCT检测中的胶体金技术，其试纸条上包被鼠抗人IgG抗体的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线，结合垫上喷涂标记有鼠IgG、新冠病毒RBD或NTD中和位点蛋白的胶体金，通过与胶体金免疫分析读数仪结合，进行待测物含量的检测。此测试方法准确性及灵敏度较差，精密度较难控制。
CN112485436A公开了一种POCT检测中的胶体金技术，其试纸条上包被血管紧张素转化酶2(ACE2)的检测线和鼠抗鸡IgG抗体的控制线，胶体金垫上喷涂标记有胶体金标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白，通过肉眼观察检测线显色情况判断是否含有待测物。此该方法只能进行定性检测，不能进行定量检测，不能为临床提供较多的检测信息。
因此，在POCT检测新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体领域，仍需开发一种检验灵敏度高、重现性好、稳定性强、操作便捷的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检验灵敏度高、重现性好、稳定性强、操作便捷的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒及检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，采取以下技术方案：
一种新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡，所述检测卡包括卡壳及设置于所述卡壳中的试纸条，所述试纸条包括样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背衬板，所述样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接粘贴在所述背衬板上，所述荧光结合垫上包含检测线荧光偶合物和质控线荧光偶合物，检测线荧光偶合物为荧光微球标记的重组新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)，所述硝酸纤维素膜上包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)构成的检测线,所述硝酸纤维素膜上还包被有IgY、IgG或DNP抗体构成的质控线，所述卡壳上设有加样孔和观察窗。
进一步的，所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述质控线荧光偶合物为荧光微球标记的鸡IgY抗体、兔IgG抗体、鼠IgG抗体或DNP抗体中的一种。
进一步的，所述检测线血管紧张素转化酶2(ACE2)的浓度为0.5-2mg/mL，所述质控线为鸡IgY，或兔IgG抗体或鼠IgG抗体、BSA-DNP中的一种抗体，浓度为0.5-1mg/mL，包被量均为0.5-2μL/cm。
进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液包括10mM-20mM的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液、浓度为0.1％-1％的表面活性剂和浓度为0.01％-0.05％的防腐剂，所述表面活性剂选自吐温20或曲拉通x-100，所述防腐剂选自proclin300、山梨酸或苯甲酸中的一种。
进一步的，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球表面修饰有氨基、羧基或羟基中至少一种功能基团，所述时间分辨荧光微球内部包埋镧系元素离子，所述镧系元素选自Sm钐、Eu铕、Gd钆、Tb铽、Dy镝中的至少一种。
进一步的，所述新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒还包括ID卡，所述ID卡存储有产品的项目名称、批号等信息。
进一步的，所述荧光结合垫的材质为玻璃纤维、无纺布或聚酯膜中的至少一种，所述材质经过结合垫预处理液浸泡，置于鼓风干燥箱烘干，再采用偶合物稀释液将荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)和荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释，荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)稀释5-20倍，荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释20-200倍，稀释并混合后，均匀喷涂至已处理的材质上，置于鼓风干燥箱烘干。
进一步的，所述结合垫预处理液含有缓冲液、保护蛋白、糖类、表面活性剂；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或Tris缓冲液中至少一种，浓度为10mM-50mM；所述保护蛋白选自牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的至少一种，浓度为0.1％-3％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，浓度为0.1％-10％；所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、S16、S9中的至少一种，浓度为0.1％-1％。
