JP4800739B2

JP4800739B2 - アッセイ用媒体及びアッセイ方法

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Publication number: JP4800739B2
Application number: JP2005305865A
Authority: JP
Inventors: 昭策元田
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2005-10-20
Filing date: 2005-10-20
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2025-10-20
Also published as: JP2007114049A

Description

本発明は、免疫測定等に用いられるアッセイ用媒体及びそれを用いるアッセイ方法に関する。

近年、ウイルスや細菌等の病原体の感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。

現在、簡易検査方法として、抗原抗体反応を利用したメンブランアッセイ法、特に、ニトロセルロース等のメンブランを用いたアッセイ法が一般に知られており、フロースルー式アッセイ法とラテラルフロー式アッセイ法に大別される。前者は、被検出物を含む溶液をメンブランに対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。いずれの場合も被検出物に特異的に結合する捕捉物質、および被検出物に特異的に結合する標識体の複合体を固相上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。

しかし、メンブランアッセイ法による簡易検査方法では、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる非特異的反応による偽陽性が生じることがある。病原体の感染を検査する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因の特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。

この問題を解決するための従来技術として、特許文献１には、塩基性アミノ酸又はアミノ糖を含む移動相で展開させることにより偽陽性を抑えるイムノクロマトグラフィー装置が記載されている。また、特許文献２には、フロースルー式検査法において、塩基性アミノ酸、無機塩類、界面活性剤等を含む緩衝液を用いて偽陽性を抑える方法が記載されている。しかしながらこれらの従来法では、偽陽性反応は抑えられるものの、検出感度が低下してしまうという問題が生じていた。

特開２００１−２８９８５２特開２００３−２７９５７７

従って、本願発明の目的は、医療現場で行なわれる簡易アッセイ等のアッセイにおいて、非特異的反応による偽陽性を抑え、同時に検出感度を上げて、検体試料に含まれる被検出物を特異的反応によって高感度に検出する手段を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、塩基性のアミノ酸の一つであるアルギニンの水溶液は、非特異反応物質がメンブレン等の固相や固相上の捕捉物質に付着するのを抑制する効果を有すると同時に、他の無機塩類等を用いることなく単独で十分な緩衝効果を発揮し得るため、アッセイの場でアルギニンの水溶液を用いると、緩衝効果は有するが検出感度を低下させる要因となるような他の成分を減少させることができるので、非特異反応物による偽陽性の発生を抑え、同時に検出感度が上がることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本願発明は、固相に不動化され、検体中の測定すべき被検出物と特異的に反応する捕捉物質と、検体中の被検出物とを反応させ、必要に応じて洗浄した後、前記被検出物と特異的に反応する標識体を反応させ、必要に応じて洗浄した後、固相に捕捉された該標識体を測定することにより、固相に捕捉された前記被検出物を測定するイムノアッセイにおいて、前記捕捉物質と前記被検出物の反応の媒体、前記被検出物と前記標識体との反応の媒体、及び前記いずれかの洗浄に用いる洗浄液の少なくともいずれかとして、アルギニン濃度が0.02〜1.5Mであり、pHが7.0〜9.5であり、アルギニン以外に緩衝剤を含まないイムノアッセイ用媒体を用いる、イムノアッセイ方法を提供する。

本願発明によれば、非特異反応による偽陽性を抑えることができると共に、従来比重、粘度や浸透圧が上昇するため低下していた検出感度を上げることができるため、特に医療現場で行なう簡易アッセイで、検体中の被検出物を高感度に精度良く検出することができる。

本発明の方法に用いられるアッセイ用媒体（以下、「本発明のアッセイ用媒体」）は、固相に不動化した捕捉物質を用いたイムノアッセイやレセプターアッセイに特に好適に用いられる。アッセイにおいては、例えば、フロースルー方式では、被検出物と捕捉物質を特異反応させて、後にその被検出物と捕捉物質の複合体に標識体を反応させる方法と、被検出物と標識体を特異反応させて、後にその被検出物と標識体の複合体を捕捉物質と特異反応させる方法がある。いずれの方法においても、前記の反応を行なった後に、必要に応じて未反応物を除くための洗浄が行なわれる。本発明のアッセイ用媒体は、以上のような反応を行う際の媒体、具体的には被検出物を含み得る検体試料を浮遊させて希釈及び／又は抽出するための媒体あるいは標識体液を調製するための媒体としてや、前記の洗浄の際の洗浄液として用いるものである。更に、標識体として酵素標識体を用いる場合には、本発明のアッセイ用媒体はその際の基質液の希釈にも用いることができる。また、ラテラルフロー方式においても同様に用いることができる。フロースルー方式及びラテラルフロー方式のアッセイで本発明のアッセイ用媒体を用いる場合の具体的な手順の一例は後述する。

