JP2006189304A - 複数の被検出物を検出する簡易アッセイ法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む装置を用いる。(i) 検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、被検出物が捕捉試薬に捕捉されて捕捉試薬−被検出物−酵素標識試薬からなる免疫複合体が形成され、次いで(ii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する。
【選択図】 なし
Description
(1)患者から採取した検体を緩衝液に浮遊させて検体試料を調製し、濾過フィルターを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
(2)酵素標識抗体を滴下する。
(3)洗浄液を滴下する。
(4)基質液を滴下し、発色反応させる。
(5)反応停止液を滴下する。
(6)メンブラン上の発色の有無により判定する。
このように、従来法は被検出物の検出までに多くの工程を必要とし操作時間もかかる。
[1] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含むフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置を用いて複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法であって、
(i) 検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、被検出物が捕捉試薬に捕捉されることにより、捕捉試薬−被検出物−酵素標識試薬からなる免疫複合体が形成され、次いで
(ii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する、
工程を含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法、
[2] フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置が検体試料供給装置を一体として含み、該検体試料供給装置が濾過フィルターおよび/または酵素標識試薬部を含む、[1]の方法、
[3] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体として含むフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置を用いて複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法であって、
(i) 検体試料を検体試料添加用デバイスに添加し、その結果検体試料添加用デバイスに含まれる酵素標識試薬部の酵素標識試薬および検体試料の混合物が形成され、
(ii) 検体試料添加用デバイスから検体試料および酵素標識試薬混合物をメンブラン上に添加し、次いで
(iii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に添加する、
工程を含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法、
[4] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料からなる[1]〜[3]のいずれかの複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法、
[5] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、[1]〜[4]のいずれかの複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法、
[6] 検体試料を緩衝液または生理食塩水で希釈して用いる請求項[1]〜[5]のいずれかの複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法、
[7] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料供給装置を一体として含む、複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置、
[8] 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体として含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置、
[9] 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料からなる[7]または[8]の複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置、ならびに
[10] 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、[7]〜[9]のいずれかの複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置。
(1)患者から採取した検体を緩衝液等で希釈して検体試料を調製し、アッセイ装置の酵素標識試薬部に添加する。この際、検体試料により、酵素標識試薬部に含まれる酵素標識試薬が溶解し、検体試料中の被検出物と酵素標識試薬の混合物が酵素標識試薬部の下流の濾過フィルターを通って、メンブランに添加される。
(2)基質液を滴下し、発色反応させる。
(3)メンブラン上の発色の有無により判定する。
(1)患者から採取した検体を緩衝液等で希釈して検体試料を調製し、濾過フィルターおよび/または酵素標識試薬部を備えたアダプター(検体試料供給装置)または検体試料添加用デバイスを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
(2)基質液を滴下し、発色反応させる。
(3)メンブラン上の発色の有無により判定する。
所定の反応時間で判定を行う場合は、反応停止液を滴下する操作は必要ない。
所定の反応時間で判定できない場合は、反応停止液を滴下して反応を止めておき、後で判定してもよい。
1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNP抗体
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
得られた腹水からプロティンAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、2種類の精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
B型インフルエンザウイルス抗原を用い、(1)と同様の方法で、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
RSウイルス抗原を用い、(1)と同様の方法で、2種類の精製抗RSウイルスNP抗体を得た。
(1)酵素標識抗A型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について45mgを0.1Mクエン酸緩衝液(pH3.6)で透析後、ペプシン10mgを添加し、37℃で1時間、Fab'消化処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体F(ab')2精製画分を得た。前記画分を約10mg/mLまで濃縮後、0.1Mメルカプトエチルアミンと10:1の体積比で混合し、37℃で90分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体Fab'精製画分を得た後、約1mLにまで濃縮した。
精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について、(1)と同様の方法で、酵素標識抗B型インフルエンザウイルス抗体を得た。
精製抗RSウイルスNP抗体のうち1種類について、(1)と同様の方法で、酵素標識抗RSウイルス抗体を得た。
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置は、図1及び図2に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブランは、孔径3μmを有するニトロセルロースメンブラン(サイズ2×3cm、厚さ125μm)を用いた。メンブランへの捕捉抗体の固相は、2種類の抗体溶液をニトロセルロースメンブランへスポットして行った。装置のAホールには精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体のうち標識に用いなかったものを1mg/mLに含まれるように精製水を用いて希釈して0.22μm孔径の濾過フィルターで濾過したものを3μL、Bホールには精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体のうち標識に用いなかったものを1mg/mLが含まれるように精製水を用いて希釈して0.22μm孔径の濾過フィルターで濾過したものを3μL、それぞれスポットした。スポット後、45℃の乾燥庫で40分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置を作製した。次いで、酵素標識試薬部ならびに濾過フィルターを備えた検体試料添加用デバイスを図3及び図4に示すものと同様の構成で作製した。該酵素標識試薬部は、酵素標識抗A型インフルエンザウイルス抗体ならびに酵素標識抗B型インフルエンザウイルス抗体を至適濃度に混合して150μLを直径9mm、厚さ4mmのポリビニルスポンジに含浸させて乾燥し、検体試料添加用チューブ先端部に取り付けて作製した。