进一步的，所述偶合物稀释液含有缓冲液、保护蛋白、糖类、表面活性剂、防腐剂；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或Tris缓冲液中至少一种，浓度为10mM-50mM；所述保护蛋白选自牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的至少一种，浓度为0.1％-3％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，浓度为0.1％-10％。所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、S16、S9中的至少一种，浓度为0.1％-1％；所述防腐剂选自山梨酸、苯甲酸或proclin300中的至少一种，浓度为0.01％-0.1％。
进一步的，一种用于检测新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体的荧光免疫定性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)启动仪器：开启荧光免疫分析仪，仪器进入初始界面；
2)准备：将包装盒内ID卡插入ID卡端口，并点击“读ID”，确认ID卡与检测试剂卡的批号相匹配；
3)加样：用加样枪吸取待测样本(血清、血浆、全血)20μL，加入到一管样品稀释液中，混匀。取80μL混合液至检测卡上的样本孔内；
4)模式选择：根据样本类型，在分析仪上选择样本类型“血清/血浆”或“全血”；选择“即时测试”：检测卡加样15分钟后，立即将试剂卡插入仪器中，点击“测试”按钮，系统将自动检测并显示结果；或选择“标准测试”：试剂卡加样后，立即点击“测试”按钮，并在倒计时1分钟内将试剂卡插入仪器中，系统将继续倒计时，自动检测并显示结果。
5)结果读取：系统继续倒计时，自动检测并显示结果。
本发明的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒的检测原理如下：
采用竞争法原理，结合垫上分别有荧光标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)和荧光标记的羊抗鸡IgY多克隆抗体作为显色标记物，在硝酸纤维素膜上的检测线(T)处包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)，质控线(C)处包被有鸡IgY抗体。当样本中存在中和抗体将与荧光标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)结合，并阻止RBD与ACE2之间的蛋白质相互作用，检测线(T)处不显色。当样本中不存在中和抗体，荧光标记的新型冠状病毒棘突蛋白(RBD)，被ACE2捕获，检测线(T)处显色。荧光标记的羊抗鸡IgY多克隆抗体扩散到质控线(C)区域被二抗体捕获形成质控区显色带。随着待检样本中和抗体含量的增加，检测线(T)条带的荧光信号亦减少，呈负相关。通过配套仪器收集检测区域的荧光信号，信号值与样本中抗RBD中和抗体的含量呈反比。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过比较直接竞争和间接竞争的模式，发现间接竞争模式中，液相荧光微球标记的RBD蛋白先与中和抗体反应后，可能仅有少量未结合(荧光微球标记的RBD蛋白)被固相(ACE2蛋白)所捕获，更有利于提高检测灵敏度。而直接竞争法中荧光微球标记的ACE2蛋白与待测的中和抗体，与固相(RBD抗原)结合机率是等同的，然而，液相(中和抗体或ACE2标记物)与固相(RBD抗原)的接触面积少，且反应时间短，可能仅有少量的参与反应，灵敏度受限。
(2)本发明采用时间分辨荧光微球作为标记载体，时间分辨荧光微球包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。时间分辨荧光微球所发荧光的Stokes位移(最大发射峰与最大吸收峰之间的波长差)非常大，大部分在200nm以上，与普通荧光素的Stokes位移仅为28nm，可以降低背景荧光的干扰，提高检测灵敏度。
(3)本发明试剂盒配合荧光免疫分析仪进行判读，结果更为准确客观，灵敏度更高，重复性更佳。
(4)本试剂盒可在室温条件下保存，其活性不受影响，经加速热稳定性试验测试显示稳定性良好，无需冷藏，极大方便了试剂盒的储存和运输。
(5)本试剂盒使用简单快速，经济性高，用于对新冠病毒中和抗体的快速检测，适用于普通人群的筛查。并且适用于对新冠病毒的治疗效果及治愈后检测，以及普通正常人群接种疫苗后的效果判断。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明新型冠状病毒中和抗体检测试纸条间接竞争法的原理示意图；
图2为对比例中新型冠状病毒中和抗体检测试纸直接竞争法的原理示意图；
图3为本发明一实施例的新型冠状病毒中和抗体检测的标准曲线图；
图4为本发明对比例的新型冠状病毒中和抗体检测的标准曲线图；
图5为本发明新型冠状病毒中和抗体检测卡的结构示意图。
其中：1.样品；2.新型冠状病毒中和抗体；3.荧光微球标记的重组新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)；4.检测线-血管紧张素转化酶2(ACE2)；5.荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；6.质控线-鸡IgY抗体；7.吸水垫；8.样品垫；9.荧光结合垫；10.硝酸纤维素膜；11.背衬板；12.荧光微球标记的血管紧张素转化酶2(ACE2)；13.检测线-重组新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)；14.检测卡；15.加样孔；16.观察窗；17.手持区；18.检测线(T线)；19.质控线(C线)。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
