CN113740534A - 新型冠状病毒中和抗体检测卡及制备方法 - Google Patents

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胡飞
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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测卡，包括PVC衬垫以及设置于所述PVC衬垫上表面、依次连接的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中，荧光垫上设有荧光微球标记的新型冠状病毒重组蛋白和荧光微球标记的独立质控系统，所述独立质控系统为血蓝蛋白；硝酸纤维素膜上设置有检测区和质控区，检测区包被有ACE2蛋白，质控区包被有抗血蓝蛋白抗体；独立质控系统的血蓝蛋白和质控区的抗血蓝蛋白抗体可进行互换。本发明所提供的检测卡，其质控区的检测结果不受检测区检测物质影响，检测区检测结果与质控区无交叉影响，可以使新型冠状病毒中和抗体的检测结果更为准确、重复性更佳。

Description

新型冠状病毒中和抗体检测卡及制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测卡及制备方法。
背景技术
新型冠状病毒，也称 2019-nCoV，是一种可导致呼吸系统疾病的病毒。此病毒可引起炎症及肺部气道内粘液和体液积聚（肺炎）。冠状病毒有多种类型，大多数类型仅感染动物，但有时会发生变异并感染人类。
新型冠状病毒肺炎疫情已成为全球性重大的公共卫生事件，多位专家认为，全球新冠流行的最终控制，要依赖新冠疫苗接种及机体产生对新冠病毒具有高效免疫力的抗体——中和抗体。
而目前，检测中和抗体的黄金试验标准，要求在生物安全三级防护实验室里处理新冠活病毒，而且非常耗时，通常要2天到4天才能完成。基于假病毒的病毒中和试验，被认为是另一种检测中和抗体的方法，其可以在生物安全二级实验室操作，但仍需使用活病毒和细胞。目前也有采用基于免疫层析技术的检测卡检测方式，其质控区（C）包被羊抗鼠抗体，因样本中HAMA（人抗鼠抗体）的影响，导致不同样本测试时C线测试值偏差较大，T/C干扰严重，且与C线结合的荧光微球标记的2019-nCoV Spike Protein（RBD）为未与ACE2结合的剩余部分，会造成双倍干扰，从而导致重复性变差。
为了更好地监测感染率、群体免疫和保护性免疫，以及评价临床试验期间和大规模接种后的疫苗效力，亟须一种能稳定可靠的检测新冠病毒中和抗体的快速试验。
发明内容
本发明提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测卡及制备方法，以解决现有技术中检测中和抗体耗时长、操作复杂且不适于大规模检测的问题，同时克服检测结果偏差大、不准确的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型冠状病毒中和抗体检测卡，包括PVC衬垫以及设置于所述PVC衬垫上的、依次连接的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中，所述荧光垫上设有荧光微球标记的新型冠状病毒重组蛋白和荧光微球标记的独立质控系统，所述独立质控系统为血蓝蛋白；所述硝酸纤维素膜上设置有检测区和质控区，所述检测区包被有ACE2蛋白，所述质控区包被有抗血蓝蛋白抗体；所述独立质控系统的血蓝蛋白和所述质控区的抗血蓝蛋白抗体可进行互换。所述新型冠状病毒重组蛋白为S蛋白受体结合域。
作为优选方案，所述硝酸纤维素膜贴合于所述PVC衬垫的中间部位，所述荧光垫和吸水垫分别搭接于所述硝酸纤维素膜两端的上表面，所述样品垫搭接于所述荧光垫的上表面，搭接重叠部分均设置在1-3mm。
作为优选方案，所述荧光微球的固含量为0.1%-5%，粒径为100-300nm。
作为优选方案，所述PVC衬垫的宽度设置为3-5mm。
本发明进一步提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：荧光垫和样品垫制备，将玻璃纤维或聚酯膜进行预处理并烘干待用；
步骤二：荧光标记新型冠状病毒重组蛋白；
步骤三：荧光标记独立质控系统；
步骤四：将步骤二荧光标记的新型冠状病毒重组蛋白和步骤三荧光标记的独立质控系统按照1:1的比例混匀得到荧光标记物，待用；
步骤五：将步骤四的所述荧光标记物喷涂于所述荧光垫上；
步骤六：将抗血蓝蛋白抗体和ACE2蛋白分别进行稀释后包被于硝酸纤维素膜上，分别形成质控区和检测区；
