WO2006073153A1 - 複数の被検出物を検出する簡易アッセイ法 - Google Patents

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WO2006073153A1
WO2006073153A1 PCT/JP2006/300028 JP2006300028W WO2006073153A1 WO 2006073153 A1 WO2006073153 A1 WO 2006073153A1 JP 2006300028 W JP2006300028 W JP 2006300028W WO 2006073153 A1 WO2006073153 A1 WO 2006073153A1
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WO
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enzyme
membrane
sample
reagent
detected
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/300028
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shosaku Motoda
Takashi Miyazawa
Original Assignee
Denka Seiken Co., Ltd.
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Filing date
Publication date
Application filed by Denka Seiken Co., Ltd. filed Critical Denka Seiken Co., Ltd.
Publication of WO2006073153A1 publication Critical patent/WO2006073153A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the present invention relates to a simple flow-through membrane enzyme immunoassay method for detecting an object to be detected in a specimen sample.
  • a membrane assembly method in particular, an assembly method using a membrane such as -trocellulose or a membrane such as a filter is generally known, and a flow-through method and a lateral flow method are used.
  • a flow-through method and a lateral flow method are used.
  • the former allows the solution containing the object to be detected to pass in a direction perpendicular to the membrane, and the latter allows the solution to be developed in the horizontal direction.
  • a label is detected by forming a complex of a capture substance that specifically binds to the detection target, a detection target, and a labeling substance that specifically binds to the detection target on the membrane. Is common in that the object to be detected is detected by quantification.
  • the patient force is determined to be positive despite the fact that the detected substance does not exist in the sample by analyzing the sample actually collected.
  • the So-called false positives may occur. If a false positive response occurs when testing for a pathogen infection, it will give false information about the disease, which can lead to more serious disease conditions by taking the wrong action rather than delaying the identification of the cause. Can have serious consequences. Therefore, suppressing false positives is an extremely important issue from the main purpose of simple test methods.
  • a specimen is highly diluted, or a buffer containing urine serum albumin, a surfactant, a basic amino acid, an inorganic salt, or the like is used as a solution for diluting the specimen.
  • a buffer containing urine serum albumin, a surfactant, a basic amino acid, an inorganic salt, or the like is used as a solution for diluting the specimen.
  • Patent Document 1 Use a buffer solution containing a surfactant, basic amino acid, inorganic salt, etc. as a cleaning solution (see Patent Document 1), or pass a filter filter when adding a sample (Patent Document 1) (Refer to reference 2).
  • the flow-through type membrane enzyme immunoassay method which uses an enzyme for labeling, is an excellent method for high-sensitivity measurements that have a clear positive signal and are easy to judge. This is a problem as a simple assembly method with a large number of operation steps because the sample, enzyme labeling reagent, washing solution, and substrate solution need to be dropped.
  • viruses most of the causative pathogens of infectious gastroenteritis in children are said to be viruses except in summer, and include rotavirus, norovirus, adenovirus, and astrovirus. Virus identification is desired as well as acute respiratory tract infections.
  • a sample collected from a patient is suspended in a buffer solution to prepare a sample, filtered using a filtration filter, and dropped on an accessory device.
  • An enzyme-labeled antibody is dropped.
  • the conventional method requires many steps to detect an object to be detected and takes an operation time.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-279577
  • Patent Document 2 JP 2004-28875 A
  • the present invention relates to a flow-through type membrane zymno assay device for detecting an object to be detected contained in a specimen sample, and what is the substance to be detected present in the specimen sample.
  • the object is to provide a method.
  • the present inventor added a specimen sample prepared by diluting with a buffer solution or the like to an enzyme labeling reagent section containing a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to a plurality of objects to be detected. After filtering using a filtration filter, a plurality of capture reagents for capturing a plurality of objects to be detected are added onto a membrane of an assembly device having a membrane bound to a position apart from each other. I found that I can achieve it.
  • the present inventor uses a sample (diluted sample supply device) or a sample sample adding device equipped with one or both of an enzyme labeling reagent part and a filtration filter to prepare a sample sample prepared by diluting with a buffer solution or the like.
  • the inventors have found that the above object can be achieved by adding to the adapter (specimen sample supply device) or the sample sample addition device, filtering, and then adding to the membrane, thereby completing the present invention.
  • an adapter for example, an adapter (specimen sample supply device) or a specimen provided with an enzyme labeling reagent section
  • Specimen sample is added to sample addition device, enzyme labeling reagent and sample sample are mixed, then filtered using adapter (specimen sample supply device) or sample sample addition device to capture multiple objects to be detected
  • a plurality of capture reagents are dropped on the membrane of an assembly device equipped with a membrane that is bound to a distant position, and the capture target is captured by the capture reagent, and the capture reagent, the target-enzyme labeling reagent
  • a sample sample is formed by a flow-through type membrane enzyme immunoassay method for simultaneous testing of multiple items, which forms an immune complex and subsequently drops the substrate solution for the enzyme onto the membrane.
  • the present inventors have found that it is possible to specify what force is the substance to be detected, and have completed the present invention.
  • Specimen sample is added to the enzyme labeling reagent part.
  • a sample sample and enzyme labeling reagent mixture is formed, the mixture is filtered through a filtration filter and added onto the membrane, and the detected substance is captured by the capture reagent.
  • an immune complex composed of the capture reagent-detected object-enzyme labeling reagent is formed, and then
  • a method for detecting a plurality of objects to be detected including a process in a single assembly
  • the flow-through type membrane zymno assay device includes a sample sample supply device as an integral unit, and the sample sample supply device includes a filtration filter and a Z or enzyme labeling reagent unit,
  • a membrane in which a plurality of capture reagents capable of binding to different analytes are bound to positions apart from each other, and an enzyme labeling reagent section including a filtration filter and Z or a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to the different analytes Multiple specimens using a flow-through type membrane zymno assay system that includes a specimen and a device as a separate unit.
  • a method for detecting a plurality of objects to be detected including a process in a single assembly
  • the enzyme labeling reagent part containing a plurality of enzyme labeling reagents that can bind to different objects to be detected also has a water-absorbing material force impregnated with a plurality of enzyme labeling reagents and dried [1] to [3] A method for detecting a plurality of detected objects in a single assembly,
  • the detection object is an antigen or an antibody
  • the capture reagent capable of binding to the detection object is an antibody or antigen that binds to the detection object, and a plurality of enzyme labels that can bind to the detection object
  • a membrane in which a plurality of capture reagents capable of binding to different objects to be detected are bound to positions separated from each other, and an enzyme labeling reagent part including a filtration filter and Z or a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to the different objects to be detected A flow-through type membrane zymno assay device for detecting a plurality of objects to be detected in a single assembly,
  • a membrane in which a plurality of capture reagents capable of binding to different objects to be detected are bound to positions separated from each other, a filtration filter, and an enzyme labeling reagent part including Z or a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to the different objects to be detected A sample through the membrane, and a flow-through type membrane zymno assay device for detecting multiple objects to be detected in a single assembly.
  • An enzyme labeling reagent part comprising a plurality of enzyme labeling reagents that can bind to different analytes
  • a flow-through type membrane zymno assay device for detecting multiple objects to be detected in [7] or [8] which also has the ability to absorb water-absorbing materials impregnated with multiple enzyme labeling reagents and dried, and
  • the detection target is an antigen or an antibody
  • the capture reagent capable of binding to the detection target is an antibody or antigen that binds to the detection target, and a plurality of enzyme labels that can bind to the detection target.
  • the method of the present invention comprises a membrane in which a plurality of capture reagents capable of binding to different analytes are bound to positions separated from each other and a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to the different analytes. Since a part is used, a plurality of detection objects can be detected simultaneously with a small number of processes in one assembly. Since multiple analytes can be detected simultaneously, one analyte can be used to simultaneously test multiple analyte species in a single assembly to determine what is positively detected. A simple and quick identification method that is easy to use and highly reliable can be provided.
  • an adapter (specimen sample supply apparatus) including a filtration filter and an enzyme labeling reagent part containing a plurality of enzyme labeling reagents capable of binding to the different analytes or sample sample addition
  • FIG. 1 is a plan view of a flow-through type membrane zymno assay device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line I ⁇ in FIG.
  • FIG. 3 is a view showing an embodiment of a specimen sample addition tube used in the present invention.
  • 4 is a perspective view of the distal end portion of the specimen sample addition tube of FIG. 3.
  • the method of the present invention is characterized in that it is possible to quickly and easily identify what a substance to be detected in a specimen sample is by simultaneously testing a plurality of items with a single accessory with one accessory.
  • a plurality of capture reagents capable of binding to different objects to be detected are bound to positions separated from each other, a filtration filter located in the upstream part of the membrane, and the above-mentioned located in the upstream part of the filtration filter
  • a plurality of objects to be detected are detected in a single assembly using a flow-through membrane enzyme immunoassay device including an enzyme labeling reagent part containing a plurality of enzyme labeling reagents that can bind to different objects to be detected.