本発明のアッセイ用媒体は、アルギニン以外に緩衝剤を実質的に含まないアッセイ用媒体である。ここで、「実質的に含まない」とは、アルギニン以外の緩衝剤を全く含まないか、含むとしてもそれ自体では緩衝作用を十分には発揮できない程度の低い濃度でしか含まないということを意味する。本発明でいうアルギニンとは、塩基性アミノ酸の一つであり、単体の化学構造式としては、ＮＨ_２−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯＯＨで表されるものである。アルギニンの他にも、リジン、グルタミン等の塩基性のアミノ酸はあるが、非特異反応を抑える効果の点で、アルギニンと同等の効果は得られない。又、アルギニンはＬ型、ＤＬ型及びＤ型のいずれの光学異性体であっても良い。

本発明のアッセイ用媒体のアルギニンの濃度は、前記のように０．０２〜１．５Ｍであって、好ましくは０．０５〜１．０Ｍ、更に好ましくは０．０５〜０．５Ｍである。アルギニン濃度が上がるにつれ、前記のアッセイにおいての反応の場で、非特異性の反応を抑える効果も上がるが、逆に検出感度が低下し１．５Ｍを越えると大幅に低下する。また、必要に応じてアルギニンの濃度を選択するのがより効果的であり、後述する通り、標識体の希釈に用いる場合は０．０５〜０．５Ｍの範囲が好ましく、洗浄液として用いる場合には０．０２〜１．０Ｍの範囲が好ましい。更に、後述する酵素標識体に対する基質液の希釈に用いる場合は、酵素反応に適した生理的等張条件付近の０．０５〜０．２Ｍの範囲が好ましい。ただし、これらに限定されるものではない。

本発明のアッセイ用媒体のｐＨは、生体から抽出した検体試料の変質を抑制する意味で、７．０〜９．５の範囲とする必要があり、好ましくは７．５〜９．０である。ｐＨが７．０未満では緩衝効果が弱く検体試料の変質が起こり易く、又９．５を超えるとアルカリ性が強すぎるために検体試料の変質が起こる。但し、本発明のアッセイ用媒体を基質液の調製に用いる場合は、これに限定されず、後述するように酵素反応に好適なpHとなるよう前記の範囲外に設定し得る。

本発明のアッセイ用媒体を得る方法は、アルギニンの濃度が０．０２〜１．５Ｍであり、そのｐＨが７．０〜９．５の媒体が得られるものであれば特に限定されるものではなく、アルギニン水溶液を塩酸などの酸で滴定してアルギニン濃度及びｐＨを調整する方法、アルギニン無機酸塩の水溶液をアルカリ金属水酸化物などの塩基で滴定してアルギニン濃度及びｐＨを調整する方法などが挙げられる。アルギニン自体は水に対する溶解性が低く、１Ｍ程度までしか溶解しないが、一方でアルギニン無機酸塩、例えばアルギニン塩酸塩は１．５Ｍ程度まで溶解する。従って、アルギニン濃度の高いアッセイ用媒体を得る場合は、前記の方法のうち後者の方が有利である。なお、後者の方法によると、pH調整の過程でアルカリ金属塩が生成することとなる。例えば、アルギニン塩酸塩を水酸化ナトリウムで滴定する方法の場合、塩化ナトリウムが生成する。本発明のアッセイ用媒体には塩化ナトリウム等のアルカリ金属塩化物を包含するアルカリ金属塩が含まれてもよい。ただし、塩化ナトリウムや塩化カリウム等のアルカリ金属塩化物は、従来の緩衝液中にも偽陽性を抑える目的で例えば１．５Ｍ等の高濃度で含まれており、これが逆に特異反応の感度を低下させ偽陰性を生じる原因ともなっていることがわかってきた。そのため、本発明のアッセイ用媒体は、塩化ナトリウム等のアルカリ金属塩化物の濃度が好ましくは０．２Ｍ以下である。