検体試料として、滅菌綿棒を用いて鼻腔から採取した検体を緩衝液(Triton X−100 1(w/v)%、ウシ血清アルブミン 4(w/v)%、塩化ナトリウム 0.15M、アジ化ナトリウム 0.09(w/v)%を含む50mMトリス緩衝液、pH8.0)で希釈して調製した、
PCR法でA型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料1
PCR法でB型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料2
PCR法でA型、B型インフルエンザウイルス陰性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料3
を用いた。
これらの検体試料は、緩衝液が入った検体試料添加用チューブ本体部内で調製した。
調製した検体試料が入った検体試料添加用チューブ本体部に酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を備えた検体試料添加用チューブ先端部を取り付け、検体試料で酵素標識試薬を溶解した後、濾過フィルターで濾過し、アッセイ装置のアダプター開口部に150μL滴下し、ニトロセルロースメンブランの下部に備えられた液体吸収部材に試料が完全に吸収されるまで静置した。
検体試料としてA型インフルエンザウイルス陽性の検体試料1を用いた時、Aホール部のメンブランは陽性となり、Bホール部のメンブランは陰性となり特異的にA型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
また、検体試料としてA型、B型インフルエンザウイルス陰性の検体試料3を用いた時、Aホール部、Bホールのメンブラン共に陰性であった。
得られた結果を表1に示す。
アダプターに3ヶの穴(ホール)を設けて、A型、B型インフルエンザウイルス、RSウイルスの3項目(Aホール:A型インフルエンザウイルス、Bホール:B型インフルエンザウイルス、Cホール:RSウイルス)を検出するアッセイ装置を上記同様に作製した。次いで、酵素標識試薬部ならびに濾過フィルターを備えた検体試料添加用デバイスを上記同様の構成で作製した。該酵素標識試薬部は、酵素標識抗A型インフルエンザウイルス抗体、酵素標識抗B型インフルエンザウイルス抗体ならびに酵素標識抗RSウイルス抗体を至適濃度に混合して上記同様乾燥し、検体試料添加用チューブ先端部に取り付けて作製した。
検体試料として、上記と同様に調製した、
PCR法でA型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料4
PCR法でB型インフルエンザウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料5
PCR法でRSウイルス陽性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料6
PCR法でA型、B型インフルエンザウイルス陰性、RSウイルス陰性と判定された鼻腔ぬぐい液:検体試料7
を用いた。
上記同様におこなった。
検体試料としてA型インフルエンザウイルス陽性の検体試料4を用いた時、Aホール部のメンブランは陽性となり、Bホール部、Cホール部のメンブランは陰性となり特異的にA型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
得られた結果を表2に示す。
B:穴
a:アダプター
b:メンブラン
c:液体吸収部材
d:検体試料添加用チューブ先端部
e:検体試料添加用チューブ本体部
f:濾過フィルター
g:酵素標識試薬部
Claims (10)
- 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブラン、メンブラン上流部に位置する濾過フィルターおよび濾過フィルター上流部に位置する前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含むフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置を用いて複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法であって、
(i) 検体試料を酵素標識試薬部に添加し、その結果検体試料および酵素標識試薬混合物が形成され該混合物が濾過フィルターで濾過されてメンブラン上に添加され、被検出物が捕捉試薬に捕捉されることにより、捕捉試薬−被検出物−酵素標識試薬からなる免疫複合体が形成され、次いで
(ii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する、
工程を含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法。 - フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置が検体試料供給装置を一体として含み、該検体試料供給装置が濾過フィルターおよび/または酵素標識試薬部を含む、請求項1記載の方法。
- 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体として含むフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置を用いて複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法であって、
(i) 検体試料を検体試料添加用デバイスに添加し、その結果検体試料添加用デバイスに含まれる酵素標識試薬部の酵素標識試薬および検体試料の混合物が形成され、
(ii) 検体試料添加用デバイスから検体試料および酵素標識試薬混合物をメンブラン上に添加し、次いで
(iii) 前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に添加する、
工程を含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法。 - 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料からなる請求項1〜3のいずれか1項に記載の複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法。
- 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法。
- 検体試料を緩衝液または生理食塩水で希釈して用いる請求項1〜5のいずれか1項に記載の複数の被検出物を1回のアッセイで検出する方法。
- 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料供給装置を一体として含む、複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置。
- 異なる被検出物に結合し得る複数の捕捉試薬が互いに離れた位置に結合したメンブランならびに濾過フィルターおよび/または前記異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部を含む検体試料添加用デバイスを別体として含む複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置。
- 異なる被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬を含む酵素標識試薬部が、複数の酵素標識試薬を含浸させ乾燥させた吸水性材料からなる請求項7または8に記載の複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置。
- 被検出物が抗原または抗体であり、該被検出物に結合し得る捕捉試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原であり、前記被検出物に結合し得る複数の酵素標識試薬が前記被検出物に結合する抗体または抗原を酵素で標識したものである、請求項7〜9のいずれか1項に記載の複数の被検出物を1回のアッセイで検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置。
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