  • a membrane in which a plurality of capture reagents that can bind to different analytes are bound to positions apart from each other, a filtration filter, and an enzyme label reagent section that includes a plurality of enzyme labeling reagents that can bind to the different analytes.
  • a flow-through type membrane zymno assay device that includes an adapter (specimen sample supply device) or a sample sample addition device, multiple objects are detected in a single assembly.
  • the capture device that specifically binds to a plurality of substances to be detected is separated from an assembly device (also referred to as a membrane assembly device) including U membrane. It is preferable to use an assembly apparatus that uses a flow-through type membrane zymno assay method that includes a membrane immobilized on a certain position.
  • the flow-through membrane zymno assay device is, for example, a device as shown in Figs.
  • the apparatus shown in FIGS. 1 and 2 is an apparatus including a specimen sample addition device described later as a separate body.
  • FIG. 1 is a plan view of the apparatus
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line I I 'of FIG.
  • a has an opening through which a prepared specimen sample is filtered and dropped using a specimen sample addition device equipped with an enzyme labeling reagent section, and the sample passes through the bottom section.
  • Adapter with holes A hole and B hole).
  • b is a membrane to which a capture reagent that specifically binds to the target is bound
  • c is a member that absorbs liquid (liquid absorbing member)
  • the material of the membrane in the membrane assembly device includes a group consisting of nonwoven fabric, paper, nitrocellulose, glass fiber, silica fiber, cellulose ester, nylon 6, 6, and a mixture of cellulose ester and -trocellulose. Particularly preferred is a microporous material produced by a force of -trocell mouth. In addition, a mixture of the cellulose ester and -trocellulose can also be suitably used.
  • the pore size or retention particle size of the membrane is particularly preferably 3 to 5 / ⁇ ⁇ , which is preferably not less than the pore size or retention particle size of the filtration filter, and preferably 1 to 12 / z m.
  • the thickness of the membrane is not particularly limited, but is usually about 100 to 200 m.
  • a capture reagent is immobilized (bound) on the membrane surface of the membrane assembly device.
  • the capture reagent include an antigen or an antibody that specifically binds to a detected substance by an antigen-antibody reaction and captures the detected object by forming an antigen-antibody complex, but is not limited to an antigen or an antibody.
  • an antigen or an antibody that specifically binds to a detected substance by an antigen-antibody reaction and captures the detected object by forming an antigen-antibody complex, but is not limited to an antigen or an antibody.
  • substances that can bind to each other in a ligand-receptor relationship one can be used as a capture reagent to capture the other. Therefore, depending on the object to be detected, a different capture antigen or antibody that can bind to it may be used.
  • the detected substance is a bacterium, virus, hormone, or other clinical marker
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that specifically reacts and binds to these may be used.
  • the capture reagent may be immobilized on the membrane surface at the site corresponding to the hole in the bottom surface of the adapter a of the membrane device. By immobilizing in this way, the sample sample and Z or enzyme labeling reagent added to adapter a pass through the hole on the bottom of adapter a and reach the site where the capture reagent on the membrane is immobilized. A binding reaction occurs efficiently at the site.
  • the method for binding such a capture reagent to the membrane described above may be physical adsorption or chemical binding.
  • the membrane to which the capture reagent is bound is prepared, for example, by applying a solution obtained by diluting the capture reagent with a buffer or the like to the membrane and then drying it.
  • a plurality of objects to be detected can be detected simultaneously in one time. For this reason, a plurality of capture reagents that can bind to each object to be detected are bound on the membrane. At this time, each capture reagent is bound apart on the membrane.
  • “separate binding” means that the sites on the membrane where the respective capture reagents are bonded do not overlap or come into contact with each other. In this case, the hole in the bottom surface of the adapter a of the membrane device corresponding to the immobilized capture reagent site is also provided separately from the bottom surface of the adapter a.
  • the membrane assembly device of the present invention may include a liquid absorbing member that absorbs the liquid that has passed through the membrane.
  • the liquid absorbing member is included downstream of the membrane.
  • the detection object referred to in the present specification is not limited in any way, and includes, for example, any antigenic substance that can produce an antibody corresponding thereto.
  • virus antigens such as influenza A virus, influenza B virus, RS virus (RSV), rhinovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus, HAV, HBs, HCV, HIV, EBV, Chlamydia 'Tracomatis, Streptococcus, Bordetella pertussis, Helicopactor' H. pylori, Leptovira, Treponema 'Paridum, Toxoplasma gondii, Borrelia, Legionella spp., Anthrax, MRSA, etc.
  • Peptide hormones such as human chorionic gonadotropin, steroids such as steroid hormones, bioactive amines such as epinephrine and morphine, vitamins such as vitamin B, antibiotics such as prostaglandins and tetracycline, various tumor markers, Pesticides, environmental hormones, etc.
  • steroids such as steroid hormones
  • bioactive amines such as epinephrine and morphine
  • vitamins such as vitamin B
  • antibiotics such as prostaglandins and tetracycline
  • various tumor markers Pesticides, environmental hormones, etc.
  • antibodies against these can also be mentioned as objects to be detected
  • the specimen may be, for example, a pharynx or nasal cavity swab collected using a sample collection device such as a patient's pharynx or nasal cavity and a sterile swab, pharyngeal or nasal wash, nasal aspirate, saliva, serum, stool suspension The ability to use solution, urine, culture solution, etc.
  • the specimen thus obtained is diluted with a buffer solution or the like and subjected to assay.
  • a buffer used for dilution of a specimen a buffer usually used in antigen detection or quantification by an immunological technique such as Enzyme immunoassay or immunoagglutination can be used. More specifically, examples include, but are not limited to, Tris buffer, Good buffer, and the like. Further, physiological saline may be used.
  • the specimen has a pharynx or nasal cavity force collected using a sample collection device such as a sterile cotton swab! /, Is a nasal wipe !, liquid, pharynx is present! If the sample is contained, the sample floats in a buffer solution that dilutes the sample.
  • the buffer solution is referred to as a specimen suspension buffer solution.
  • the buffer for diluting the specimen includes surfactants 0.2 to: LO (w / v)%, animal-derived serum albumin such as ushi serum albumin (BSA) 1 to 5 (w / v)% Alternatively, an inorganic salt or the like having an appropriate concentration can be contained.
  • BSA ushi serum albumin
  • an inorganic salt or the like having an appropriate concentration can be contained.
  • Triton X-100 (trade name): polyethylene glycol mono-p isooctyl phenol ether, Tween 20: polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween 80: polyoxyethylene sorbitan monooleate,
  • Nonidet P—40 Nodette P—40
  • ZWITTERGENT 3—14 n—Tetradecyl N, N Dimethyl-3—Ammonia 1 Propanesulfonate
  • CHAPS 3 — [(3 colamidopropyl) dimethylammonium -O] propanesulfonic acid, sodium dodecyl sulfate (SDS), etc.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the enzyme labeling reagent is a reagent obtained by labeling a substance that specifically binds to the detection target with an enzyme.
  • the substance that specifically binds to the detection target is, for example, an antigen that specifically binds to the detection target. Or it is an antibody.
  • the detected substance is an antigenic substance of a virus or bacteria, it is an antibody against the virus antigen or bacterial antigen and labeled with an enzyme
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or the like that specifically reacts and binds to an object to be detected is used. It is desirable that the capture reagent and the enzyme labeling reagent bind to different parts of the detection target, but even if the capture reagent and the enzyme labeling reagent bind to the same part of the detection target, There is no problem when there are a plurality of the binding moieties.
  • the detection target is an antigen and the capture reagent and the enzyme labeling reagent are antibodies against the antigen
  • both antibodies are preferably antibodies that bind to different epitopes of the detection target, but the same epitope on the detection target. Can be used even when both antibodies bind to the same epitope.
  • Such an enzyme labeling reagent detects a complex by adding a substrate solution of the enzyme that generates a substance detectable by a colorimetric method or a fluorescence method by a reaction catalyzed by the enzyme. Can go out.
  • Examples of the enzyme used for enzyme labeling include alkaline phosphatase and peroxidase. Labeling of an enzyme with an antigen or antibody can be performed by a known method.
  • the enzyme labeling reagent part is included in the enzyme labeling reagent part.
  • the enzyme labeling reagent part may be liquid or solid. In the case of liquid, it is sufficient to put the enzyme labeling reagent solution in the enzyme labeling reagent part. In the case of solid, there is a solid impregnated with the enzyme labeling reagent! .
  • the enzyme labeling reagent and the specimen sample contained in the enzyme labeling reagent part are mixed to form a mixture.
  • the enzyme labeling reagent part is a solid
  • the enzyme labeling reagent in the solid is dissolved in the sample and forms a mixture of the enzyme labeling reagent and the sample.
  • Enzyme labeling reagent part is impregnated in solid
  • the enzyme labeling reagent itself added to the sample sample addition device is called an enzyme labeling reagent part.
  • the enzyme labeling reagent part is provided upstream of the membrane and the filter.
  • upstream means flow-through type membrane By the way, it means the upstream in the flow of the sample when the liquid moves after the liquid specimen sample is added to the apparatus.