步骤七：将步骤六形成的硝酸纤维塑膜贴于PVC衬板的中间，步骤五形成的荧光垫搭接于所述硝酸纤维塑膜的一端，将步骤一形成的样品垫搭接于所述荧光垫远离硝酸纤维塑膜的一端，将吸水垫搭接于所述硝酸纤维塑膜的另一端；
步骤八：试纸条切割。
其中，步骤二中，荧光标记新型冠状病毒重组蛋白包括以下流程：
流程一：微球清洗，取100ul荧光微球加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用；
流程二：微球活化，加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于流程一溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
流程三：微球偶联，于流程二溶液中加入新型冠状病毒重组蛋白200-500ug，室温反应1h；
流程四：封闭，于流程三溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清；
流程五：复溶，于流程四溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
其中，步骤三中，荧光标记独立质控系统包括以下流程：
流程一：微球清洗，取100ul荧光微球加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用；
流程二：微球活化，加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于流程一溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
流程三：微球偶联，于流程二溶液中加入血蓝蛋白 200-500ug，室温反应1h；
流程四：封闭，于流程三溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清；
流程五：复溶，于流程四溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
作为优选方案，步骤五中，所述荧光标记物喷涂于所述荧光垫上，喷涂量为3-8ul/cm。
作为优选方案，步骤六中，所述抗血蓝蛋白抗体和ACE2蛋白分别使用包被液进行稀释，所述抗血蓝蛋白抗体稀释至0.3-1.0mg/ml，所述ACE2蛋白稀释至0.8-1.2mg/ml。
本发明进一步提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括以上所涉及的新型冠状病毒中和抗体检测卡以及样本稀释液，所述样本稀释液包括：pH值为8.0-9.5的Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.1%-1%的BSA、0.1%-0.5%的Proclin300。
本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明采用独立质控系统，通过在荧光垫标记血蓝蛋白/抗血蓝蛋白抗体，质控区包被抗血蓝蛋白抗体/血蓝蛋白，质控区的检测结果为血蓝蛋白和抗血蓝蛋白抗体结合的独立质控体系，其检测结果不受检测区检测物质影响，检测区检测结果与质控区无交叉影响，可以使新型冠状病毒中和抗体的检测结果更为准确、重复性更佳，同时质控区内所呈现的荧光物质聚集也是判断是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也可作为新冠病毒中和抗体检测卡的内控标准。
附图说明
图1为本发明检测卡与传统技术检测卡的测试结果反应模型；
图2为本发明检测卡的前视图；
图3为本发明所提供的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒准确度分析，与ELISA方法的相关性分析。
图中1.独立质控系统检测卡—阳性结果，2. 独立质控系统检测卡—阴性结果，3.传统检测卡-阴性结果，4.荧光微球，5.S蛋白受体结合域（RBD），6.血蓝蛋白，7. ACE2蛋白，8.抗血蓝蛋白抗体，9.新冠病毒中和抗体，10. 羊抗鼠抗体，11.干扰物，12. PVC衬垫，13.样品垫，14.荧光垫，15.硝酸纤维素膜，16.吸水垫，17.质控区，18.检测区。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域普通技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