如图1及图5所示，一实施方式的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒包括检测卡14，检测卡14内设置有试纸条，试纸条包括样品垫8、荧光结合垫9、硝酸纤维素膜10、吸水垫7及背衬板11，背衬板11上依次粘贴样品垫8、荧光结合垫9、硝酸纤维素膜10及吸水垫7，样品垫8和荧光结合垫9部分叠加，并搭接于硝酸纤维素膜10的一端，吸水垫7搭接于硝酸纤维素膜10的另一端，硝酸纤维素膜10上设有检测线18与质控线19，检测线10与质控线19相互平行，且质控线19位于硝酸纤维素膜上靠近吸水垫7的一端，检测线18包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)4，质控线19包被有鸡IgY抗体。其中，荧光结合垫9上喷涂有检测线荧光偶合物及质控线荧光偶合物，检测线荧光偶合物含有荧光微球标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白3，质控线荧光偶合物含有荧光微球标记的鸡IgY抗体6。
该新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒的检测原理在于，利用新冠中和抗体阻断S-RBD蛋白与ACE-2结合的原理，通过加入新冠中和抗体后，检测结合在ACE-2上S-RBD蛋白的减少量来计算中和抗体的滴度。T线的信号值与中和抗体的滴度呈反比。
本发明创造性地发现采用间接竞争法比直接竞争法检测新冠中和抗体具有显著的性能优势。采用间接竞争反应模式，即硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)，荧光结合垫上有荧光微球标记的新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD。荧光微球标记的RBD蛋白与待测的中和抗体均是液相，与固相(ACE2抗原)结合机率是不均等的。因液相荧光微球标记的RBD蛋白先与中和抗体反应后，可能仅有少量未结合(荧光微球标记的RBD蛋白)被固相((ACE2蛋白)所捕获的。有利于提高灵敏度。而对阴性样本反应则无影响。而采用直接竞争反应模式，即硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被有新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD，荧光结合垫上有荧光微球标记的血管紧张素转化酶2(ACE2)。荧光微球标记的ACE2蛋白与待测的中和抗体均是液相，与固相(RBD抗原)结合机率是等同的。然而，液相(中和抗体或ACE2标记物)与固相(RBD抗原)的接触面积少，且反应时间短，可能仅有少量的参与反应，灵敏度受限。
进一步的，新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒还包括样品稀释液，该样品稀释液含有缓冲液、表面活性剂及防腐剂。检测时，吸取20μL全血、血清或血浆加入样品稀释液中，使充分混匀，再将其加到检测卡的加样孔上，反应15min后，将试剂卡插入荧光免疫分析仪中即可进行检测。该检测方法方便快捷、反应充分、操作简单。
该新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒基于新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体作为检测标志物，可以为新冠疫苗的免疫效果评价提供有力支撑，可以指导检测人群是否需要加强针、加强接种等。当然，新冠病毒中和抗体检测结果仅供临床参考，不能单独作为诊断或排除病例的依据。
具体地，在其中一个实施例中，所述的时间分辨荧光微球，与通常的荧光免疫分析不同，示踪物为稀土元素，而不是荧光素；优选的，稀土元素为三价镧系元素Eu铕；每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的氨基、羧基或羟基等其它功能基团，用于与新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体单克隆抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。
在其中一实施例中，所述样品稀释液包括缓冲液、表面活性剂和防腐剂，其中缓冲液为20mM-50mM磷酸盐或Tris缓冲液，所述缓冲液提供一定的pH和离子浓度，利于层析中一些免疫或其他反应的进行；所述表面活性剂为曲拉通x-100、吐温20、S16、S9中的一种或几种，浓度为0.1％-1％，所述表面活性剂起到迅速溶解，有利于层析过程中活性组分快速分散；所述防腐剂为山梨酸、苯甲酸或proclin300中的一种或几种，浓度为0.01％-0.1％，所述防腐剂可抑制溶液长菌。
在其中一实施例中，所述新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒还包括ID卡，所述ID卡存储有产品的项目名称、批号及标准曲线数据。与配套的干式荧光免疫分析仪使用，将ID卡插入后，读取相关信息。
实施例1
试剂卡的制备
(1)检测线及质控线的制备：分别配制血管紧张素转化酶2(ACE2)浓度为1.0mg/mL，鸡IgY抗体浓度为0.5mg/mL，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量1.0μL/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在37℃烘干18小时；
(2)荧光结合垫的制备：荧光结合垫的材质为玻璃纤维，经过结合垫预处理液浸泡，置于鼓风干燥箱烘干，再使用偶合物稀释液将荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)稀释20倍，荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释50倍，以喷量为4μl/cm,在荧光结合垫上喷涂，放置鼓风干燥箱，在37℃烘干18小时；结合垫预处理液含有磷酸盐缓冲液10mM、牛血清白蛋白0.5％、海藻糖10％、曲拉通x-1000.1％；偶合物稀释液含有磷酸盐缓冲液10mM、牛血清白蛋白0.5％、海藻糖10％、曲拉通x-1000.1％及防腐剂0.01％。