  • a filtration filter and a solid or liquid enzyme labeling reagent part may be provided above or below the hole inside the adapter, and a filtration filter is provided below the hole inside the adapter.
  • An enzyme labeling reagent part may be provided on the hole.
  • the enzyme labeling reagent is mixed with the sample sample inside the adapter, passed through the filter through the hole, and then added to the membrane.
  • the enzyme labeling reagent may be impregnated with a water-absorbing material.
  • a material such as a nonwoven fabric made of sponge and glass fiber is used, and a labeled antigen or antibody labeled with an enzyme is contained in a dry state.
  • the enzyme labeling reagent part may be dried by impregnating the water-absorbing material with a labeled antigen or antibody.
  • the enzyme labeling reagent part may be used in the adapter a part at the time of rushing or assembly.
  • the filtration filter 1 is provided upstream of the membrane and downstream of the enzyme labeling reagent section.
  • the filtration filter may be used by putting it in the adapter a part at the time of assembly.
  • the specimen sample mixed with the enzyme labeling reagent is filtered and added to the membrane by passing through a filtration filter.
  • the filtration filter 1 can be provided, for example, in an opening for dropping the specimen of the above-mentioned apparatus.
  • a specimen sample prepared by diluting a specimen collected from a patient with a buffer solution is mixed with an enzyme labeling reagent in an enzyme labeling reagent section and filtered by a filtration filter.
  • the pore size (diameter) or retained particle size of the filtration filter is 0.1 to 0.6 ⁇ m.
  • the pore size or retained particle size of the filtration filter is extremely important in reducing non-specific reactions. If the pore size or retained particle size is too large, non-specific binding may occur on the membrane, which may indicate false positives. On the other hand, if it is too small, the filter itself will be clogged due to viscous substances and agglomerates present in the specimen sample, and the force that makes filtration impossible or the filter area must be considerably widened. Eyes used for inspection methods Inappropriate from the point of view.
  • the material of the filter is not particularly limited, but is preferably glass fiber or -trocellulose.
  • the adapter 1 can include one or both of a filtration filter and an enzyme labeling reagent unit, and functions as a device for supplying a specimen sample to the assembly device.
  • the adapter according to the present invention can also be called a specimen sample supply device.
  • the assembly device of the present invention is also a device that integrally includes an adapter (specimen sample supply device) that includes one or both of the filtration filter and the enzyme labeling reagent unit.
  • the adapter includes the adapter during assembly. To be attached to the device.
  • an adapter (specimen sample supply device) including one or both of a filtration filter and an enzyme labeling reagent unit is used as a body. Therefore, the adapter may exist as a separate unit from the assembly device before performing the assembly.
  • a specimen sample addition device including one or both of a filtration filter and an enzyme labeling reagent part may be used.
  • the filtration filter and the enzyme labeling reagent section may be included in either the sample sample addition device or the adapter (sample sample supply device) described above.
  • the adapter for adding a sample sample is not included in the device of the present invention.
  • the specimen sample addition device is a container-like device for adding a specimen sample to an immunoassay apparatus equipped with a filtration filter, for example, a tube-like device (specimen sample addition tube).
  • the filtration filter is preferably attached to the tip of the sample sample addition device in the simple assembly method or kit of the present invention. That is, for example, a specimen sample prepared by diluting a specimen with a buffer solution is poured into a specimen sample addition device, and a filtration filter equipped with an enzyme labeling reagent part is attached to the tip of the device, and the specimen sample and the enzyme label are attached.
  • FIGS. 3 and 4 show schematic views of one embodiment of a tube-shaped specimen sample addition device (specimen sample addition tube).
  • the enzyme labeling reagent part g is made of a solid impregnated with an enzyme labeling reagent.
  • the sample sample addition tube has a shape consisting of a tip portion d and a body portion e as shown in FIG. 3, and an enzyme-labeled reagent portion g and a filtration filter inside the tip portion d as shown in FIG.
  • a specimen sample prepared by diluting a specimen with a buffer solution is placed inside the body part e, and a tip part d equipped with an enzyme labeling reagent part and a filtration filter f is attached to the body part e. After dissolving the enzyme labeling reagent in the enzyme labeling reagent part with the sample sample, the sample sample is filtered through the filtration filter f, and the filtrate is dropped onto the membrane of the assembly device.
  • the main body e is made of a flexible material such as polyethylene or polyethylene terephthalate (PET), the specimen sample can be filtered easily and simply by applying pressure inside the filter with the filter attached. Is preferred because it can.
  • the enzyme labeling reagent part g is preferably attached to the tip part d of the specimen sample addition tube so as to pass through the filtration filter after the specimen sample contacts the enzyme labeling reagent part g as shown in FIG. Good.
  • a specimen sample is prepared by diluting a specimen collected from a patient with a buffer solution or the like, and added to the enzyme labeling reagent portion of the accessory device. At this time, the enzyme-labeled reagent contained in the enzyme-labeled reagent part is dissolved by the sample sample, and the mixture of the detected substance and the enzyme-labeled reagent in the sample sample passes through the filtration filter downstream of the enzyme-labeled reagent part. To be added.
  • sample sample supply device sample sample supply device
  • sample sample sample including a filter filter and Z or an enzyme labeling reagent unit Filter using the additive device and drop into the accessory device.
  • sample sample supply device sample sample supply device
  • sample sample sample including a filter filter and Z or an enzyme labeling reagent unit Filter using the additive device and drop into the accessory device.
  • sample sample supply device sample sample supply device
  • sample sample including a filter filter and Z or an enzyme labeling reagent unit Filter using the additive device and drop into the accessory device.
  • a substrate solution is dropped to cause a color reaction.
  • the substrate solution is a substrate for the enzyme used as a label of the enzyme labeling reagent and generates a substance detectable by a colorimetric method or a fluorescence method by a reaction catalyzed by the enzyme.
  • Specific examples thereof include 5-bromo-4-chloro-tri-indolyl phosphate trotetrazolium blue and tetramethylbenzidine.
  • coenzyme NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form
  • coenzyme NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form
  • alcohol dehydrogenase and diaphorase in the presence of ethyl alcohol and tetrazolium salt.
  • the enzyme cycling reaction reagent for which the so-called enzyme cycling reaction reagent that amplifies the enzyme is commercially available (AmpliQ Dako) can also be suitably used.
  • the substrate solution When the substrate solution is dropped on the membrane, most of the substrate solution passes through the membrane within a short period of time and is absorbed by the liquid absorbing member, and the substrate solution remaining on the membrane undergoes a color reaction with the labeling enzyme. . Therefore, since the substrate solution that passes through the membrane exhibits a cleaning action, a surfactant generally used in Enzymno Assay is added to the substrate solution to further perform the cleaning action. To reduce non-specific binding.
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.02 to: L (w / v)%.
  • the reaction may be stopped by dropping a reaction stop solution and the determination may be made later.
  • BALBZc mice were immunized with influenza A virus antigen, and the spleen was removed from mice reared for a certain period of time.
  • the obtained fused cells are maintained in a 37 ° C incubator, and the antibody activity of the supernatant is confirmed by ELISA using a plate with a solid phase of influenza A virus NP antigen. ⁇ ⁇ (monocloning) was performed.
  • the obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB Zc mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected.
  • IgG was purified from the obtained ascites by a affinity chromatography method using a protein A column to obtain two types of purified anti-influenza A virus NP antibodies.
  • Two types of purified anti-B-type Infunorezainoles NP antibodies were obtained using the influenza B virus antigen in the same manner as in (1).
  • an enzyme-labeled anti-influenza B virus antibody was obtained in the same manner as (1).
  • an enzyme-labeled anti-RS virus antibody was obtained in the same manner as in (1).
  • a device having the same configuration as that shown in FIGS. 1 and 2 was used.
  • As the membrane a trocellulose membrane (size 2 ⁇ 3 cm, thickness 125 m) having a pore diameter of 3 m was used.
  • the solid phase of the capture antibody on the membrane was performed by spotting two types of antibody solutions onto the -trocellulose membrane.
  • purified anti-influenza A virus NP antibody that was not used for labeling was diluted with purified water so that it was contained in lmgZm L, and filtered through a 0.22 ⁇ m pore size filter.
  • 3 ⁇ L of the purified anti-influenza B virus NP antibody in the B-hole is diluted with purified water to contain 1 mg / mL of the labeled anti-B influenza virus NP antibody. 3 ⁇ L of each filtered with a ⁇ m pore size filter was spotted. After spotting, drying was performed in a 45 ° C drying cabinet for 40 minutes to produce an influenza virus detection assembly. Next, a sample sample with an enzyme labeling reagent section and a filtration filter is added. The additional device was fabricated with the same configuration as that shown in FIGS.
  • the enzyme-labeled reagent part is prepared by mixing 150 ⁇ L of enzyme-labeled anti-influenza A virus antibody and enzyme-labeled anti-B influenza virus antibody at an optimal concentration and impregnating it in a polyvinyl sponge having a diameter of 9 mm and a thickness of 4 mm. The sample was dried and attached to the tip of the sample sample addition tube.