本発明のアッセイ用媒体は、被検出物以外の成分が例えばメンブラン等の固相自体や固相上の捕捉物質に付着するのを抑制する効果を有し、かつ緩衝性を有するものであるが、その使用の目的に合わせて、従来から用いられている界面活性剤、安定剤、防腐剤、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を添加して用いることができる。それらの添加量としては、前記の捕捉物質等への付着を抑制する効果をより高める点で、界面活性剤は０．２〜５（ｗ/ｖ％）、血清蛋白質は０．０５〜４（ｗ/ｖ％）の範囲であることが好ましい。

前記の安定剤としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、シルククゼイン等が挙げられるが、これらに限定されない。

前記の防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、isothiazolinone類のケーソンＣＧ（商品名）等が挙げられるが、これらに限定されない。

前記の界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０：ノニデットＰ−４０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、ＣＨＡＰＳ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。

本発明のアッセイ用媒体を用いるアッセイで検査する各種の抗原やウイルス等の被検出物は、該被検出物と特異結合する抗体が得られるものであれば何ら限定されるものではない。被検出物の例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。

検体は、例えば患者の咽頭あるいは鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取するか、または鼻腔吸引液等を用いることができるが、これに限定されない。得られた検体は、本発明のアッセイ用媒体を用いた検体浮遊用媒体に浮遊させて、被検出物を希釈し及び／又は抽出して検体試料とし、アッセイに用いる。該検体試料は、好ましくは濾過フィルターを用いて濾過される。濾過フィルターの孔径（直径）または保留粒子径は、０．１〜０．６μｍである。孔径あるいは保留粒子径が大きすぎると被検出物以外の夾雑成分がメンブラン上に非特異的に結合して偽陽性を示す場合がある。逆に小さすぎると検体試料中に存在する粘性物や凝集物のためにフィルター自身が詰まってしまい濾過が不可能であるか、あるいはフィルター面積をかなり広くしなければならず、簡易検査方法に用いるという目的からみて不適切である。濾過フィルターの材質は、特に限定されないが、好ましくはガラス繊維又はニトロセルロースである。

該濾過フィルターは、検体試料用濾過チューブの先端に取り付けて使用されることが好ましい。すなわち、濾過チューブ中に検体浮遊用媒体に浮遊させた検体をいれて、先端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をアッセイ装置中のメンブランに滴下する方法が簡便であり、好ましい。この濾過チューブの一実施態様の模式図を図４及び図５に示す。濾過チューブは例えば図４に記載されるように先端部ｄと本体部ｅからなる形状であり、先端部の内部に図５に示されるように濾過フィルターｆが備えつけられている。本体部ｅに検体浮遊用緩衝液に浮遊させた検体試料を入れ、本体部ｅに濾過フィルターｆを備えた先端部ｄを取り付ける。濾過フィルターｆを通して検体試料を濾過し、濾液をアッセイ装置のメンブレンに滴下する。本体部ｅがポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィルターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料を濾過することができるため、好ましい。

被検出物を捕捉するための捕捉物質は、被検出物と特異的に結合して、被検出物と捕捉物質の複合体を形成することのできる物質であり、被検出物に応じて使用する捕捉物質は異なる。そのような捕捉物質の例としては、被検出物に対する抗体及びその抗原結合性断片が包含される。なお、ここで、「抗原結合性断片」とは、抗体のF(ab)断片やF(ab')₂断片等のように、抗原である被検出物と抗原抗体反応が可能な断片のことを言う。被検出物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、捕捉物質は好ましくは抗体又は抗原結合性断片であるが、これに限定されない。

これらの捕捉物質は、固相に結合させてアッセイに用いる。固相に結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または、化学的な結合によるものであってもよい。固相としてメンブランを用いる場合、捕捉物質が結合したメンブランを調製する方法は、特に限定されるものではないが、例えば捕捉物質を緩衝液等で希釈した溶液をメンブランに塗布して、その後、乾燥することにより行われる。メンブランの材質としては、不織布、紙、ニトロセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ナイロン６，６及びセルロースエステルとニトロセルロースの混合物からなる群が挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質があげられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブランの孔径あるいは保留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上であり、かつ３〜１２μｍであることが好ましく、３〜５μｍが特に好ましい。また、メンブランの厚さは特に限定されないが、通常、１００〜２００μｍ程度である。