(3)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在50℃烘干18小时；
(4)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的相邻端部呈搭接设置，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。
检测线(新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD)荧光偶合物的制备
a)取0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；
b)按0.1mL Eu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入交联剂EDC和Sulfo-NHS，EDC终浓度0.12％，Sulfo-NHS终浓度0.36％，反应30min，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；
c)按0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入80μg的新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入Washing Buffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；
质控线(羊抗鸡IgY抗体)荧光偶合物的制备
a)取0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；
b)按0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入交联剂EDC和Sulfo-NHS，EDC终浓度0.12％，Sulfo-NHS终浓度0.36％，反应30min，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；
c)按0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入100μg的鸡IgY抗体，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入Washing Buffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到质控线荧光偶合物；
样品稀释液的制备：
使用10mM的PBS缓冲液稀释吐温20至0.1％的浓度，并添加0.05％的Proclin300，混匀，分装至离心管中。
试剂盒的总装：将多个试剂卡、多管样品稀释液、一份ID卡进行包装。
检测新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体的荧光免疫定量检测方法，包括以下步骤：
1)启动仪器：开启荧光免疫分析仪，仪器进入初始界面；
2)准备：将包装盒内ID卡插入ID卡端口，并点击“读ID”，确认ID卡与检测试剂卡的批号相匹配；
3)加样：用加样枪吸取待测样本(血清、血浆、全血)20μL，加入到一管样品稀释液中，混匀。取80μL混合液至检测卡上的样本孔内；
4)模式选择：根据样本类型，在分析仪上选择样本类型“血清/血浆”或“全血”；选择“即时测试”：检测卡加样15分钟后，立即将试剂卡插入仪器中，点击“测试”按钮，系统将自动检测并显示结果；或选择“标准测试”：试剂卡加样后，立即点击“测试”按钮，并在倒计时1分钟内将试剂卡插入仪器中，系统将继续倒计时，自动检测并显示结果。
5)结果读取：系统继续倒计时，自动检测并显示结果。
实施例2
试剂卡的制备
(1)检测线及质控线的制备：分别配制血管紧张素转化酶2(ACE2)浓度为2.0mg/mL，兔IgG抗体浓度为1mg/mL，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量2μL/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在45℃烘干12小时；
(2)荧光结合垫的制备：荧光结合垫的材质为聚酯膜，经过结合垫预处理液浸泡，置于鼓风干燥箱烘干，使用偶合物稀释液将荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)稀释5倍，荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释20倍，以喷量为2μl/cm,在荧光结合垫上喷涂，放置鼓风干燥箱，在37℃烘干12小时；结合垫预处理液含有Tris缓冲液50mM、酪蛋白1％、蔗糖10％、吐温201％；偶合物稀释液含有Tris缓冲液50mM、酪蛋白3％、蔗糖10％、吐温201％及proclin3000.1％。
(3)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在45℃烘干20小时；
(4)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的相邻端部呈搭接设置，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。
检测线(新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD)荧光偶合物的制备
a)取0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球-羟基基团置于离心管中，加入活化液，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；