  • sample sample a sample collected from a nasal cavity using a sterile cotton swab was used as a buffer solution (Triton X-100 l (w / v)%, ushi serum albumin 4 (w / v)%, sodium chloride 0.15M, Nasal wipes that were determined to be positive for influenza A virus by PCR, prepared by diluting with 50 mM Tris buffer containing 0.09 (w / v)% sodium azide, pH 8.0), fluid: specimen sample 1 Nasal wipes tested positive for influenza B virus by PCR method, liquid: specimen sample 2 Nasal wipes tested negative for type A and B influenza viruses by PCR method, liquid: specimen sample 3
  • the adapter was removed, and the substrate solution (5 bromo-4 chloro-3 indolyl phosphate 0.15 mg ZmL, nitrotetrazolium blue 0.3 mg / mL, magnesium chloride 5 mM, Triton X—100 0 250 ⁇ L of 0.1 M Tris buffer (pH 9.5) containing l (w / v)% and sodium azide 0.09 (w / v)% was added dropwise to initiate the color reaction.
  • the substrate solution 5 bromo-4 chloro-3 indolyl phosphate 0.15 mg ZmL, nitrotetrazolium blue 0.3 mg / mL, magnesium chloride 5 mM, Triton X—100 0 250 ⁇ L of 0.1 M Tris buffer (pH 9.5) containing l (w / v)% and sodium azide 0.09 (w / v)% was added dropwise to initiate the color reaction.
  • influenza virus type A and type B can be specifically detected simultaneously.
  • Three holes (hole) are made in the adapter, and three items (type A, type B influenza virus, RS virus) (type A: influenza A virus, B: influenza B) Virus, C hole: RS virus) was prepared in the same manner as described above.
  • a sample sample addition device equipped with an enzyme labeling reagent part and a filtration filter was prepared in the same manner as described above.
  • the enzyme-labeled reagent part is prepared by mixing an enzyme-labeled anti-influenza A virus antibody, an enzyme-labeled anti-type B influenza virus antibody and an enzyme-labeled anti-RS virus antibody at an optimal concentration, followed by drying in the same manner as described above. It was prepared by attaching to the end.
  • Nasal wipes determined as positive for influenza A virus by PCR method liquid: specimen sample 4 Nasal wipes determined as positive for influenza B virus by PCR method, liquid: specimen sample 5 RS virus positive as determined by PCR method Nasal wipes, fluid: sample 6
  • Nasal swabs determined by PCR to be negative for influenza A virus, influenza B virus, or RS virus Sample Specimen 7
  • the membrane in the A-hole part is positive and the membranes in the B-hole part and C-hole part are negative so that the influenza A virus can be detected specifically. Was confirmed.
  • influenza virus types A, B, and RS can be specifically detected simultaneously.

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Abstract

　フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法を用いた検体の検査方法において、一つのアッセイ装置で複数の被検出物質種を同時に試験して陽性反応を示す被検出物質が何であるかを簡便・迅速に特定でき、使い勝手のよい信頼性の高いアッセイ方法を提供すること。 　異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含むフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置を用いて複数の被検出物を１回のアッセイで検出する方法であって、 (i)　検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、被検出物が捕捉試薬に捕捉されることにより、捕捉試薬－被検出物－酵素標識試薬からなる免疫複合体が形成され、次いで (ii)　前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する、 工程を含む複数の被検出物を１回のアッセイで検出する方法。

Description

明 細 書
複数の被検出物を検出する簡易アツセィ法
技術分野
[0001] 本発明は、検体試料中の被検出物を検出するための簡易フロースルー式メンブラ ンェンザィムィムノアッセィ法に関する。 背景技術
[0002] 最近、抗原抗体反応や酵素反応を利用した、ウィルスや細菌等の病原体の感染の 有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが 開発されている。これらの試薬、キットにおいては、病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナ ドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備 を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断の ための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する 簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院ゃ医療検査センター以外にも一般 の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機 関である場合が多ぐ患者力 採取した検体についてその場で感染の有無が判明す れば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における 重要性は益々高まってきて 、る。
[0003] 現在、簡易検査方法として、メンブランアツセィ法、特に-トロセルロース等の膜や フィルタ一等のメンブランを用いたアツセィ法が一般に知られており、フロースルー式 アツセィ法とラテラルフロー式アツセィ法に大別される。前者は被検出物を含む溶液 を膜に対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるもので ある。
[0004] いずれの場合も被検出物に特異的に結合する捕捉物質、被検出物、被検出物に 特異的に結合する標識物質の複合体をメンブラン上に形成させて、標識を検出ある いは定量することで、被検出物の検出を行うという点で共通している。
[0005] また、メンブランアツセィ法による簡易検査方法では、患者力 実際に採取された検 体の分析にぉ ヽて、被検出物が検体中に存在しな ヽにもかかわらず陽性と判定して しまう、いわゆる偽陽性が生じることがある。病原体の感染を検査する際に偽陽性反 応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因の特定を遅らせるばか りでなぐ不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をも たらすこともあり得る。従って、偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目 的から見て、極めて重要な課題である。
[0006] 従来、この問題を解決するために検体を高希釈したり、検体を希釈する溶液に、ゥ シ血清アルブミン、界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを含有する緩衝液を用 いたり（特許文献 1参照）、洗浄液として界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを 含有する緩衝液を用いたり（特許文献 1参照）、また、試料を添加する際に濾過フィル ターを通す (特許文献 2参照)などの工夫がなされて ヽる。
[0007] 標識に酵素を用いるフロースルー式メンブランェンザィムィムノアツセィ法は、陽性 シグナルが明瞭で判定し易ぐ高感度測定に向く優れた方法であるが、 1試験項目 毎に、検体試料、酵素標識試薬、洗浄液、基質液を滴下する必要があるために操作 工程数が多ぐ簡易アツセィ法としては問題である。
[0008] 一般に、診療において急性気道感染症は、もっとも重要な位置を占める。咳を伴う 有熱性気道感染症の原因病原体は、 A型インフルエンザウイルス、 B型インフルェン ザウィルス、 RSウィルス（RSV)、ライノウィルスなどであり、冬季を中心にこれらのウイ ルス感染が発生する。これらのウィルスを一つのアツセィ装置で同時に迅速簡便に 高感度測定し、原因ウィルスの特定ができれば臨床医にとって貴重な情報となり、診 療の質が飛躍的に向上すると云われている。
[0009] また、小児の感染性胃腸炎の原因病原体は、夏季を除くと、ほとんどがウィルスで あると云われ、ロタウィルス、ノロウィルス、アデノウイルス、ァストロウィルスなどが挙げ られ、迅速な原因ウィルスの特定が急性気道感染症同様に望まれて ヽる。
[0010] 以下に、特許文献 2中に記載されている酵素標識抗体を用いる一つのアツセィ装 置で 1項目測定を行うフロースルー式アツセィ法（フロースルー式メンブランェンザィ ムィムノアッセィ法)の操作手順の一例を示す。
[0011] (1)患者カゝら採取した検体を緩衝液に浮遊させて検体試料を調製し、濾過フィルタ 一を用いて濾過し、アツセィ装置に滴下する。 [0012] (2)酵素標識抗体を滴下する。
[0013] (3)洗浄液を滴下する。
[0014] (4)基質液を滴下し、発色反応させる。
[0015] (5)反応停止液を滴下する。
[0016] (6)メンブラン上の発色の有無により判定する。
[0017] このように、従来法は被検出物の検出までに多くの工程を必要とし操作時間もかか る。
特許文献 1：特開 2003 - 279577号公報