標識体は、被検出物に特異的に結合する物質にマーカー物質を結合させたものが用いられる。被検出物に特異的に結合する物質は、前記の捕捉物質同様、被検出物に対する抗体及びその抗原結合性断片が包含される。また、マーカー物質の例としては、酵素、蛍光物質、着色粒子、磁気粒子等が挙げられる。酵素標識に使用される酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼがあげられる。この標識体も、本発明のアッセイ用媒体により希釈して標識体液とし、アッセイの場で使用され得る。この場合のアッセイ用媒体のアルギニン濃度は、前記したとおり０．０５〜０．５Ｍの範囲が好ましいが、これに限定されない。また、好ましいpHの範囲は前記の通りである。

酵素を前記のマーカーに用いた場合は、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質液をアッセイの場に添加することにより、複合体の検出を行うことができる。基質液の具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー、テトラメチルベンチジンがあげられる。本発明のアッセイ用媒体は、このような基質液を調製するために用いることもできる。この場合、用いるアッセイ用媒体中のアルギニン濃度は、用いる酵素とそれに対する基質によって適宜選択すればよく特に限定されないが、一般的には０．０２〜１．０Ｍ、好ましくは０．０５〜０．２Ｍであり、ｐＨは、例えば、ペルオキシダーゼの場合７．０付近、アルカリホスファターゼの場合１０．０付近である。

アッセイでは、捕捉物質と被検出物との結合反応や、被検出物と標識体との結合反応に続き、必要に応じて未反応物を除くための洗浄が行なわれる。本発明のアッセイ用媒体は、その際の洗浄液として用いることもできる。この場合のアッセイ用媒体のアルギニン濃度は前記の通り０．０２〜１．０Ｍの範囲が好ましく、またpHの好ましい範囲は前記したとおりであるが、これらに限定されず、標識体の標識が酵素である場合であって、検出反応の直前の洗浄に用いる場合には、被検出物が捕捉された固相を前もって酵素反応に好適なpHにするために、前記の範囲外にpHを設定することもできる。

フロースルー式メンブランアッセイ法の装置の具体例を図２及び３に示す。図２は、装置の平面図であり、図３は、図２のＩ−Ｉ’切断断面図である。図２及び３において、ａは、調製した検体試料を滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴（Ａホール及びＢホール）を備えたアダプターである。ｂは被検出物に特異的に結合する捕捉抗体が結合したメンブランであり、ｃは、液体吸収部材である。検出は、(1)検体試料をａの開口部に滴下し、(2)標識体液を滴下し、(3)洗浄液を滴下し、(4)基質液を滴下し、(5)メンブラン上の発色の有無により検体中の被検出物の有無を判定して行なう。ここで用いる検体試料、標識体液、洗浄液及び／又は基質液の調製を、前記の通り本発明のアッセイ用媒体を用いて行なえば、偽陽性及び偽陰性の発生を望ましく抑えることができる。

着色粒子を標識に用いるラテラルフロー式メンブランアッセイ法の装置の具体例を図６に示す。図の上が上面図、下が切断断面図である。検体を検体浮遊液用媒体に浮遊させて検体試料を調製し、該検体試料を、メンブラン（イ）上に被検出物と特異的に結合する抗体を着色粒子で標識した標識体を含む標識体部（ロ）を備え、更に被検出物に特異的に結合して被検出物を捕捉する捕捉物質がライン状に結合した検出部（ハ）を備えたアッセイ装置の検体試料滴下部（ニ）に滴下する。被検出物を含む検体試料は、メンブラン上を水平方向に移動しながら標識体を展開するので、被検出物が存在すれば、被検出物−標識体の複合体を形成し、更に捕捉物質ラインに到達するとそのライン上に、捕捉物質−被検出物−標識体の複合体が形成され、この複合体中の着色粒子により、複合体の存在を検出することで検体中の被検出物の有無を判定する。標識体を捕捉物質ラインまで展開させた後の残りの検体試料は、洗浄液としての効果を発揮させることができる。反応に関与しなかった他の成分等は、吸収パッド（ホ）に吸収される。検体浮遊用媒体として本発明のアッセイ用媒体を用いることにより、偽陽性及び偽陰性の発生を望ましく抑えることができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１アッセイ用媒体の調製
Ｌ（＋）−アルギニン塩酸塩（和光純薬製）を０．１Ｍになるように精製水に溶解調製したものをＡ液とし、水酸化ナトリウム（和光純薬製）を０．１Ｍになるように精製水に溶解調製したものをＢ液とした。次に、Ａ液５０ｍＬにＢ液を滴下して加えながらｐＨ変化を測定（温度２０℃）した。滴下した０．１Ｍ水酸化ナトリウム（０．１ＭＮａＯＨ）の量とｐＨの関係（滴定曲線）を図１に示す。