b)按0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球-羟基基团加入交联剂EDC和Sulfo-NHS，EDC终浓度0.2％，Sulfo-NHS终浓度0.6％，反应30min，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；
c)按0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球-羟基基团加入100μg的新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD，室温旋转反应120min，然后在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.1％，超声重悬，室温旋转反应100min；在10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入Washing Buffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；
质控线(羊抗兔IgG抗体)荧光偶合物的制备
a)取0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球-羟基基团置于离心管中，加入活化液，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；
b)按0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球-羟基基团加入交联剂EDC和Sulfo-NHS，EDC终浓度0.2％，Sulfo-NHS终浓度0.6％，反应30min，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；
c)按0.1mL Dy镝时间分辨荧光微球加入100μg的兔IgG抗体，室温旋转反应120min，然后在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入WashingBuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到质控线荧光偶合物；
样品稀释液的制备：
使用20mM的PBS缓冲液稀释曲拉通x-100至1％的浓度，并添加0.01％的Proclin300，混匀，分装至离心管中。
对比例(直接竞争法)
该对比例采用直接竞争反应模式，即硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被有新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD，荧光结合垫上有荧光微球标记的血管紧张素转化酶2(ACE2)，该对比例用于与实施例1和实施例2的间接竞争法模式进行对比。
试剂卡的制备
(1)检测线及质控线的制备：分别配制新型冠状病毒(COVID-19)重组蛋白RBD浓度为1.0mg/mL，鸡IgY抗体浓度为0.5mg/mL，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量1.0μL/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在37℃烘干18小时；
(2)荧光结合垫的制备：使用偶合物稀释液将检测线荧光偶合物稀释20倍，质控线荧光偶合物50倍，以喷量为4μl/cm,在荧光结合垫上喷涂，放置鼓风干燥箱，在37℃烘干18小时；
(3)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在50℃烘干18小时；
(4)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，荧光结合垫、样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。
检测线(血管紧张素转化酶2(ACE2))荧光偶合物的制备
a)取0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；
b)按0.1mL Eu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入交联剂EDC和Sulfo-NHS，EDC终浓度0.12％，Sulfo-NHS终浓度0.36％，反应30min，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；
c)按0.1mLEu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入80μg的血管紧张素转化酶2(ACE2)，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入Washing Buffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；
质控线(羊抗鸡IgY抗体)荧光偶合物的制备及样品稀释液的制备均与实施例1中的制备方法相同。该对比例的检测方法也与实施例1中所述的检测方法相同。
测试例1标准曲线制作
配制人源化的中和抗体浓度(购自近岸生物，浓度2.13mg/mL，批号:0332037-4362)为0、0.078、0.17、0.3125、1.25、5、20、40(单位：μg/mL)的样本,分别采用实施例1和对比例的试剂盒及检测方法进行检测，每个浓度的样本重复5次，计算平均值和信号CV。在荧光免疫分析仪中读取荧光信号，以浓度为纵坐标，荧光信号均值为横坐标绘制拟合曲线，得到标准曲线，实施例1的r^2＝0.99903，见图3。对比例的r^2＝0.994，见图4。可见，本发明实施例1的标准曲线线性良好。
测试例2重复性测试