特許文献 2：特開 2004 - 28875号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 従って、本発明は、検体試料に含まれる被検出物を検出するためのフロースルー 式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置にぉ 、て、検体試料中に存在する被検出 物質が何であるかを特定するために、一つのアツセィ装置で複数の被検出物質種（ 測定項目）を同時に試験して陽性反応を示す被検出物質が何である力を特定する 方法の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0019] 本発明者は、鋭意研究の結果、緩衝液等で希釈して調製した検体試料を複数の 被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部に添加し、さら に濾過フィルターを用いて濾過した後に、複数の被検出物を捕捉するための複数の 捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランを備えたアツセィ装置のメンブラ ン上に添加することにより上記目的を達成することができることを見出した。さらに、本 発明者は、酵素標識試薬部と濾過フィルターの一方または両方を備えたアダプター（ 検体試料供給装置)または検体試料添加用デバイスを用い、緩衝液等で希釈して調 製した検体試料を該アダプター (検体試料供給装置)または検体試料添加用デバイ スに添加し濾過した後に、前記メンブラン上に添加することにより上記目的を達成す ることができることを見出し、本発明を完成させた。
[0020] すなわち、酵素標識試薬部を備えたアダプター (検体試料供給装置)または検体 試料添加用デバイスに検体試料を加えて、酵素標識試薬と検体試料を混合した後、 アダプター (検体試料供給装置)または検体試料添加用デバイスを用いて濾過して、 複数の被検出物を捕捉するための複数の捕捉試薬が離れた位置に結合したメンブ ランを備えたアツセィ装置のメンブラン上に滴下し、被検出物を捕捉試薬に捕捉させ 、捕捉試薬 被検出物—酵素標識試薬カゝらなる免疫複合体を形成させ、続いて、前 記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する工程力 なる複数項目同時試 験のためのフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ方法により、検体試料 中の被検出物質が何である力を特定できることを見出し、本発明を完成させるに至つ た。
[0021] すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
[0022] [1] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合した メンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流 部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標 識試薬部を含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置を用いて複 数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法であって、
(0 検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬 混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、 被検出物が捕捉試薬に捕捉されることにより、捕捉試薬—被検出物—酵素標識試薬 からなる免疫複合体が形成され、次いで
GO 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する、
工程を含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法、
[2] フロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置が検体試料供給装置を 一体として含み、該検体試料供給装置が濾過フィルターおよび Zまたは酵素標識試 薬部を含む、 [1]の方法、
[3] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合した メンブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る 複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添力,デバイスを別 体として含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置を用いて複数の 被検出物を 1回のアツセィで検出する方法であって、
(0 検体試料を検体試料添加用デバイスに添加し、その結果検体試料添加用デバイ スに含まれる酵素標識試薬部の酵素標識試薬および検体試料の混合物が形成され
GO 検体試料添加用デバイスから検体試料および酵素標識試薬混合物をメンブラン 上に添カ卩し、次いで
(iii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に添加する、
工程を含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法、
[4] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、 複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料力もなる [1]〜[3]のいずれ かの複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法、
[5] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記 被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵 素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものであ る、 [1]〜[4]のいずれかの複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法、
[6] 検体試料を緩衝液または生理食塩水で希釈して用いる [1]〜[5]の ヽずれかの 複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法、
[7] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合した メンブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る 複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料供給装置を一体として 含む、複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メンブラン ェンザィムィムノアッセィ装置、
[8] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合した メンブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る 複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添力,デバイスを別 体として含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メン ブランェンザィムィムノアッセィ装置、
[9] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、 複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料力もなる [7]または [8]の複数 の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メンブランェンザィム ィムノアッセィ装置、ならびに
[10] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記 被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵 素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものであ る、 [7]〜[9]のいずれかの複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロー スノレ一式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置。
発明の効果
[0023] 本発明の方法は、異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた 位置に結合したメンブランおよび前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識 試薬を含む酵素標識試薬部を用いるため、 1回のアツセィで少ない工程数で、複数 の被検出物を同時に検出することができる。複数の被検出物の同時検出が可能なた め、一つのアツセィ装置を用いて、 1回のアツセィで複数の被検出物種を同時に試験 して、陽性反応を示す被検出物質が何であるかを簡便 '迅速に特定でき、使い勝手 のよい信頼性の高いアツセィ方法を提供することができる。さらに、本発明の方法に ぉ 、て、濾過フィルターおよび前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試 薬を含む酵素標識試薬部を含むアダプター (検体試料供給装置)または検体試料添 加用デバイスを用いることにより、被検出物と酵素標識試薬の混合および濾過がほ ぼ同時に効率よく行われ、高感度かつ簡便 ·迅速なアツセィを行うことができる。
[0024] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-000856号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]本発明の一実施態様であるフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ 装置の平面図である。
[図 2]図 1の I Γ切断断面図である。
[図 3]本発明において使用される検体試料添加用チューブの一実施態様を示す図で ある。 [図 4]図 3の検体試料添加用チューブ先端部の透視図である。
符号の説明
[0026] A:穴
B :穴
a :アダプター
b :メンブラン
c :液体吸収部材
d：検体試料添加用チューブ先端部
e：検体試料添加用チューブ本体部
f :濾過フィルター
g :酵素標識試薬部
発明を実施するための最良の形態
[0027] 以下に本発明を詳しく説明する。
[0028] 本発明の方法は、一つのアツセィ装置で複数項目を 1回のアツセィで同時に試験 することにより検体試料中の被検出物質が何であるかを迅速'簡便に特定できること を特徴とする。
[0029] 本発明の方法において、異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに 離れた位置に結合したメンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよ び濾過フィルター上流部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素 標識試薬を含む酵素標識試薬部を含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノア ッセィ装置を用いて複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する。さらに、異なる被 検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランなら びに濾過フィルターおよび前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬 を含む酵素標識試薬部を含むアダプター (検体試料供給装置)または検体試料添加 用デバイスを含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置を用いて複 数の被検出物を 1回のアツセィで検出する。
[0030] 本明細書に!/、うメンブランを含むアツセィ装置 (メンブランアツセィ装置とも 、う）とは 、検出しょうとする複数の被検出物質に特異的に結合する捕捉試薬がそれぞれ離れ た位置に固相化されたメンブランを含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノア ッセィ法を利用するアツセィ装置であることが好ましい。