如图1和图2所示，本发明公开了一种新冠病毒中和抗体检测卡，包括PVC衬垫12以及设置于PVC衬垫12上表面的、且依次连接的样品垫13、荧光垫14、硝酸纤维素膜15以及吸水垫16，具体的，硝酸纤维素膜15贴合于PVC衬垫12的中间部位，荧光垫14和吸水垫16分别搭接于硝酸纤维素膜15两端的上表面，所述样品垫13搭接于荧光垫14的上表面，搭接重叠部分均设置在1-3mm，该设置使得样品垫13和荧光垫14接触充分，保障层析过程的同时，控制样本以合适的速度从样品垫13传送到荧光垫14，从而控制层析过程，达到均匀的层析效果。其中，样品垫13用于承载样品及样品缓冲液，荧光垫14用于承载荧光微球4标记蛋白后的复合物，样品垫13和荧光垫14的材质可采用玻璃纤维或聚酯膜，使用该材质可保障样本吸收和释放能力，减小样品垫13和荧光垫14对样本中蛋白质的非特异性吸附，硝酸纤维素膜15用于包被质控区（C）17及检测区（T）18，吸水垫16用于提供侧向层析动力，PVC衬垫12用于连接其上表面各组成成分并提供支撑，宽度设置在3-5mm，该宽度设置确保提供充足的废液回收能力和回收动力。
具体的，荧光垫14上喷涂有荧光微球4标记的新型冠状病毒重组蛋白和荧光微球4标记的独立质控系统，新型冠状病毒重组蛋白为S蛋白受体结合域（Receptor bindingdomain，RBD）5，独立质控系统为血蓝蛋白或抗血蓝蛋白抗体；荧光微球4的固含量为0.1%-5%，优选为1%，粒径为100-300nm。硝酸纤维素膜15上设有检测区18和质控区17，检测区18包被有ACE2蛋白7，质控区17包被有抗血蓝蛋白抗体或血蓝蛋白；独立质控系统的标记物和质控区17的包被物可互换，即当独立质控系统标记为血蓝蛋白时，质控区17包被抗血蓝蛋白抗体，当独立质控系统标记为抗血蓝蛋白抗体时，质控区17包被血蓝蛋白。
本发明所提供的新冠病毒中和抗体检测卡的检测原理如下：所述检测卡采用免疫层析技术及竞争法的原理检测人血清、血浆及全血中的新型冠状病毒中和抗体。检测卡上含有预先包被在荧光垫14上的荧光微球4标记的RBD5及荧光微球4标记的抗血蓝蛋白抗体，以及固定于硝酸纤维素膜15上检测区18的ACE2蛋白7和质控区17的血蓝蛋白。测试时，当样本中不含有新冠病毒中和抗体9或含量低于最低检出限时，预先包被在荧光垫14上的荧光微球4标记的 RBD5 在毛细效应下向上移行，直接与检测区18包被的 ACE2蛋白7结合，且预先包被在荧光垫14上的荧光微球4标记的抗血蓝蛋白抗体直接与质控区17包被的血蓝蛋白结合，此时T/C趋于一个稳定比例；当样本中含有新冠病毒中和抗体9时，样本中的新冠病毒中和抗体9与预先包被在荧光垫14上的荧光微球4标记的 RBD5 结合，从而阻断了 RBD5与ACE2蛋白7 的结合，而预先包被在荧光垫14上的荧光微球4标记的抗血蓝蛋白抗体直接与质控区17包被的血蓝蛋白结合，因血蓝蛋白属于节肢动物和软体动物血淋巴中的特有蛋白，不会对人体样本有干扰，质控区17测试结果不变，T/C值变小。因此样本中新冠病毒中和抗体9的含量与T/C值成反比。
本发明所公开的新冠病毒中和抗体检测卡的评价计算方式为检测区18测试结果除以质控区17测试结果，即T/C，质控区17检测结果为血蓝蛋白和抗血蓝蛋白抗体结合的独立质控体系，其检测结果不受检测区18检测物质影响，检测区18检测结果与质控区17无交叉影响，不受质控区17检测结果影响。本发明通过引入独立质控系统，质控区17和检测区18的免疫反应是非同源的，相互独立的，可以避免两者间的相互影响，质控区17通过单独标记及包被并参与结果计算，可以使新型冠状病毒中和抗体的检测更为准确，避免了传统的检测卡中通过在质控区包被羊抗鼠抗体10，由于样本中HAMA（人抗鼠抗体）的影响，导致不同样本测试时出现干扰物11，导致C线测试值偏差较大。同时，质控区17内所呈现的荧光物质聚集也是判断是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也可作为新冠病毒中和抗体检测卡的内控标准。
本发明进一步公开了一种新冠病毒中和抗体检测卡的制备方法，下面将结合实施例对该制备方法进行详细的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限定。
实施例一
本实施例所提供的新冠病毒中和抗体检测卡的制备方法包括以下步骤：
步骤一，溶液配制，按质量浓度计：
样品垫处理液包含：0.01MOL/L PBS、 pH值为6.0-8.0，0.1%-1%蔗糖，0.1%-1%BSA，0.1%-0.5% Tween-20；
荧光垫处理液包含：0.01MOL/L PBS、pH值为6.0-8.0，0.5%-5%蔗糖；
包被液包含：0.01MOL/L PBS、pH值为6.0-8.0，0.5%-5%蔗糖或海藻糖；
偶联液包含：0.01 -0.1MOL/L、pH值为5.5-8.0的多种缓冲体系的缓冲液；
