CN109444411A - 一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，包括包被犬细小病毒的毛细管、ALP标记的蛋白G工作液、清洗液、发光底物、犬细小病毒抗体质控品和犬细小病毒抗体标准品。本发明灵敏度高、特异性强、线性范围宽、上样量小、需要的血清样本量小、操作方法简便。

Description

一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种犬细小病毒抗体的检测试剂盒。
背景技术
犬细小病毒病又名犬出血性肠炎，是一种高度接触性传染病，临床以剧烈呕吐、出血性肠炎或非化脓性心肌炎和白细胞显著减少为主要特征，有两种临床表现型，出血性肠炎型和心肌炎型。以幼犬最易感，发病率为50～100％，病死率在10～50％，是危害宠物犬、警犬以及其他犬科动物最重要病原之一。另外，犬细小病毒还可感染狐狸、狼、貉等犬科动物，对我国皮毛动物等特种经济动物养殖业造成巨大的经济损失。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将犬细小病毒病列为三类动物疫病。
细小病毒感染一旦发病治愈率特别低，没有特效药，免疫接种是犬细小病毒病防控的有效途径。目前二联、六联等疫苗的广泛应用，犬细小病毒疾病得到了极大控制。由于犬只机体状况、疫苗质量或疫苗注射时间等原因，可能导致犬只在注射完疫苗后不能得到有效的免疫。注射疫苗后动物体内抗体水平是评价免疫效果的主要指标，同时也是科学制定免疫程序的重要依据，因此动物免疫后对抗体水平的监测尤为重要。
目前，犬细小病毒抗体常用的检测方法有两种。一种是酶联免疫吸附测定(ELISA)，另一种是胶体金免疫层析法。
酶联免疫测定是目前主要检测手段，技术较成熟、应用较广且成本较低，但其存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。另外，酶联免疫测定还存在包被蛋白量相对较多，样本、试剂和底物等用量较多的缺点。
胶体金免疫层析法主要应用于定性或半定量检测，存在灵敏度低、定量难等问题。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性强、线性范围宽、上样量小、需要的血清样本量小、操作方法简便。
为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：
一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被犬细小病毒的毛细管、ALP标记的蛋白G工作液、清洗液、发光底物、犬细小病毒抗体质控品和犬细小病毒抗体标准品。
所述包被犬细小病毒的毛细管是通过采用戊二醛法或碳化二亚胺法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到。
所述戊二醛法具体为：
活化缓冲液：用0.1M磷酸盐缓冲液配制2.5%的戊二醛溶液。
活化毛细管：用活化缓冲液浸泡已氨化的毛细管，在温度为22～28℃条件下，活化1～3h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干；
包被：将犬细小病毒抗原用0.1M磷酸盐缓冲液稀释到5μg/mL，制成包被液；在温度为22～28℃条件下，将活化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，1～3h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干；
封闭：对包被的毛细管用封闭液进行封闭处理，封闭温度为22～28℃，封闭时间为1～3h，封闭完成后，用清洗液清洗3次后吹干在温度为2～8℃条件下保存；其中；所述封闭液是由50mM 、pH =7.0～7.5 的Tris-HCl配制的含2%（质量百分比）的BSA和0.2M 甘氨酸的缓冲液；
所述碳化二亚胺法具体为：
制取包被液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液溶解犬细小病毒与EDC，配制出包被液；所述包被液中，犬细小病毒的浓度为5ug/ml，所述EDC的浓度为50ug/ml
包被：将氨基化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为22～28℃条件下包被30min，然后用清洗液清洗三次，吹干；
封闭：用封闭液浸泡毛细管，在温度为37℃的条件下，封闭2h，然后用清洗液清洗三次，吹干，在温度为2～8℃条件下干燥保存；其中，所述封闭液是由50mM， pH =7.0～7.5 的Tris-HCl配制的含2%（质量百分比）的BSA的缓冲液。
ALP标记的蛋白G工作液通过采用碳化二亚胺法或马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到。
所述碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
制取偶联混合液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液将蛋白G与ALP充分混匀，得到偶联混合液，偶联混合液中，蛋白G与ALP的浓度均为1mg/ml；
偶联：向偶联混合液中加入EDC混匀，混匀后EDC浓度为10ug/ml，在温度为22～28℃条件下，反应1h；