[0031] フロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置は、具体的には、例えば図 1及び 2に示されるような装置である。図 1および図 2に示す装置は、後述の検体試料 添加用デバイスを別体として含む装置である。
図 1は装置の平面図であり、図 2は、図 1の I I '切断断面図である。図 1及び 2にお いて、 aは、調製した検体試料を酵素標識試薬部を備えた検体試料添加用デバイス を用いて濾過して滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴 (Aホ ール及び Bホール)を備えたアダプターである。 bは被検出物に特異的に結合する捕 捉試薬が結合したメンブランであり、 cは液体を吸収する部材 (液体吸収部材)である
[0032] アダプター aの底面部の検体試料が通過するための穴の数を増やすことにより、更 に多くの項目の同時試験に対応することができ、その数は 1〜5項目程度、例えば 2 項目、 3項目、 4項目または 5項目が好まし 、が、これらに限定されな!、。
[0033] メンブランアツセィ装置中のメンブランの材質としては、不織布、紙、ニトロセルロー ス、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ナイロン 6、 6及びセルロースエス テルと-トロセルロースの混合物からなる群が挙げられ、特に好ましくは-トロセル口 ース力 作られた微多孔性物質があげられる。また、前記セルロースエステルと-トロ セルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブランの孔径あるいは保 留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上であり、かつ l〜12 /z mで あることが好ましぐ 3〜5 /ζ πιが特に好ましい。また、メンブランの厚さは特に限定さ れないが、通常、 100〜200 m程度である。
[0034] メンブランアツセィ装置のメンブラン表面には、捕捉試薬が固相化 (結合)される。捕 捉試薬としては、被検出物と抗原抗体反応により特異的に結合し抗原抗体複合体を 形成することにより被検出物を捕捉する抗原または抗体が挙げられるが、抗原または 抗体に限定されず、リガンド-レセプターの関係で互いに結合し得る物質の場合、一 方を他方を捕捉するための捕捉試薬として用いることができる。従って、被検出物に 応じて、それに結合し得る異なる捕捉抗原または抗体を使用すればよい。例えば、 被検出物が細菌、ウィルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに 対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げら れる。捕捉試薬は、メンブラン装置のアダプター aの底面部の穴部分に対応する部位 のメンブラン表面に固相化すればよい。このように固相化することにより、アダプター a に添加した検体試料および Zまたは酵素標識試薬は、アダプター a底面の穴を通りメ ンブラン上の捕捉試薬を固相化した部位に到達するので、該部位で効率的に結合 反応が生じる。
[0035] このような捕捉試薬を上述したメンブランに結合させる方法としては、物理的吸着で あってもよぐまたは化学的な結合によるものであってもよい。捕捉試薬が結合したメ ンブランの調製は、例えば、捕捉試薬を緩衝液等で希釈した溶液をメンブランに塗 布して、その後乾燥することにより行われる。
[0036] 本発明において、複数の被検出物を 1回のアツセィで同時に検出し得る。このため 、メンブラン上には、それぞれの被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が結合され る。この際、それぞれの捕捉試薬は、メンブラン上で離れて結合される。ここで、「離 れて結合」とは、メンブラン上のそれぞれの捕捉試薬が結合した部位同士が重なるこ とも接触することもないことをいう。この場合、固相化された捕捉試薬部位に対応する メンブラン装置のアダプター aの底面部の穴部分もアダプター aの底面部において離 れて設けられる。
[0037] 本発明のメンブランアツセィ装置は、その他メンブランを通過した液体を吸収する液 体吸収部材等を含んでいてもよい。該液体吸収部材は、メンブランの下流に含まれ る。
[0038] 本明細書にいう被検出物は、何ら限定されず、例えば、それに対応する抗体を作 製することができるあらゆる抗原物質が挙げられる。例として、 A型インフルエンザウイ ルス、 B型インフルエンザウイルス、 RSウィルス（RSV)、ライノウィルス、ロタウィルス 、ノロウィルス、アデノウイルス、ァストロウィルス、 HAV、 HBs、 HCV、 HIV, EBV等 のウィルス抗原、クラミジァ 'トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、へリコパクター 'ピロリ 、レプトスビラ、トレポネーマ'パリダム、トキソプラズマ'ゴンディ、ボレリア、レジオネラ 属菌、炭疽菌、 MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗 原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイ ド、ェピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミン B類等のビタミン類、プロス タグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホル モン等を挙げることができる。また、被検出物としてこれらに対する抗体も挙げられる
[0039] 検体は、例えば患者の咽頭あるいは鼻腔等力 滅菌綿棒等の検体採取器具を使 用して採取した咽頭あるいは鼻腔ぬぐい液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液 、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液等を用いることができる力 このようにして得られ た検体は、緩衝液等で希釈してアツセィを行う。検体の希釈に用いる緩衝液としては 、ェンザィムィムノアツセィ、免疫凝集法等の免疫学的手法による抗原検出または定 量において通常使用される緩衝液を使用することができる。より具体的には、トリス緩 衝液、グッド緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。また、生理的食塩水 を用いてもよい。
[0040] また、検体が患者の咽頭あるいは鼻腔等力も滅菌綿棒等の検体採取器具を使用し て採取した咽頭ある!/、は鼻腔ぬぐ!、液、咽頭ある!/、は鼻腔洗浄液等の粘性を有する 場合、検体を希釈する緩衝液等中に検体が浮遊する。この場合、該緩衝液等を検体 浮遊用緩衝液等という。
[0041] 検体を希釈する緩衝液には、界面活性剤 0. 2〜： LO(w/v)%、ゥシ血清アルブミン（ BSA)等の動物由来血清アルブミン l〜5(w/v)%、または適当な濃度の無機塩等を 含有させることができ、これらの緩衝液を使用して希釈することにより、検体中に含ま れる被検出物以外の成分の、メンブラン自体への結合ゃメンブラン上の捕捉試薬へ の非特異的な結合を低減させることができ好ましい。
[0042] 界面活性剤としては、 Triton X— 100 (商品名）：ポリエチレングリコールモノ一 p イソォクチルフエ-ルエーテル、 Tween 20 :ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ レート、 Tween 80 :ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、 Nonidet P— 40 : ノ-デット P— 40、 ZWITTERGENT 3— 14 :n—テトラデシル一 N, N ジメチル - 3—アンモ-ォ 1 プロパンスルホネ ト、 CHAPS： 3—〔（3 コラミドプロピル） ジメチルアンモ -ォ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)等あるいは これらを 2種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。
[0043] 酵素標識試薬は、被検出物に特異的に結合する物質を酵素で標識した試薬であり 、被検出物に特異的に結合する物質は、例えば被検出物と特異的に結合する抗原 または抗体である。例えば、被検出物がウィルス、細菌の抗原物質である場合には、 そのウィルス抗原、細菌抗原に対する抗体であって、酵素で標識化されたものである
[0044] 捕捉試薬と同様に被検出物に対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体 、モノクローナル抗体等が使用される。なお、捕捉試薬と酵素標識試薬は、被検出物 の異なる部分に結合するものが望ましいが、捕捉試薬および酵素標識試薬が被検出 物の同じ部分に結合する場合であっても、被検出物に該結合部分が複数存在する 場合は問題ない。例えば、被検出物が抗原であって、捕捉試薬と酵素標識試薬が該 抗原に対する抗体である場合、両抗体は被検出物が有する異なるェピトープに結合 する抗体が望ましいが、被検出物に同じェピトープが複数存在する場合 (例えば、抗 原が同じサブユニットを複数有する多量体の場合等）は、両抗体が同じェピトープに 結合する抗体であっても用いることができる。
[0045] このような酵素標識試薬は、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法に より検出可能な物質を生成する該酵素の基質液を添加することにより、複合体の検 出を行うことができる。
[0046] 酵素標識に使用される酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルォキシ ダーゼが挙げられる。酵素の抗原または抗体への標識は公知の方法で行うことがで きる。
[0047] 酵素標識試薬は、酵素標識試薬部に含まれる。酵素標識試薬部は液体でも、固体 でもよい。液体の場合、酵素標識試薬部に酵素標識試薬溶液を入れておけばよぐ 固体の場合、酵素標識試薬を含浸させた固体ある!ヽは酵素標識試薬の凍結乾燥品 等を入れておけばよい。酵素標識試薬部に検体試料を添加することにより、酵素標 識試薬部に含まれる酵素標識試薬と検体試料が混ざり混合物を形成する。この際、 酵素標識試薬部が固体の場合、固体中の酵素標識試薬が検体試料中に溶解し、酵 素標識試薬と検体試料の混合物を形成する。酵素標識試薬部が固体に含浸されて なぐ液体または凍結乾燥品等の場合、検体試料添加用デバイス中に添加された酵 素標識試薬自体を酵素標識試薬部という。酵素標識試薬部は、メンブランおよび濾 過フィルターの上流に設けられる。ここで、上流とは、フロースルー式メンブランェン
Figure imgf000014_0001
、て、液体検体試料等を装置に添加した後に液体が 移動する際の、試料等の流れにおける上流を意味する。例えば、図 1の装置におい て、アダプター内部の穴の上または下に濾過フィルターおよび固体状または液体状 の酵素標識試薬部を設けてもよぐまたアダプター内部の穴の下に濾過フィルターを 設け、穴の上に酵素標識試薬部を設けてもよい。この場合、アダプター内部で、酵素 標識試薬が検体試料と混合され、穴を通って濾過フィルターを通過した後に、メンブ ランに添加される。酵素標識試薬部が固体の場合、酵素標識試薬を吸水性の材質 に含浸させておけばよい。例えば、スポンジ及びガラス繊維などでできた不織布等の 材質が用いられ、酵素で標識した標識抗原または抗体が乾燥状態で含有されて ヽる 。酵素標識試薬部は、上記の吸水性の材質に標識抗原または抗体を含浸させ、乾 燥させればよい。酵素標識試薬部は、あら力じめあるいはアツセィ時にアダプター a部 に入れて用いてもよい。
[0048] また、濾過フィルタ一は、メンブランの上流であって、上記酵素標識試薬部の下流 に設けられる。濾過フィルタ一はあら力じめ、あるいはアツセィ時にアダプター a部に 入れて用いてもよい。酵素標識試薬と混合した検体試料は、濾過フィルターを通るこ とにより、濾過されメンブランに添加される。濾過フィルタ一は、例えば上記アツセィ装 置の検体を滴下する開口部に設けることができる。患者力も採取した検体を緩衝液 で希釈して調製した検体試料は、酵素標識試薬部で酵素標識試薬と混ざり濾過フィ ルターにより濾過される。濾過フィルターの孔径（直径)または保留粒子径は、 0. 1〜 0. 6 ^ mで teる。
[0049] 濾過フィルターの孔径あるいは保留粒子径は、非特異的反応を低減するうえで極 めて重要である。孔径あるいは保留粒子径が大きすぎるとメンブラン上で非特異的結 合が起こって偽陽性を示す場合がある。逆に小さすぎると検体試料中に存在する粘 性物や凝集物のためにフィルター自身が詰まってしま 、濾過が不可能である力、あ るいはフィルター面積をかなり広くしなければならず、簡易検査方法に用いるという目 的からみて不適切である。