复溶液包含：缓冲液、0.05%-0.5%BSA、0.5%-5%蔗糖、0.5%-5%海藻糖；
以上可用于缓冲体系的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液、HEPES缓冲液。
步骤二，荧光垫14制备：将玻璃纤维或聚酯膜使用荧光垫处理液预处理并进行烘干待用。
步骤三，样品垫13制备：将玻璃纤维或聚酯膜用样品垫处理液预处理并进行烘干待用。
步骤四，荧光标记：
1．荧光微球4标记的新型冠状病毒重组蛋白：
（1）微球清洗：取100ul荧光微球4加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用，活化液的组分包含缓冲液及质量浓度为0.05%-0.2% Tween-20；
（2）微球活化：加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于（1）溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
（3）微球偶联：于（2）溶液中加入新型冠状病毒重组蛋白200-500ug，室温反应1h；
（4）封闭：于（3）溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清，封闭液的组分包含质量浓度为10%的BSA或10%的酪蛋白钠；
（5）复溶：于（4）溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
2．荧光微球4标记的独立质控系统：
（1）微球清洗：取100ul荧光微球4加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用，活化液的组分包含缓冲液及质量浓度为0.05%-0.2% Tween-20；
（2）微球活化：加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于（1）溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
（3）微球偶联：于（2）溶液中加入血蓝蛋白 200-500ug，室温反应1h；
（4）封闭：于（3）溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清，封闭液的组分包含质量浓度为10%的BSA或10%的酪蛋白钠；
（5）复溶：于（4）溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
3．将制备的荧光微球4标记的新型冠状病毒重组蛋白与荧光微球4标记的独立质控系统按照1:1的比例进行混合，得到荧光标记物，待用。
步骤五，喷球：混匀后的荧光标记物喷涂于已进行预处理的荧光垫14上，喷涂量为3-8ul/cm。
步骤六，抗体包被：将抗血蓝蛋白抗体使用包被液稀释至0.3-1.0mg/ml，将ACE2蛋白7使用包被液稀释至0.8－1.2mg/ml，并将抗血蓝蛋白抗体包被在硝酸纤维素膜15的上端形成质控区17，ACE2蛋白7包被到硝酸纤维素膜15的下端形成检测区18。
步骤七，组装：组装时将PVC衬板12的衬纸去除，将硝酸纤维素膜15贴合在PVC衬板12的中间，步骤五形成的荧光垫14搭接于硝酸纤维素膜15靠近检测区18的一端，将步骤三形成的样品垫13搭接于荧光垫14远离硝酸纤维素膜15的一端，将吸水垫16搭接于硝酸纤维素膜15靠近质控区17的一端，搭接重叠部分均控制在1-3mm。
步骤八，切条装载：组装完成的PVC衬板12使用斩切机切割成3-5mm宽度的试纸条，并将试纸条装载到相应的卡塞内，获得检测卡成品。
实施例二
下面将结合另一实施例对本发明所提供的技术方案进行详细的说明，本实施例所提供的新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法中，不包含荧光标记的独立质控系统的制备，该实施例作为对比例，评估检测结果。
步骤一，溶液配制，按质量浓度计：
样品垫处理液包含：0.01MOL/L PBS、 pH值为6.0-8.0，0.1%-1%蔗糖，0.1%-1%BSA，0.1-0.5% Tween-20；
荧光垫处理液包含：0.01MOL/L PBS、pH值为6.0-8.0，0.5%-5%蔗糖；
包被液包含：0.01MOL/L PBS、pH值为6.0-8.0，0.5%-5%蔗糖或海藻糖；
偶联液包含：0.01 -0.1MOL/L、pH值为5.5-8.0的多种缓冲体系的缓冲液；
复溶液包含：缓冲液、0.05%-0.5%BSA、0.5%-5%蔗糖、0.5%-5%海藻糖；