纯化：然后用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物，纯化时用到的纯化缓冲液为TSMZ 7.3。
TSMZ 7.3的配制：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
所述马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
蛋白G纯化：用PD10柱纯化蛋白G，将其浓缩至3~5mg/mL，纯化时用到洗脱液为洗脱液Ⅰ；
蛋白G活化：用洗脱液Ⅰ将2-IT溶解成13.76mg/mL得到活化剂；然后向活化后的蛋白G中加入1%（体积百分比）的活化剂，在温度为22~28℃的条件下反应15min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
蛋白G活化后纯化：用PD10柱纯化已活化的蛋白G，纯化时用到的洗脱液为洗脱液Ⅱ；
ALP纯化：用PD10柱纯化ALP，将其浓缩至2~4mg/mL，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅰ；
ALP活化：称取SMCC，用DMF将SMCC溶解成6.69mg/mL的ALP活化剂；取5%的ALP活化剂加入ALP中，在温度为22~28℃的条件下反应30min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
ALP活化后再纯化：用PD10柱纯化已活化的ALP，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅱ；
偶联：将活化后再纯化的蛋白G与活化后再纯化的ALP按照质量比1:1混匀，然后加入偶联液总体积0.2%的1M MgCl2，在温度为4℃的条件下反应20~24h后加入终止剂在温度为22~28℃的条件下终止反应10min，得到偶联产物；
终止剂配置：称取马来酰亚胺溶解于DMF中，制得溶液Ⅰ，溶液Ⅰ中，马来酰亚胺的浓度为9.7mg/ml，然后加入洗脱液Ⅱ将溶液Ⅰ稀释10倍，得到终止剂，终止剂中，马来酰亚胺的浓度为0.97mg/mL；
纯化：用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物；纯化时用到的缓冲液为ALP洗脱液Ⅱ。
洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至8.5，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
洗脱液Ⅱ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，最后定容为1000mL。
ALP洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.6，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
ALP洗脱液Ⅱ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
清洗液为含0.05% 吐温20的50Mm ，PH= 7.0-7.5 的Tris-HCl缓冲液。
发光底物为APS-5原液。
犬细小病毒抗体质控品包括0.6ug/ml的低质控品和5ug/ml的高质控品。
犬细小病毒抗体标准品1-6，浓度分别为0ug/ml、0.2ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、10ug/ml。
本发明的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置，该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B，授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将ALP标记的蛋白G工作液、清洗液、发光底物、犬细小病毒抗体质控品和犬细小病毒抗体标准品装在其液体试剂杯里，而将包被犬细小病毒的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本发明将犬细小病毒抗原包被到毛细管，一个测试的包被液、样本量、酶工作液、底物等使用量只需要12ul，远低于ELISA的使用量（ELISA的使用量大于100ul）。大大减小了上样量，需要的血清样本量减小。采用毛细管作为固相，可利用毛细管的毛细作用，试剂的加入与清洗都十分简便，可实现自动化操作，操作简单方便。
本发明的试剂盒对犬细小病毒抗体实现了高灵敏度和高特异性的定量测定，同时线性范围宽。
附图说明
图1 为本发明犬细小病毒抗体线性范围图。
具体实施方式
本发明提供了一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被犬细小病毒的毛细管、ALP标记的蛋白G工作液、清洗液、发光底物、犬细小病毒抗体质控品和犬细小病毒抗体标准品。