[0050] 濾過フィルターの材質は、特に限定されな!、が、好ましくはガラス繊維又は-トロセ ルロースである。
[0051] 上記のように、本発明のアツセィ装置において、アダプタ一は濾過フィルターと酵素 標識試薬部の一方または両方を含むことができるとともに、検体試料をアツセィ装置 に供給するための装置として機能する。この点、本発明のアダプタ一は検体試料供 給装置ということもできる。本発明のアツセィ装置は、濾過フィルターと酵素標識試薬 部の一方または両方を含むアダプター (検体試料供給装置)を一体として含む装置 でもあるが、この場合の一体として含むとは、アツセィ時にアダプターがアツセィ装置 に装着されることをいう。この点、濾過フィルターと酵素標識試薬部の一方または両 方を含むアダプター (検体試料供給装置)がー体として使用される装置ともいえる。 従って、アツセィを行う前は、アダプタ一はアツセィ装置と別体として存在していてもよ い。
[0052] また、本発明にお 、て、濾過フィルターと酵素標識試薬部の一方または両方を含 む検体試料添加用デバイスを用いてもょ ヽ。濾過フィルターおよび酵素標識試薬部 は、検体試料添加用デバイス、上記のアダプター (検体試料供給装置)のいずれか に含まれて 、ればよ 、。濾過フィルターおよび酵素標識試薬部の両方がアダプター (検体試料供給装置）に含まれる場合は、本発明の装置において検体試料添加用デ バイスは含まれて 、る必要はな 、。
[0053] 検体試料添加用デバイスは、濾過フィルターを備えたィムノアッセィ装置に検体試 料を添加するための容器状のデバイスであり、例えばチューブ状のデバイスである（ 検体試料添加用チューブ)。上記濾過フィルタ一は、本発明の簡易アツセィ法または キットにおいて、検体試料添加用デバイスの先端に取り付けて使用されることが好ま しい。すなわち例えば、検体試料添加用デバイス中に緩衝液で検体を希釈して調製 した検体試料を ヽれて、該デバイスの先端に酵素標識試薬部を備えた濾過フィルタ 一を取り付け、検体試料と酵素標識試薬部の酵素標識試薬を混合させた後、濾過フ ィルターを通して濾過し、濾液をアツセィ装置中のメンブランに滴下する方法が簡便 であり、好ましい。 [0054] チューブ状の検体試料添加用デバイス (検体試料添加用チューブ)の一実施態様 の模式図を図 3及び図 4に示す。図 3と図 4の態様において、酵素標識試薬部 gは、 酵素標識試薬を含浸させた固体が用いられている。検体試料添加用チューブは例 えば図 3に記載されるように先端部 dと本体部 eからなる形状であり、先端部 dの内部 に図 4に示されるように酵素標識試薬部 gならびに濾過フィルター fが備えつけられて いる。本体部 eの内部に緩衝液で検体を希釈して調製した検体試料を入れ、本体部 eに酵素標識試薬部ならびに濾過フィルター fを備えた先端部 dを取り付ける。検体試 料で酵素標識試薬部の酵素標識試薬を溶解した後、濾過フィルター fを通して検体 試料を濾過し、濾液をアツセィ装置のメンブレンに滴下する。本体部 eがポリエチレン 、ポリエチレンテレフタレート（PET)等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィル ターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易にかつ簡便 に検体試料を濾過することができるため、好まし 、。
[0055] 酵素標識試薬部 gは、検体試料添加用チューブの先端部 dに図 4のように検体試料 が酵素標識試薬部 gに接触した後に、濾過フィルターを通るように装着されることが好 ましい。
[0056] 以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明す る。
[0057] (1)患者から採取した検体を緩衝液等で希釈して検体試料を調製し、アツセィ装置 の酵素標識試薬部に添加する。この際、検体試料により、酵素標識試薬部に含まれ る酵素標識試薬が溶解し、検体試料中の被検出物と酵素標識試薬の混合物が酵素 標識試薬部の下流の濾過フィルターを通って、メンブランに添加される。
[0058] (2)基質液を滴下し、発色反応させる。
[0059] (3)メンブラン上の発色の有無により判定する。
[0060] さらに、濾過フィルター装置を用いた方法についての具体的な手順の一例を示し、 本発明を説明する。
[0061] (1)患者カゝら採取した検体を緩衝液等で希釈して検体試料を調製し、濾過フィルタ 一および Zまたは酵素標識試薬部を備えたアダプター (検体試料供給装置)または 検体試料添加用デバイスを用いて濾過し、アツセィ装置に滴下する。 [0062] (2)基質液を滴下し、発色反応させる。
[0063] (3)メンブラン上の発色の有無により判定する。
[0064] 基質液は、酵素標識試薬の標識として用いた酵素に対する基質であって、該酵素 により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するもの が使用される。具体例としては、 5—ブロモ—4—クロ口— 3—インドリルリン酸 トロ テトラゾリゥムブルー、テトラメチルベンチジンがあげられる。
[0065] また、補酵素 NADPH (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）をアル カリホスファタ一ゼの基質に用い、エチルアルコールとテトラゾリゥム塩の存在下でァ ルコール脱水素酵素、ジァホラーゼにより酵素的にシグナルを増幅する、いわゆる酵 素サイクリング反応試薬が巿販 (AmpliQ ダコ社)されている力 酵素サイクリング反 応試薬も好適に使用できる。
[0066] 基質液は、メンブラン上に滴下したとき、基質液の大部分は短時間の内にメンブラ ンを通過し液体吸収部材に吸収され、メンブランに残った基質液が標識酵素により 発色反応する。従って、メンブランを通過する基質液は、洗浄作用を発揮しているこ とになるので、一般的にェンザィムィムノアッセィに使用される界面活性剤を基質液 に加えて、更に洗浄作用を上げて非特異的結合を低減することができる。
[0067] 界面活性剤の濃度は 0. 02〜： L(w/v)%であることが好ましい。
[0068] 所定の反応時間で判定を行う場合は、反応停止液を滴下する操作は必要な ヽ。
[0069] 所定の反応時間で判定できない場合は、反応停止液を滴下して反応を止めておき 、後で判定してもよい。
実施例
[0070] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
[0071] 実施例
1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
(1)抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体
A型インフルエンザウイルス抗原を BALBZcマウスに免疫し、一定期間飼育したマ ウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al.， Nature, vol, 256, p495- 497(19 75))によりマウスミエローマ細胞 (P3 X 63)と融合した。得られた融合細胞 (ハイブリド 一マ）を、 37°Cインキュベータ一中で維持し、 A型インフルエンザウイルス NP抗原を 固相したプレートを用いた ELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純ィ匕 (単クローン化）を行った。取得した該細胞 2株をそれぞれプリスタン処理した BALB Zcマウスに腹腔投与し、約 2週間後、抗体含有腹水を採取した。
[0072] 得られた腹水からプロテイン Aカラムを用いたァフィユティークロマトグラフィー法に より、それぞれ IgGを精製し、 2種類の精製抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体を 得た。
[0073] (2)抗 B型インフルエンザウイルス NP抗体
B型インフルエンザウイルス抗原を用い、（1)と同様の方法で、 2種類の精製抗 B型 インフノレエンザゥイノレス NP抗体を得た。
[0074] (3)抗 RSウィルス NP抗体
RSウィルス抗原を用い、（1)と同様の方法で、 2種類の精製抗 RSウィルス NP抗体 を得た。
[0075] 2.酵素標識抗インフルエンザウイルス抗体の作製
(1)酵素標識抗 A型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体のうち 1種類につ!、て 45mgを 0. 1Mク ェン酸緩衝液 (PH3. 6)で透析後、ペプシン lOmgを添カ卩し、 37°Cで 1時間、 Fab' 消化処理を行った。処理液をウルトロゲル AcA34カラムで分画して抗 A型インフルェ ンザウィルス NP抗体 F (ab') 精製画分を得た。前記画分を約 lOmgZmLまで濃縮
2
後、 0. 1Mメルカプトェチルァミンと 10 : 1の体積比で混合し、 37°Cで 90分間還元処 理を行った。処理液をウルトロゲル AcA34カラムで分画して抗 A型インフルエンザゥ ィルス NP抗体 Fab'精製画分を得た後、約 lmLにまで濃縮した。
[0076] lOmgZmLのアルカリホスファターゼ 1. 5mLを ImM塩化マグネシウムならびに 0 . ImM塩化亜鉛を含む 50mMホウ酸緩衝液 (pH7. 6)に透析後、 N—（6—マレイミ ドカプロィルォキシ)スクシンイミド 0. 7mgを添加し、 30°Cで 1時間処理した。処理後 の溶液をセフアデックス G— 25カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド— アルカリホスファターゼを得た後、約 lmLにまで濃縮した。 [0077] 濃縮した抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体 Fab'とマレイミドーアルカリホスファ ターゼを 1 : 2. 3の蛋白比で混合し、 4°Cで 20時間穏やかに撹拌して反応させ、アル カリホスファターゼ標識抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体 Fab'を得た。更に、反 応液をウルトロゲル AcA34カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリホスフ ァターゼ標識抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体 Fab'を得た。精製アルカリホスフ ァターゼ標識抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体 Fab'は、 0. 15M塩化ナトリウム 、 4% (WZV)ゥシ血清アルブミン、 1. 5mM塩化マグネシウム、 0. 15mM塩化亜鉛 、 1% (W/V) Triton X— 100、0. 09%アジ化ナトリウムを含む 25mMトリス緩衝 液 (pH8. 0)の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、 0. 22 m孔径の濾過 フィルターで濾過し、酵素標識抗 A型インフルエンザウイルス抗体を得た。
[0078] (2)酵素標識抗 B型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗 B型インフルエンザウイルス NP抗体のうち 1種類について、（1)と同様の方 法で、酵素標識抗 B型インフルエンザウイルス抗体を得た。
[0079] (3)酵素標識抗 RSウィルス抗体の作製
精製抗 RSウィルス NP抗体のうち 1種類について、（1)と同様の方法で、酵素標識 抗 RSウィルス抗体を得た。
[0080] A型、 B型インフルエンザウイルス検出用アツセィ装置（2項目用）の作製
インフルエンザウイルス検出用アツセィ装置は、図 1及び図 2に示すものと同様の構 成のものを用いた。メンブランは、孔径 3 mを有する-トロセルロースメンブラン（サ ィズ 2 X 3cm、厚さ 125 m)を用いた。メンブランへの捕捉抗体の固相は、 2種類の 抗体溶液を-トロセルロースメンブランへスポットして行った。装置の Aホールには精 製抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体のうち標識に用いなかったものを lmgZm Lに含まれるように精製水を用いて希釈して 0. 22 μ m孔径の濾過フィルターで濾過 したものを 3 μ L、 Bホールには精製抗 B型インフルエンザウイルス NP抗体のうち標 識に用いなカゝつたものを lmg/mLが含まれるように精製水を用いて希釈して 0. 22 μ m孔径の濾過フィルターで濾過したものを 3 μ L、それぞれスポットした。スポット後 、 45°Cの乾燥庫で 40分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用アツセィ装置 を作製した。次いで、酵素標識試薬部ならびに濾過フィルターを備えた検体試料添 加用デバイスを図 3及び図 4に示すものと同様の構成で作製した。該酵素標識試薬 部は、酵素標識抗 A型インフルエンザウイルス抗体ならびに酵素標識抗 B型インフル ェンザウィルス抗体を至適濃度に混合して 150 μ Lを直径 9mm、厚さ 4mmのポリビ ニルスポンジに含浸させて乾燥し、検体試料添加用チューブ先端部に取り付けて作 製した。