図１に示されるようにｐＨ７．０〜１０．３までのアルギニン溶液が得られる。以上の成績から、ｐＨ７．０〜１０．３の範囲内で所望のアルギニン濃度、所望のｐＨの本発明のアッセイ用媒体（以下「アルギニン緩衝液」ということがある）が容易に調製できる。アッセイには、ｐＨ７．０〜９．５を用いる。

実施例２フロースルー式メンブランアッセイ
１．抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を用い、（１）と同様の方法で、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

２．酵素標識抗インフルエンザウイルス抗体の作製
（１）酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について４５ｍｇをクエン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（Pall Corporation）で分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆ（ａｂ’）_２精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。

１０ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ１．５ｍＬを塩化マグネシウム１ｍＭならびに塩化亜鉛０．１ｍＭを含むホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックス(商品名、Pharmacia社)Ｇ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリホスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。

濃縮した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’とマレイミド−アルカリホスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。更に、反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’は、塩化ナトリウム０．１５Ｍ、ウシ血清アルブミン１(w/v)％、塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化亜鉛０．１５ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９％を含むトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を得た。

（２）酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について、（１）と同様の方法で、酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体と酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とを至適濃度になるように、塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化亜鉛０．１５ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、ウシ血清アルブミン３(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９％を含むアルギニン緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８．０）中で混合し、酵素標識抗体液（抗Ａ型＋抗Ｂ型）を調製した。

３．インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置は、図２及び図３に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブランは、孔径３μｍを有するニトロセルロースメンブラン（サイズ２×３ｃｍ、厚さ１２５μｍ）を用いた。メンブランへの捕捉抗体の固相化は、２種の抗体溶液をニトロセルロースメンブランへスポットして行った。装置のＡホールには精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬに含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過したものを３μＬ、Ｂホールには精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬに含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過したものを３μＬ、それぞれスポットした。スポット後、４５℃の乾燥庫で４０分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置を作製した。

４．インフルエンザウイルスの検出
患者から採取した検体を検体浮遊用緩衝液（アルギニン緩衝液０．２Ｍ、ｐＨ８．０にＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、ウシ血清アルブミン３(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％に加）を用いて検体試料用濾過チューブ内で浮遊し、検体試料とした。検体は、ＰＣＲ法でＡ型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体１〜５、Ｂ型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体６〜１０、並びにＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス共に陰性と判定された検体１１〜１５を用いた。調製した検体試料が入った検体試料用濾過チューブ本体部に検体試料用濾過チューブ先端部を取り付け、濾過フィルターで濾過し、アッセイ装置のアダプター開口部に２００μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブランの下部に備えられた液体吸収部材に試料が完全に吸収されるまで静置した。

次に酵素標識抗体液（抗Ａ型＋抗Ｂ型）を２００μＬ滴下し、液体吸収部材に酵素標識抗体液が完全に吸収されるまで静置した。次に、アダプターを取り外し、洗浄液（アルギニン０．１Ｍ、ｐＨ８．０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００．１(w/v)％）を３００μＬ滴下し、液体吸収部材に洗浄液が完全に吸収されるまで静置した。次に、基質液（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸０．１５ｍｇ／ｍＬ、ニトロテトラゾリウムブルー０．３ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム５ｍＭ、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％に含む０．１Ｍアルギニン緩衝液、ｐＨ９．５）を３００μＬ滴下し、発色反応を開始させた。１５分間後にＡホール（Ａ型インフルエンザウイルス検出用）とＢホール（Ｂ型インフルエンザウイルス検出用）を鉛直上方から観察し、発色が認められた場合には陽性（＋）、発色が認められない場合には陰性（−）と判定した。