毛细管为高精度毛细管，其外径为1.18±0.02mm，内径为0.7±0.005m、长度为30±1mm；材质为高硼硅3.3玻璃。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中，采用戊二醛法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到包被犬细小病毒的毛细管，采用马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到ALP标记的蛋白G工作液。具体如下：
戊二醛法具体为：
活化缓冲液：用0.1M磷酸盐缓冲液配制2.5%的戊二醛溶液。
活化毛细管：用活化缓冲液活化已氨化的毛细管：在温度为22℃的条件下将毛细管浸泡在活化缓冲液中2h。用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干。
包被：将犬细小病毒抗原用0.1M磷酸盐缓冲液稀释到5μg/mL，得到包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中，22℃包被2h，然后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干。
封闭：用封闭液在22℃条件下封闭毛细管2h，用清洗液清洗3次后吹干4℃保存；其中，所述封闭液是由50 m M ，pH =7.0-7.5 的Tris-HCl配制的含2%（质量百分比）的BSA和0.2M 甘氨酸的缓冲液；该步骤用到的清洗液为含0.05% （体积百分比）吐温20的50mM 的PH为7.0-7.5 的Tris-HCl缓冲液。
马来酰亚胺基类活泼酯法具体为：
蛋白G纯化：用PD10柱纯化蛋白G（用到的洗脱液为洗脱液Ⅰ），将其浓缩至3~5mg/mL。
蛋白G活化：用洗脱液Ⅰ将2-IT溶解成13.76mg/mL得到活化剂，在纯化后的蛋白G中加入1%（体积百分比）的活化剂，在温度为22℃的条件下反应15min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min。
蛋白G活化后纯化：用PD10柱纯化已活化的蛋白G（用到的洗脱液为洗脱液Ⅱ）。
ALP纯化：用PD10柱纯化ALP（用到的洗脱液为ALP洗脱液），将其浓缩至2~4mg/mL。
ALP活化：称取SMCC，用DMF将SMCC溶解成6.69mg/mL的ALP活化剂；取5%的ALP活化剂加入纯化后的ALP中，在温度为22℃的条件下反应30min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min。
ALP活化后再纯化：用PD10柱纯化已活化的ALP（ALP洗脱液Ⅱ）。
偶联：将活化在纯化后的蛋白G与活化后再纯化的ALP按照质量比1:1混匀，得到偶联液，然后加入偶联液总体积0.2%的1M 的MgCl2，4℃反应20h后加入终止剂终止反应10min，终止剂加入的量为液体总体积的1%；
终止剂为：称取马来酰亚胺溶解于DMF中，使浓度为9.7mg/ml，将其稀释10倍，稀释用到的溶剂为ALP洗脱液Ⅱ，至此终止剂配制完成；终止剂中，含有 0.97mg/mL的马来酰亚胺。
纯化：然后用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物，用到的纯化缓冲液为ALP洗脱液Ⅱ。
洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至8.5，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
洗脱液Ⅱ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，最后定容为1000mL。
ALP洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.6，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
ALP洗脱液Ⅱ：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
试剂盒中的清洗液为含0.05% （体积百分比）吐温20的50mM 的PH 为7.0-7.5 的Tris-HCl缓冲液。
试剂盒中的发光底物为APS-5。
试剂盒中犬细小病毒抗体标准品有六个，浓度分别为0ug/ml、0.2ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、10ug/ml。
实验操作与测定
加样：分别向各管中加入标准品1-6，然后37℃温育15min；
清洗：用空气泵吹掉管中液体，加入清洗液，清洗三次，吹干；
加酶工作液：各管加入12ul ALP标记的蛋白G工作液，然后37℃温育15min；
清洗三次，吹干；
检测：各管加入12ul底物，用化学发光免疫分析仪测定各管的发光强度。
检测结果如表一所示：
表一检测结果
实施例2
本实施例采用戊二醛法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到包被犬细小病毒的毛细管，采用碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到ALP标记的蛋白G工作液；至于试剂盒中的其他成分，与实施例1相同。
所述戊二醛法具体为：
活化缓冲液：用0.1M磷酸盐缓冲液配制2.5%的戊二醛溶液。