配制人源化的中和抗体(购自近岸生物，浓度2.13mg/mL，批号:0332037-4362)浓度0.17、0.3125、5(单位：μg/mL)的样本,采用实施例1和对比例的试剂盒及检测方法进行检测，每个浓度的样本重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式得出变异系数CV(CV＝SD/M×100％)。结果见表1。
Figure BDA0003035669490000141
Figure BDA0003035669490000151
表1
由表1所示，实施例1中测试不同浓度的样本得到的CV值均在5％以下，优于对比例的CV值，表明本发明检测试剂盒重复性良好。
测试例3临床样本测试
采集已接种新型冠状病毒疫苗人员的EDTA血浆样本30例，与健康人员(未接种新型冠状病毒疫苗)的EDTA血浆样本55例进行对比，同时采用对比试剂盒(南京金斯瑞的SARS-CoV-2Surrogate Virus Neutralization Test Kit；批号：A210104；有效期：2022-01-19)进行对比。分别采用实施例1和对比例的试剂盒及检测方法进行检测，记录反应的信号值。检测系统见表2，检测结果见表3。
统计测试结果，分别进行符合率统计，包括总符合率、阳性符合率、阴性符合率，实施例1的检测结果见表4，对比例1的检测结果见表5。
Figure BDA0003035669490000161
表2
用下列公式计算：
阳性符合率＝A/(A+C)×100％
阴性符合率＝D/(B+D)×100％
总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％
Figure BDA0003035669490000162
Figure BDA0003035669490000171
Figure BDA0003035669490000181
表3
Figure BDA0003035669490000182
表4
阳性符合率＝96.67％(82.78％～99.92％)
阴性符合率＝100.00％(93.51％～100.00％)
总符合率＝98.82％(93.62％～99.97％)
Figure BDA0003035669490000183
表5
阳性符合率＝66.67％(47.19％～82.71％)
阴性符合率＝100.00％(93.51％～100.00％)
总符合率＝88.24％(79.43％～94.21％)
由表4及表5所示，实施例1测试符合率优于对比例。其测试阴性样本和阳性样本梯度更加明显，无灰区。主要是由于本发明试剂盒将人血液中的中和抗体优先与RBD抗原进行结合，使反应更加充分反应，提高灵敏度。而对于阴性样本则无太多影响。
测试例4加速热稳定性试验
将实施例1的试剂盒放入37℃进行加速热稳定性，第0天、第10天、第20天、第30天，分别采用对比例试剂盒与实施例1试剂盒进行重复性测试：配制浓度0.17、0.3125、5(单位：μg/mL)的样本,进行检测，每个样本重复测定10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式得出变异系数CV(CV＝SD/M×100％)。结果见表6：
Figure BDA0003035669490000191
Figure BDA0003035669490000201
表6
结果表明，实施例1在37℃放置30天后，其变异系数CV均在10％以下，与对比例相比，具有更好的重复性。这是因为实施例1采用干式保存荧光偶合物的方式，比液体冷藏至2-8℃更能保存其生物活性。
测试例5稀释倍数调整测试
配制人源化的中和抗体(购自近岸生物，浓度2.13mg/mL，批号:0332037-4362)浓度0.17、0.3125、5(单位：μg/mL)的样本，用实施例1的试剂盒分别对样本进行1：10、1：6、1：3三种稀释比例稀释，每个浓度的样本重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式得出变异系数CV(CV＝SD/M×100％)。结果见表7：
Figure BDA0003035669490000202
Figure BDA0003035669490000211
表7
结果表明，稀释倍数为1：10时最低两个浓度有个别数据无法拉开梯度，灵敏度不够；1：6时CV均在10％以下，三个浓度均能区分开来；1：3时CV偏大，故在此选择1：6为最佳稀释比。
测试例6加样体积调整测试
配制人源化的中和抗体(购自近岸生物，浓度2.13mg/mL，批号:0332037-4362)浓度0.17、0.3125、5(单位：μg/mL)的样本，用实施例1的试剂盒分别采用加样体积为60、80、100(单位：μL)进行加样，每个浓度的样本重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式得出变异系数CV(CV＝SD/M×100％)。结果见表8：
Figure BDA0003035669490000212
Figure BDA0003035669490000221
表8
结果表明，加样体积为60μL和100μL时CV均偏大，故在此选择80μL为最佳加样体积。
测试例7不同判读时间测试
配制人源化的中和抗体(近岸生物，浓度3.14mg/mL，批号)浓度0.17、0.3125、5(单位：μg/mL)的样本，用实施例1的试剂盒分别在反应时间为10、15、20(单位：min)为判读时间进行判读，每个浓度的样本重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式得出变异系数CV(CV＝SD/M×100％)。结果见表9：
Figure BDA0003035669490000222
表9