比較例
検体浮遊液としてリン酸緩衝液にアルギニン０．２５M、塩化ナトリウム１．５Ｍ、ウシ血清アルブミン０．５(w/v)％、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％を含有させたもの、洗浄液としてリン酸緩衝液にアルギニン０．２５M、塩化ナトリウム０．５Ｍ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％を含有させたもの、基質液として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸０．１５ｍｇ／ｍＬ、ニトロテトラゾリウムブルー０．３ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム５ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００．１(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％に含む０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ９．５を用いた以外は、実施例と同様の試験を行なった。

結果
ＰＣＲ法でＡ型インフルエンザウイルス陽性（＋）と判定された検体の１〜５、Ｂ型インフルエンザウイルス陽性（＋）と判定された検体６〜１０、並びにＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス共にＰＣＲ法で陰性（−）と判定された検体１１〜１５は全て実施例２の成績と一致した。しかしながら、比較例の成績は、ＰＣＲ法でＡ型又はＢ型陽性の検体においてＡ型、Ｂ型共に発色が見られ、明らかに片方が偽陽性と認められるものが３検体、ＰＣＲ法、実施例２共にＢ型陽性の検体において、比較例でＢ型陰性と判定されるものが１検体あった。これは、比較例の検出感度が本発明法より劣ることを示している。また、ＰＣＲ法で陰性の検体において、比較例による成績がＡ型、Ｂ型共に発色が見られ、明らかに双方共に偽陽性と認められるものが１検体あった。これら得られた結果を表１に示す。

表１に示すように、本発明のアッセイ用媒体を用いた方法は、インフルエンザウイルスを偽陽性がなく特異的に高感度で検出並びにＡ型、Ｂ型の鑑別が同時にできることがわかる。

実施例３ラテラルフロー式メンブランアッセイ
１．標識抗体パッドの作製
抗体は、実施例２で調製したものを使用した。粒径０．３９４μｍの青色ラテックス粒子（ＣＭ／ＢＬセラダイン製）に抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を共有結合させ、ウシ血清アルブミン０．０５(w/v)％、サッカロース１０(w/v)％、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００．４(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０５(w/v)％を含むグリシン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．０）にラテックス粒子の濃度が０．０１８(w/v)％になるように懸濁し、ソニケーションを行って充分に分散浮遊させた抗Ａ型ラテックス浮遊液を調製した。また、同様に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を共有結合させた抗Ｂ型ラテックス浮遊液を調製した。抗Ａ型ラテックス浮遊液と抗Ｂ型ラテックス浮遊液とを混合し、大きさが２０ｃｍ×１ｃｍのガラス繊維（３３ＧＬＡＳＳＮＯ．１０５３９７６６Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ製）に１平方センチメートル当たり５０μＬになる量を含侵させ、減圧下で良く乾燥させて標識抗体パッドを作製した。

２．インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置は、図６に示すものと同様の構成のものを用いた。ニトロセルロースメンブラン（Hiflow Plus HF120 ミリポア製）を大きさが３ｃｍ×２０ｃｍに裁断し接着剤がついたプラスチック板でバッキングした、下端から１．０ｃｍと１．５ｃｍの位置に約１ｍｍ幅になる量の抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体（上記と別の抗体）液、並びに抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体（上記と別の抗体）液を各々２０ｃｍ塗布し、減圧下で良く乾燥させて抗体を固相化した。次に、３ｃｍ×２０ｃｍの大きさの濾紙（ＷＦ１．５ワットマン製）をニトロセルロースメンブランの上端に８ｍｍ重ねて吸収パッド部を設けた。更に、標識抗体パッドをニトロセルロースメンブランの下端に２ｍｍ重ねて標識体部を設け、更に、大きさが２．０ｃｍ×２０ｃｍのガラス繊維（Ｆ０７５−１４ワットマン製）を標識抗体パッドの上端から３ｍｍ離れた位置に合わせて重ね，検体試料滴下部を設けた。次いで、カッターで幅５ｍｍの短冊に裁断して一体化されたアッセイ装置を作製した。