活化毛细管：用活化缓冲液浸泡已氨化的毛细管，在温度为25℃条件下，活化1h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干；
包被：将犬细小病毒抗原用0.1M磷酸盐缓冲液稀释到5μg/mL，制成包被液；在温度为25℃条件下，将活化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，1h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次后吹干；
封闭：对包被的毛细管用封闭液进行封闭处理，封闭温度为25℃，封闭时间为1h，封闭完成后，用清洗液清洗3次后吹干在温度为8℃条件下保存；其中；所述封闭液是由50mM 、pH=7.0-7.5 的Tris-HCl配制的含2%的BSA和0.2M 甘氨酸的缓冲液；
所述碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
制取偶联混合液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液将蛋白G与ALP充分混匀，得到偶联混合液，偶联混合液中，蛋白G与ALP的浓度均为1mg/ml；
偶联：向偶联混合液中加入EDC混匀，混匀后EDC浓度为10ug/ml，在温度为25℃条件下，反应1h；
纯化：然后用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物，纯化时用到的纯化缓冲液为TSMZ 7.3。
TSMZ 7.3的配制：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
实施例3
本实施例采用碳化二亚胺法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到包被犬细小病毒的毛细管，采用马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到ALP标记的蛋白G工作液；至于试剂盒中的其他成分，与实施例1相同。
所述碳化二亚胺法得到包被犬细小病毒的毛细管具体为：
制取包被液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液溶解犬细小病毒与EDC，配制出包被液；所述包被液中，犬细小病毒的浓度为5ug/ml，所述EDC的浓度为50ug/ml
包被：将氨基化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，28℃下包被30min，然后用清洗液清洗三次，吹干；
封闭：用封闭液浸泡毛细管，在温度为37℃的条件下，封闭2h，然后用清洗液清洗三次，吹干，在温度为4℃条件下干燥保存；其中，所述封闭液是由50mM， pH =7.0-7.5 的Tris-HCl配制的含2%的BSA的缓冲液。
所述碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
制取偶联混合液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液将蛋白G与ALP充分混匀，得到偶联混合液，偶联混合液中，蛋白G与ALP的浓度均为1mg/ml；
偶联：向偶联混合液中加入EDC混匀，混匀后EDC浓度为10ug/ml，在温度为28℃条件下，反应1h；
纯化：然后用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物，纯化时用到的纯化缓冲液为TSMZ 7.3。
TSMZ 7.3的配制：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
实施例4
本实施例采用碳化二亚胺法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到包被犬细小病毒的毛细管，采用碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到ALP标记的蛋白G工作液；至于试剂盒中的其他成分，与实施例1相同。
所述碳化二亚胺法得到包被犬细小病毒的毛细管具体为：
制取包被液：用50mM PH6.0 的MES缓冲液溶解犬细小病毒与EDC，配制出包被液；所述包被液中，犬细小病毒的浓度为5ug/ml，所述EDC的浓度为50ug/ml
包被：将氨基化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，23℃下包被30min，然后用清洗液清洗三次，吹干；
封闭：用封闭液浸泡毛细管，在温度为37℃的条件下，封闭2h，然后用清洗液清洗三次，吹干，在温度为2℃条件下干燥保存；其中，所述封闭液是由50mM， pH =7.0-7.5 的Tris-HCl配制的含2%的BSA的缓冲液。
所述马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
蛋白G纯化：用PD10柱纯化蛋白G，将其浓缩至3mg/mL，纯化时用到洗脱液为洗脱液Ⅰ；
蛋白G活化：用洗脱液Ⅰ将2-IT溶解成13.76mg/mL得到活化剂；然后向蛋白G中加入1%的活化剂，在温度为23℃的条件下反应15min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
蛋白G活化后纯化：用PD10柱纯化已活化的蛋白G，纯化时用到的洗脱液为洗脱液Ⅱ；