[0081] A型、 B型インフルエンザウイルスの検出
検体試料として、滅菌綿棒を用いて鼻腔カゝら採取した検体を緩衝液 (Triton X- 100 l(w/v)%、ゥシ血清アルブミン 4(w/v)%、塩化ナトリウム 0. 15M、アジ化ナ トリウム 0. 09(w/v)%を含む 50mMトリス緩衝液、 pH8. 0)で希釈して調製した、 PCR法で A型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試料 1 PCR法で B型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試料 2 PCR法で A型、 B型インフルエンザウイルス陰性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試 料 3
を用いた。
[0082] これらの検体試料は、緩衝液が入った検体試料添加用チューブ本体部内で調製し た。
[0083] 試験
調製した検体試料が入った検体試料添加用チューブ本体部に酵素標識試薬を含 む酵素標識試薬部を備えた検体試料添加用チューブ先端部を取り付け、検体試料 で酵素標識試薬を溶解した後、濾過フィルターで濾過し、アツセィ装置のアダプター 開口部に 150 L滴下し、ニトロセルロースメンブランの下部に備えられた液体吸収 部材に試料が完全に吸収されるまで静置した。
[0084] 次にアダプターを取り除き、基質液（5 ブロモー 4 クロロー 3 インドリルリン酸 0. 15mgZmL、ニトロテトラゾリゥムブルー 0. 3 mg/mL,塩ィ匕マグネシウム 5 mM、 Triton X— 100 0. l(w/v)%、アジ化ナトリウム 0. 09(w/v)%を含む 0. 1 M トリス緩衝液、 pH9. 5)を 250 μ L滴下し、発色反応を開始させた。
[0085] 10分後に鉛直上方力 観察し、 Αホール部のメンブランにのみ発色が認められた 場合には A型インフルエンザウイルス陽性、 Bホールのメンブランにのみ発色が認め られた場合には B型インフルエンザウイルス陽性、 A、 B両ホールのメンブランとも発 色が認められない場合には陰性と判定した。
[0086] 結果
検体試料として A型インフルエンザウイルス陽性の検体試料 1を用いた時、 Aホー ル部のメンブランは陽性となり、 Bホール部のメンブランは陰性となり特異的に A型ィ ンフルェンザウィルスを検出できることが確かめられた。
[0087] 検体試料として B型インフルエンザウイルス陽性の検体試料 2を用いた時、 Aホー ル部のメンブランは陰性となり、 Bホールのメンブランは陽性となり特異的に B型インフ ルェンザウィルスを検出できることが確かめられた。
[0088] また、検体試料として A型、 B型インフルエンザウイルス陰性の検体試料 3を用いた 時、 Aホール部、 Bホールのメンブラン共に陰性であった。
[0089] 得られた結果を表 1に示す。
[表 1]
A型、 B型インフルエンザウイルスの検出 本発明法 P C R法
A型ホール B型ホール
検体試料 1 + - + (A型)
検体試料 2 - + + (B型)
検体試料 3 — - 判定基準
+ ： 胄の着色が見られるもの
― ： 青の着色が見られないもの
[0090] 表 1に示すように、インフルエンザウイルス A型、 B型を特異的に同時に検出でき ることがゎカゝる。
[0091] A型、 B型インフルエンザウイルス、 RSウィルス (RSV)検出用アツセィ装置（3項目用 )の作製
アダプターに 3ケの穴（ホール）を設けて、 A型、 B型インフルエンザウイルス、 RSゥ ィルスの 3項目（Aホール： A型インフルエンザウイルス、 Bホール： B型インフルエンザ ウィルス、 Cホール: RSウィルス）を検出するアツセィ装置を上記同様に作製した。次 Vヽで、酵素標識試薬部ならびに濾過フィルターを備えた検体試料添加用デバイスを 上記同様の構成で作製した。該酵素標識試薬部は、酵素標識抗 A型インフルエンザ ウィルス抗体、酵素標識抗 B型インフルエンザウイルス抗体ならびに酵素標識抗 RS ウィルス抗体を至適濃度に混合して上記同様乾燥し、検体試料添加用チューブ先 端部に取り付けて作製した。
[0092] A型、 B型インフルエンザウイルス、 RSウィルスの検出
検体試料として、上記と同様に調製した、
PCR法で A型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試料 4 PCR法で B型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試料 5 PCR法で RSウィルス陽性と判定された鼻腔ぬぐ 、液：検体試料 6
PCR法で A型、 B型インフルエンザウイルス陰性、 RSウィルス陰性と判定された鼻腔 ぬぐい液:検体試料 7
を用いた。
[0093] 試験
上記同様に行った。
[0094] 結果
検体試料として A型インフルエンザウイルス陽性の検体試料 4を用いた時、 Aホー ル部のメンブランは陽性となり、 Bホール部、 Cホール部のメンブランは陰性となり特 異的に A型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
[0095] 検体試料として B型インフルエンザウイルス陽性の検体試料 5を用いた時、 Bホール 部のメンブランは陽性となり、 Aホール部、 Cホール部のメンブランは陰性となり特異 的に B型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
[0096] 検体試料として RSウィルス陽性の検体試料 6を用いた時、 Cホール部のメンブラン は陽性となり、 Aホール部、 Bホール部のメンブランは陰性となり特異的に RSウィルス を検出できることが確かめられた。
[0097] また、検体試料として A型、 B型インフルエンザウイルス陰性、 RSウィルス陰性の検 体試料 7を用いた時、 Aホール部、 Bホール部、 Cホール部のメンブラン共に陰性で あった。
得られた結果を表 2に示す。
[表 2]
A型、 B型インフルエンザウイルス、 R Sウィルスの検出 本発明法 P C R法 B型ホール Cホール
検体試料 4 + (A型） 検体試料 5 + + (B型） 検体試料 6 + + (R S V) 検体試料 7 判定基準
+ 青の着色が見られるもの
青の着色力 S見られないもの
[0099] 表 2に示すように、インフルエンザウイルス A型、 B型、 RSウィルスを特異的に同時 に検出できることがわかる。
[0100] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメン ブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流部に 位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試 薬部を含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置を用いて複数の 被検出物を 1回のアツセィで検出する方法であって、
(0 検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬 混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、 被検出物が捕捉試薬に捕捉されることにより、捕捉試薬—被検出物—酵素標識試薬 からなる免疫複合体が形成され、次いで
GO 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する、
工程を含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法。
[2] フロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置が検体試料供給装置を一 体として含み、該検体試料供給装置が濾過フィルターおよび Zまたは酵素標識試薬 部を含む、請求項 1記載の方法。
[3] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメン ブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る複 数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体と して含むフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置を用いて複数の被検 出物を 1回のアツセィで検出する方法であって、
(0 検体試料を検体試料添加用デバイスに添加し、その結果検体試料添加用デバイ スに含まれる酵素標識試薬部の酵素標識試薬および検体試料の混合物が形成され
GO 検体試料添加用デバイスから検体試料および酵素標識試薬混合物をメンブラン 上に添カ卩し、次いで
(iii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に添加する、
工程を含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法。
[4] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複 数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料力 なる請求項 1〜3のいずれ 力 1項に記載の複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法。
[5] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検 出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標 識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、請 求項 1〜4のいずれか 1項に記載の複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方 法。
[6] 検体試料を緩衝液または生理食塩水で希釈して用いる請求項 1〜5の!ヽずれか 1 項に記載の複数の被検出物を 1回のアツセィで検出する方法。
[7] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメン ブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る複 数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料供給装置を一体として含 む、複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メンブランェ ンザィムィムノアッセィ装置。
[8] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメン ブランならびに濾過フィルターおよび Zまたは前記異なる被検出物に結合し得る複 数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体と して含む複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メンブラ ンェンザィムィムノアッセィ装置。
[9] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複 数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料力 なる請求項 7または 8に記 載の複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するためのフロースルー式メンブランェ ンザィムィムノアッセィ装置。
[10] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検 出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標 識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、請 求項 7〜9のいずれか 1項に記載の複数の被検出物を 1回のアツセィで検出するため のフロースルー式メンブランェンザィムィムノアッセィ装置。
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