JPH06258326A - エンドトキシン特異的測定剤 - Google Patents
エンドトキシン特異的測定剤Info
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- JPH06258326A JPH06258326A JP5061464A JP6146493A JPH06258326A JP H06258326 A JPH06258326 A JP H06258326A JP 5061464 A JP5061464 A JP 5061464A JP 6146493 A JP6146493 A JP 6146493A JP H06258326 A JPH06258326 A JP H06258326A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
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Abstract
(57)【要約】
【目的】カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬
（以下、試薬と略す）に含まれるＧ因子および／または
検体に含まれ得るセリンプロテアーゼの影響を受けず
に、Ｃ因子系反応のみを利用して、エンドトキシン(Et)
を特異的に測定すること。 【構成】試薬にアプロチニンを共存させるEt特異的測
定剤、試薬とアプロチニンを有効成分とする試薬とを
構成試薬として含有するEt特異的測定キット 、試薬
を用いて検体中のEtを測定するに際し、試薬中および／
または検体中にアプロチニンを共存させるEtの測定法、
試薬を用いてセリンプロテアーゼを含有する検体中の
Etを測定するに際し、検体をアプロチニンを固定化した
不溶性担体と予め接触させるEtの測定法、アプロチニ
ンを固定化した不溶性担体からなる、セリンプロテアー
ゼを含有する検体中のEtを測定する際に使用する前処理
剤、Ｇ因子を含有する試薬にアプロチニンを共存させ
るＧ因子活性化阻害方法、およびアプロチニンを有効
成分とするＧ因子活性化阻害剤。
（以下、試薬と略す）に含まれるＧ因子および／または
検体に含まれ得るセリンプロテアーゼの影響を受けず
に、Ｃ因子系反応のみを利用して、エンドトキシン(Et)
を特異的に測定すること。 【構成】試薬にアプロチニンを共存させるEt特異的測
定剤、試薬とアプロチニンを有効成分とする試薬とを
構成試薬として含有するEt特異的測定キット 、試薬
を用いて検体中のEtを測定するに際し、試薬中および／
または検体中にアプロチニンを共存させるEtの測定法、
試薬を用いてセリンプロテアーゼを含有する検体中の
Etを測定するに際し、検体をアプロチニンを固定化した
不溶性担体と予め接触させるEtの測定法、アプロチニ
ンを固定化した不溶性担体からなる、セリンプロテアー
ゼを含有する検体中のEtを測定する際に使用する前処理
剤、Ｇ因子を含有する試薬にアプロチニンを共存させ
るＧ因子活性化阻害方法、およびアプロチニンを有効
成分とするＧ因子活性化阻害剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬を用いるエンドトキシン特異的測
定剤、エンドトキシン特異的測定キット、エンドトキシ
ンの測定法、、検体の前処理剤、Ｇ因子の活性化を阻害
する方法およびＧ因子活性化阻害剤に関する。
イト・ライセート試薬を用いるエンドトキシン特異的測
定剤、エンドトキシン特異的測定キット、エンドトキシ
ンの測定法、、検体の前処理剤、Ｇ因子の活性化を阻害
する方法およびＧ因子活性化阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートともいう）を使用して、エンドト
キシン（内毒素；以下Ｅｔということもある）を測定す
る方法（この測定法は一般的に「リムルステスト」と呼
ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リムル
ス反応」と呼ばれている）が従来から知られており、検
出感度が高いため、医薬品、水などの汚染試験、臨床検
査など多方面に汎用されている。この方法は、微量のエ
ンドトキシンによりライセートが凝固することに基づい
ているが、その後の生化学的解明により、該反応はいく
つかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかに
されている（J. Protein Chem., 5, 255-268(1986)) 。
（以下単にライセートともいう）を使用して、エンドト
キシン（内毒素；以下Ｅｔということもある）を測定す
る方法（この測定法は一般的に「リムルステスト」と呼
ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リムル
ス反応」と呼ばれている）が従来から知られており、検
出感度が高いため、医薬品、水などの汚染試験、臨床検
査など多方面に汎用されている。この方法は、微量のエ
ンドトキシンによりライセートが凝固することに基づい
ているが、その後の生化学的解明により、該反応はいく
つかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかに
されている（J. Protein Chem., 5, 255-268(1986)) 。
【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにエンドトキ
シンが加わると、ライセート中に存在するＣ因子（エン
ドトキシン感受性因子、分子量１２３，０００）が活性
化され、生成した活性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，
０００）の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成
し、活性型Ｂ因子はプロクロッティングエンザイム（分
子量５４，０００）を活性化してクロッティングエンザ
イムに変換し、クロッティングエンザイムはコアギュロ
ーゲン（凝固タンパク、分子量１９，７２３）のジスル
フィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を、すなわ
ち…Ａｒｇ18−Ｔｈｒ19…の間および…Ａｒｇ46−Ｇｌ
ｙ47…の間を限定水解してＨ−Ｔｈｒ19…Ａｒｇ46−Ｏ
Ｈで表されるペプチドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離し
つつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される、とい
う一連の反応（カスケード反応とも呼ばれる；以下エン
ドトキシンによる活性化に起因するカスケード反応をＣ
因子系反応という）である。