以上可用于缓冲体系的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液、HEPES缓冲液。
步骤二，荧光垫14制备：将玻璃纤维或聚酯膜使用荧光垫处理液预处理并进行烘干待用。
步骤三，样品垫13制备：将玻璃纤维或聚酯膜用样品垫处理液预处理并进行烘干待用。
步骤四，荧光标记新型冠状病毒重组蛋白：
（1）微球清洗：取100ul荧光微球4加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用，活化液的组分包含缓冲液及质量浓度为0.05%-0.2% Tween-20；
（2）微球活化：加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于（1）溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
（3）微球偶联：于（2）溶液中加入新型冠状病毒重组蛋白200-500ug，室温反应1h；
（4）封闭：于（3）溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清，封闭液的组分包含质量浓度为10%的BSA或10%的酪蛋白钠；
（5）复溶：于（4）溶液中加入3-5ml复溶液复溶；
（6）喷球：将荧光标记的新型冠状病毒重组蛋白喷涂于已进行预处理的荧光垫14上，喷涂量为3-8ul/cm。
步骤五，抗体包被：将羊抗鼠抗体10使用包被液稀释至0.3-1.0mg/ml，将ACE2蛋白7使用包被液稀释至0.8－1.2mg/ml，并将羊抗鼠抗体10包被在硝酸纤维素膜15的上端形成质控区17，ACE2蛋白7包被在硝酸纤维素膜15的下端形成检测区18。
步骤六，组装：组装时将PVC衬板12的衬纸去除，将硝酸纤维素膜15贴合在PVC衬板12的中间，步骤四形成的荧光垫14搭接于硝酸纤维素膜15靠近检测区18的一端，将步骤三形成的样品垫13搭接于荧光垫14远离硝酸纤维素膜15的一端，将吸水垫16搭接于硝酸纤维素膜15靠近质控区17的一端，搭接重叠部分均控制在1-3mm。
步骤七，切条装载：组装完成的PVC衬板12使用斩切机切割成3-5mm宽度的试纸条，并将试纸条装载到相应的卡塞内，获得检测卡成品。
将实施例一和实施例二制备的新型冠状病毒中和抗体的检测试剂盒准确度及重复性对比检测。
1、适用仪器：荧光免疫定量分析仪。
2、待测样本：临床标准方法收集的血清或血浆40例，其中10例未注射新型冠状病毒疫苗，30例注射新型冠状病毒疫苗后14-28天，2-8℃可稳定保存一周。
3、检测方案：
3.1准确度：分别用实施例一和实施例二制备的检测试剂盒检测40例临床样本，并与ELISA方法（酶联免疫吸附测定）进行对比，计算与ELISA方法的阴阳符合率及相关性分析。
3.2 重复性：每个样本重复测定10次，计算CV。
4、检测结果：
4.1 准确度检测相关结果如表1、表2以及附图3所示：
表1 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒准确度检测结果
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表2 与ELISA方法的阴阳符合率分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从检测及分析结果可以看出，使用独立质控系统产品与ELISA对比，独立质控系统符合率及相关性均较好。
4.2 重复性检测结果如表3所示：
表3 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒重复性检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3检测结果显示，使用独立质控系统重复性可控制在10%以内，非独立质控系统CV较大，特别是低值区域，CV达到近20%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (12)

1.一种新型冠状病毒中和抗体检测卡，其特征在于，包括PVC衬垫以及设置于所述PVC衬垫上的、依次连接的样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；
其中，所述荧光垫上设有荧光微球标记的新型冠状病毒重组蛋白和荧光微球标记的独立质控系统，所述独立质控系统为血蓝蛋白；
所述硝酸纤维素膜上设置有检测区和质控区，所述检测区包被有ACE2蛋白，所述质控区包被有抗血蓝蛋白抗体；