３．測定
検体は、実施例２で用いたと同じものを使用した。すなわち、ＰＣＲ法でＡ型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体１〜５、Ｂ型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体６〜１０、並びにＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス共に陰性と判定された検体１１〜１５を用いた。検体を検体浮遊用緩衝液（アルギニン緩衝液０．２５Ｍ、ｐＨ８．０にＴｒｉｔｏｎＸ−１００１(w/v)％、ウシ血清アルブミン０．０５(w/v)％、ミルクカゼイン０．０５(w/v)％、アジ化ナトリウム０．０９(w/v)％に加）を用いて検体試料用濾過チューブ内で浮遊し、検体試料とした。次に、アッセイ装置を水平に置き、検体試料を検体試料滴下部に１００μＬ滴下し、標識抗体を展開させた。判定は１５分間後に下記の方法で行った。

４．判定および結果
判定は、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体並びに抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を固相化したそれぞれの検出部における青色ラインの有無を肉眼で観察して行った。その結果を表２に示す。実施例３の方法は、実施例２の比較例において偽陽性と判定された検体でも偽陽性が認められず、実施例３の方法で測定した全ての検体は、ＰＣＲ法の成績と一致した。ラテラルフロー式メンブランアッセイにおいても本発明による方法は、偽陽性が認められず、インフルエンザウイルスを偽陽性がなく特異的に高感度で検出並びにＡ型、Ｂ型の鑑別が同時にできることがわかる。

実施例１において、アルギニン塩酸塩溶液を水酸化ナトリウム溶液で滴定した滴定曲線を示す図である。本発明の一実施態様であるフロースルー式メンブランアッセイ装置の平面図である。図２のI−I’切断断面図である。本発明において使用され得る検体試料用濾過チューブの一実施態様を示す図である。図４の検体試料用濾過チューブ先端部の透視図である。本発明の一実施態様であるラテラルフロー式メンブランアッセイ装置の平面図並びに切断断面図である。

符号の説明

Ａ：Ａホール
Ｂ：Ｂホール
ａ：アダプター
ｂ：メンブラン
ｃ：液体吸収部材
ｄ：濾過チューブ先端部
ｅ：濾過チューブ本体部
ｆ：濾過フィルター
イ：メンブラン
ロ：標識体部
ハ：検出部
ニ：検体試料滴下部
ホ：吸収パッド部
ヘ：プラスチック板

Claims

固相に不動化され、検体中の測定すべき被検出物と特異的に反応する捕捉物質と、検体中の被検出物とを反応させ、必要に応じて洗浄した後、前記被検出物と特異的に反応する標識体を反応させ、必要に応じて洗浄した後、固相に捕捉された該標識体を測定することにより、固相に捕捉された前記被検出物を測定するイムノアッセイにおいて、前記捕捉物質と前記被検出物の反応の媒体、前記被検出物と前記標識体との反応の媒体、及び前記いずれかの洗浄に用いる洗浄液の少なくともいずれかとして、アルギニン濃度が0.02〜1.5Mであり、pHが7.0〜9.5であり、アルギニン以外に緩衝剤を含まないイムノアッセイ用媒体を用いる、イムノアッセイ方法。
検体中の測定すべき被検出物と、前記被検出物と特異的に反応する標識体を反応させた後、固相に不動化され、前記被検出物と特異的に反応する捕捉物質を反応させ、必要に応じて洗浄した後、固相に捕捉された前記標識体を測定することにより、固相に捕捉された前記被検出物を測定するイムノアッセイにおいて、前記捕捉物質と前記被検出物の反応の媒体、前記被検出物と前記標識体との反応の媒体、及び前記いずれかの洗浄に用いる洗浄液の少なくともいずれかとして、アルギニン濃度が0.02〜1.5Mであり、pHが7.0〜9.5であり、アルギニン以外に緩衝剤を含まないイムノアッセイ用媒体を用いる、イムノアッセイ方法。
前記捕捉物質と前記被検出物の反応の媒体、及び前記被検出物と前記標識体との反応の媒体の少なくともいずれかとして、アルギニン濃度が0.02〜1.5Mであり、pHが7.0〜9.5であり、アルギニン以外に緩衝剤を含まないイムノアッセイ用媒体を用いる、請求項１又は２記載の方法。
前記捕捉物質と前記被検出物の反応が抗原抗体反応であり、イムノクロマトグラフィー法により行なう請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
前記イムノアッセイの方式がフロースルー方式又はラテラルフロー方式である請求項４記載の方法。