ALP纯化：用PD10柱纯化ALP，将其浓缩至2mg/mL，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅰ；
ALP活化：称取SMCC，用DMF将SMCC溶解成6.69mg/mL的ALP活化剂；取5%的ALP活化剂加入ALP中，在温度为24℃的条件下反应30min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
ALP活化后再纯化：用PD10柱纯化已活化的ALP，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅱ；
偶联：将活化后再纯化的蛋白G与活化后再纯化的ALP按照质量比1:1混匀，然后加入偶联液总体积0.2%的1M MgCl2，在温度为4℃的条件下反应24h后加入终止剂在温度为24℃的条件下终止反应10min，得到偶联产物；
终止剂配置：称取马来酰亚胺溶解于DMF中，制得溶液Ⅰ，溶液Ⅰ中，马来酰亚胺的浓度为9.7mg/ml，然后加入洗脱液Ⅱ将溶液Ⅰ稀释10倍，得到终止剂，终止剂中，马来酰亚胺的浓度为0.97mg/mL；
纯化：用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物；纯化时用到的缓冲液为ALP洗脱液Ⅱ。
洗脱液Ⅰ制备、洗脱液Ⅱ制备、ALP洗脱液Ⅰ制备、ALP洗脱液Ⅱ制备均匀实施例1相同。
本发明试剂盒性能的检测结果如下：
灵敏度
对空白样本重复测定20次，计算其平均值（M）和标准差（SD）。计算M+2SD，从校准品曲线中得出其对应浓度值即为最低检测限，灵敏度检测结果如表二所示。
表二灵敏度检测结果
结果分析：计算浓度0.072ug/ml，在0.05μg/mL≤LOD≤0.1μg/mL范围内。
线性范围
选一份高浓度样本，将其依次稀释出至少7个浓度梯度的样本，稀释浓度覆盖0.1-10ug/ml，对每一浓度样本均重复测定至少2次，计算其平均值，将结果平均值与稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算相关系数r，要求相关系数（r）不低于0.9900。线性范围结果如表三所示：
表三线性范围结果
结果分析（如图1所示）：在0.096-12.26ug/ml范围内，r值能够满足要求，故线性范围满足0.1-10ug/ml。
准确度
取工作校准品A（或校准品5或校准品6）添加到一个低值样本B中，所加入的工作校准品的体积不超过总体积（A+B）的10%，计算回收率。要求回收率应在90%～110%范围内，准确度结果如表四所示。
表四准确度结果
结果分析：回收率，满足要求。
精密性
重复性：同一批次试剂盒平行测定精密性参考品CV(n＝10)，要求精密度(CV％)不高于10％；
批间差：三个不同批次各平行测定精密性参考品CV(n＝3*10)，要求精密度(CV％)不高于15％，精密性结果如表五所示：
表五精密性结果
稳定性
将试剂盒置于37℃烘箱环境保存7天后，与2-8℃冰箱保存的试剂盒同时测定本项目的校准品。整体试剂盒信号保留率应＞75%。稳定性结果如表六所示：
表六稳定性结果
结果分析：试剂盒加速稳定性满足要求，试剂盒2-8℃能保存6个月以上。
英语缩写解释：
EDC ：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
MES：2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水
BSA：牛血清白蛋白
Tris：三羟甲基氨基甲烷
APS-5：（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐
ALP：碱性磷酸酶
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris，用盐酸调节pH
2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐
PD10：葡聚糖凝胶过滤柱。

Claims (10)

1.一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被犬细小病毒的毛细管、ALP标记的蛋白G工作液、清洗液、发光底物、犬细小病毒抗体质控品和犬细小病毒抗体标准品。
2.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述包被犬细小病毒的毛细管是通过采用戊二醛法、碳化二亚胺法将犬细小病毒包被到氨基化的毛细管上得到。
3.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述戊二醛法具体为：
活化缓冲液：用0.1M磷酸盐缓冲液配制2.5%的戊二醛溶液；
活化毛细管：用活化缓冲液浸泡已氨化的毛细管，在温度为22～28℃条件下，活化1～3h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗并吹干；
包被：将犬细小病毒抗原用0.1M磷酸盐缓冲液稀释到5μg/mL，制成包被液；在温度为22～28℃条件下，将活化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，1～3h后用0.1M磷酸盐缓冲液清洗并吹干；