所述独立质控系统的血蓝蛋白和所述质控区的抗血蓝蛋白抗体可进行互换。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡，其特征在于，所述新型冠状病毒重组蛋白为S蛋白受体结合域。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜贴合于所述PVC衬垫的中间部位，所述荧光垫和吸水垫分别搭接于所述硝酸纤维素膜两端的上表面，所述样品垫搭接于所述荧光垫的上表面，搭接重叠部分均设置在1-3mm。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡，其特征在于，所述荧光微球的固含量为0.1%-5%，粒径为100-300nm。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡，其特征在于，所述PVC衬垫的宽度设置为3-5mm。
6.一种新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：荧光垫和样品垫制备，将玻璃纤维或聚酯膜进行预处理并烘干待用；
步骤二：荧光标记新型冠状病毒重组蛋白；
步骤三：荧光标记独立质控系统；
步骤四：将步骤二荧光标记的新型冠状病毒重组蛋白和步骤三荧光标记的独立质控系统按照1:1的比例混匀得到荧光标记物，待用；
步骤五：将步骤四的所述荧光标记物喷涂于所述荧光垫上；
步骤六：将抗血蓝蛋白抗体和ACE2蛋白分别进行稀释后包被于硝酸纤维素膜上，分别形成质控区和检测区；
步骤七：将步骤六形成的硝酸纤维塑膜贴于PVC衬板的中间，步骤五形成的荧光垫搭接于所述硝酸纤维塑膜的一端，将步骤一形成的样品垫搭接于所述荧光垫远离硝酸纤维塑膜的一端，将吸水垫搭接于所述硝酸纤维塑膜的另一端；
步骤八：试纸条切割。
7.根据权利要求6所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，荧光标记新型冠状病毒重组蛋白包括以下流程：
流程一：微球清洗，取100ul荧光微球加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用；
流程二：微球活化，加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于流程一溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
流程三：微球偶联，于流程二溶液中加入新型冠状病毒重组蛋白200-500ug，室温反应1h；
流程四：封闭，于流程三溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清；
流程五：复溶，于流程四溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
8.根据权利要求6所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，荧光标记独立质控系统包括以下流程：
流程一：微球清洗，取100ul荧光微球加入900ul活化液，用移液器吹打混匀，离心弃上清，加入1ml活化液备用；
流程二：微球活化，加入2.5ul EDC及2.5ul NHS于流程一溶液中，室温活化15min，离心弃上清，加入1ml偶联液备用；
流程三：微球偶联，于流程二溶液中加入血蓝蛋白 200-500ug，室温反应1h；
流程四：封闭，于流程三溶液中加入100ul封闭液，室温反应1h，离心弃上清；
流程五：复溶，于流程四溶液中加入3-5ml复溶液复溶。
9.根据权利要求6所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述荧光标记物喷涂于所述荧光垫上，喷涂量为3-8ul/cm。
10.根据权利要求6所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述抗血蓝蛋白抗体和ACE2蛋白分别使用包被液进行稀释，所述抗血蓝蛋白抗体稀释至0.3-1.0mg/ml，所述ACE2蛋白稀释至0.8-1.2mg/ml。
11.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒中和抗体检测卡。
12.根据权利要求11所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液包括：pH值为8.0-9.5的Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.1%-1%的BSA、0.1%-0.5%的Proclin300。
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