结果表明，时间为10min时CV偏大，15min和20min结果均能达到要求，但为节约时间，在此选择15min作为最佳判读时间。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡，所述检测卡包括卡壳及设置于所述卡壳中的试纸条，所述试纸条包括样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背衬板，所述样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接粘贴在所述背衬板上，所述荧光结合垫上包含检测线荧光偶合物和质控线荧光偶合物，检测线荧光偶合物为荧光微球标记的重组新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)，所述硝酸纤维素膜上包被有血管紧张素转化酶2(ACE2)构成的检测线,所述硝酸纤维素膜上还包被有IgY、IgG或DNP抗体构成的质控线，所述卡壳上设有加样孔和观察窗。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述质控线荧光偶合物为荧光微球标记的鸡IgY抗体、兔IgG抗体、鼠IgG抗体或DNP抗体中的一种。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测线血管紧张素转化酶2(ACE2)的浓度为0.5-2mg/mL，所述质控线为鸡IgY，或兔IgG抗体或鼠IgG抗体、BSA-DNP中的一种抗体，浓度为0.5-1mg/mL，包被量均为0.5-2μL/cm。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液包括10mM-20mM的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液、浓度为0.1％-1％的表面活性剂和浓度为0.01％-0.05％的防腐剂，所述表面活性剂选自吐温20或曲拉通x-100，所述防腐剂选自proclin300、山梨酸或苯甲酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球表面修饰有氨基、羧基或羟基中至少一种功能基团，所述时间分辨荧光微球内部包埋镧系元素离子，所述镧系元素选自Sm钐、Eu铕、Gd钆、Tb铽、Dy镝中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒还包括ID卡，所述ID卡存储有产品的项目名称、批号等信息。
7.根据权利要求6所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述荧光结合垫的材质为玻璃纤维、无纺布或聚酯膜中的至少一种，所述材质经过结合垫预处理液浸泡，置于鼓风干燥箱烘干，再采用偶合物稀释液将荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)和荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释，荧光微球标记的新型冠状病毒棘突糖蛋白(RBD)稀释5-20倍，荧光微球标记的鸡IgY多克隆抗体稀释20-200倍，稀释并混合后，均匀喷涂至已处理的材质上，置于鼓风干燥箱烘干。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫预处理液含有缓冲液、保护蛋白、糖类、表面活性剂；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或Tris缓冲液中至少一种，浓度为10mM-50mM；所述保护蛋白选自牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的至少一种，浓度为0.1％-3％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，浓度为0.1％-10％；所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、S16、S9中的至少一种，浓度为0.1％-1％。
9.根据权利要求7所述的新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述偶合物稀释液含有缓冲液、保护蛋白、糖类、表面活性剂、防腐剂；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或Tris缓冲液中至少一种，浓度为10mM-50mM；所述保护蛋白选自牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的至少一种，浓度为0.1％-3％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，浓度为0.1％-10％。所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、S16、S9中的至少一种，浓度为0.1％-1％；所述防腐剂选自山梨酸、苯甲酸或proclin300中的至少一种，浓度为0.01％-0.1％。
10.一种用于检测新型冠状病毒(COVID-19)中和抗体的荧光免疫定性检测方法，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
1)启动仪器：开启荧光免疫分析仪，仪器进入初始界面；
2)准备：将包装盒内ID卡插入ID卡端口，并点击“读ID”，确认ID卡与检测试剂卡的批号相匹配；
3)加样：用加样枪吸取待测样本(血清、血浆、全血)20μL，加入到一管样品稀释液中，混匀。取80μL混合液至检测卡上的样本孔内；
4)模式选择：根据样本类型，在分析仪上选择样本类型“血清/血浆”或“全血”；选择“即时测试”：检测卡加样15分钟后，立即将试剂卡插入仪器中，点击“测试”按钮，系统将自动检测并显示结果；或选择“标准测试”：试剂卡加样后，立即点击“测试”按钮，并在倒计时1分钟内将试剂卡插入仪器中，系统将继续倒计时，自动检测并显示结果。
5)结果读取：系统继续倒计时，自动检测并显示结果。
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