封闭：对包被的毛细管用封闭液进行封闭处理，封闭温度为22～28℃，封闭时间为1～3h，封闭完成后，清洗并吹干。
4.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述碳化二亚胺法具体为：
制取包被液：用50mM 的PH=6.0 的MES缓冲液溶解犬细小病毒与EDC，配制出包被液；所述包被液中，犬细小病毒的浓度为5ug/ml，所述EDC的浓度为50ug/ml；
包被：将氨基化的毛细管浸泡在包被液中进行包被，然后用清洗并吹干；
封闭：用封闭液浸泡毛细管，在温度为37℃的条件下，封闭2h，然后用清洗液清洗并，吹干。
5.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：ALP标记的蛋白G工作液通过采用碳化二亚胺法或马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G-ALP的原液，然后用PH=7.0的1%酪蛋白缓冲液按1:2000的稀释比稀释得到。
6.根据权利要求5所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：碳化二亚胺法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
制取偶联混合液：用50mM的 PH=6.0 的MES缓冲液将蛋白G与ALP充分混匀，得到偶联混合液，偶联混合液中，蛋白G与ALP的浓度均为1mg/ml；
偶联：向偶联混合液中加入EDC混匀，混匀后EDC浓度为10ug/ml，在温度为22～28℃条件下，反应1h；
纯化：然后用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物，纯化时用到的纯化缓冲液为TSMZ 7.3。
7.根据权利要求6所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：TSMZ 7.3的配制：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
8.根据权利要求5所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：马来酰亚胺基类活泼酯法得到蛋白G- ALP的原液的具体工艺：
蛋白G纯化：用PD10柱纯化蛋白G，将其浓缩至3~5mg/mL，纯化时用到洗脱液为洗脱液Ⅰ；
蛋白G活化：用洗脱液Ⅰ将2-IT溶解成13.76mg/mL得到活化剂；然后向活化后的蛋白G中加入1%（体积百分比）的活化剂，在温度为22~28℃的条件下反应15min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
蛋白G活化后纯化：用PD10柱纯化已活化的蛋白G，纯化时用到的洗脱液为洗脱液Ⅱ；
ALP纯化：用PD10柱纯化ALP，将其浓缩至2~4mg/mL，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅰ；
ALP活化：称取SMCC，用DMF将SMCC溶解成6.69mg/mL的ALP活化剂；取5%的ALP活化剂加入ALP中，在温度为22~28℃的条件下反应30min，然后取1%的1M甘氨酸终止反应5min；
ALP活化后再纯化：用PD10柱纯化已活化的ALP，纯化时用到的洗脱液为ALP洗脱液Ⅱ；
偶联：将活化后再纯化的蛋白G与活化后再纯化的ALP按照质量比1:1混匀，然后加入偶联液总体积0.2%的1M MgCl2，在温度为4℃的条件下反应20~24h后加入终止剂在温度为22~28℃的条件下终止反应10min，得到偶联产物；
纯化：用纯化仪纯化偶联产物，得到蛋白G-ALP结合物；纯化时用到的缓冲液为ALP洗脱液Ⅱ。
9.根据权利要求8所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：终止剂配置：称取马来酰亚胺溶解于DMF中，制得溶液Ⅰ，溶液Ⅰ中，马来酰亚胺的浓度为9.7mg/ml，然后加入洗脱液Ⅱ将溶液Ⅰ稀释10倍，得到终止剂，终止剂中，马来酰亚胺的浓度为0.97mg/mL。
10.根据权利要求8所述的一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：
洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至8.5，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤；
洗脱液Ⅱ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，最后定容为1000mL；
ALP洗脱液Ⅰ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.6，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤；
ALP洗脱液Ⅱ制备：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，待溶解完全后调节溶液pH至7.3，定容为1000mL，最后用0.2μm的滤膜过滤。
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