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにエンドトキ
シンが加わると、ライセート中に存在するＣ因子（エン
ドトキシン感受性因子、分子量１２３，０００）が活性
化され、生成した活性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，
０００）の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成
し、活性型Ｂ因子はプロクロッティングエンザイム（分
子量５４，０００）を活性化してクロッティングエンザ
イムに変換し、クロッティングエンザイムはコアギュロ
ーゲン（凝固タンパク、分子量１９，７２３）のジスル
フィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を、すなわ
ち…Ａｒｇ18−Ｔｈｒ19…の間および…Ａｒｇ46−Ｇｌ
ｙ47…の間を限定水解してＨ−Ｔｈｒ19…Ａｒｇ46−Ｏ
Ｈで表されるペプチドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離し
つつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される、とい
う一連の反応（カスケード反応とも呼ばれる；以下エン
ドトキシンによる活性化に起因するカスケード反応をＣ
因子系反応という）である。
【０００４】一方、このカスケード反応は、エンドトキ
シンの存在によって起こるだけでなく、ライセートに
（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下β−グルカンとい
うこともある）が加わると同様に反応する。すなわち、
図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因子）が活性
化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティングエ
ンザイムをクロッティングエンザイムに活性化し、以下
エンドトキシンの場合と同様に反応してコアギュリンゲ
ルを生成する（以下β−グルカンによる活性化に起因す
るカスケード反応をＧ因子系反応という）。
シンの存在によって起こるだけでなく、ライセートに
（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下β−グルカンとい
うこともある）が加わると同様に反応する。すなわち、
図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因子）が活性
化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティングエ
ンザイムをクロッティングエンザイムに活性化し、以下
エンドトキシンの場合と同様に反応してコアギュリンゲ
ルを生成する（以下β−グルカンによる活性化に起因す
るカスケード反応をＧ因子系反応という）。
【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度
を測定することによりエンドトキシンまたはβ−グルカ
ンの定量が行われている。
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度
を測定することによりエンドトキシンまたはβ−グルカ
ンの定量が行われている。
【０００６】このように通常のライセート中にはＣ因子
系反応とＧ因子系反応の両方の反応に関与する成分が含
まれているため、これを用いて検体中のエンドトキシン
を測定する際には検体に含まれる可能性のあるβ−グル
カンによってＧ因子系反応が進行して正しい結果を得ら
れない場合がある。このように、いわゆるリムルステス
トはエンドトキシンに特異的な測定法ではないことが明
らかにされ、エンドトキシンを特異的に測定する方法が
種々検討されている。例えば、ライセートからＣ因子系
反応に関与する成分のみを分画して用いることによりエ
ンドトキシンを特異的に測定する方法が報告されている
（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, 149, 55−6
5 (1985))。
系反応とＧ因子系反応の両方の反応に関与する成分が含
まれているため、これを用いて検体中のエンドトキシン
を測定する際には検体に含まれる可能性のあるβ−グル
カンによってＧ因子系反応が進行して正しい結果を得ら
れない場合がある。このように、いわゆるリムルステス
トはエンドトキシンに特異的な測定法ではないことが明
らかにされ、エンドトキシンを特異的に測定する方法が
種々検討されている。例えば、ライセートからＣ因子系
反応に関与する成分のみを分画して用いることによりエ
ンドトキシンを特異的に測定する方法が報告されている
（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, 149, 55−6
5 (1985))。
【０００７】しかし、この方法は、ライセートをデキス
トラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用いるク
ロマトグラフィーにより分画し、β−グルカン感受性因
子であるＧ因子を除去して、Ｃ因子、Ｂ因子とプロクロ
ッティングエンザイムを再構成してエンドトキシンを測
定する方法であって、極めて煩雑な操作を必要とする方
法である。
トラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用いるク
ロマトグラフィーにより分画し、β−グルカン感受性因
子であるＧ因子を除去して、Ｃ因子、Ｂ因子とプロクロ
ッティングエンザイムを再構成してエンドトキシンを測
定する方法であって、極めて煩雑な操作を必要とする方
法である。
【０００８】一方、これらリムルス反応（Ｃ因子系反応
およびＧ因子系反応）に関与する活性型因子はすべてセ
リンプロテアーゼであり、やはりセリンプロテアーゼで
あるトリプシンやトロンビンでもＥｔやβ-Ｄ-グルカン
の存在の有無にかかわらず、同様にコアギュローゲンを
限定水解してコアギュリンゲルに変換したり、上記の合
成基質を水解したりして、偽陽性を示すことが知られて
いる（原田敏枝他、J.Med. Enzymol., 3, 43-60, 1978
）。したがって、セリンプロテアーゼを含有する試料
中のエンドトキシンをリムルステストにより測定するこ
とはこれまでまったく不可能であった。
およびＧ因子系反応）に関与する活性型因子はすべてセ
リンプロテアーゼであり、やはりセリンプロテアーゼで
あるトリプシンやトロンビンでもＥｔやβ-Ｄ-グルカン
の存在の有無にかかわらず、同様にコアギュローゲンを
限定水解してコアギュリンゲルに変換したり、上記の合
成基質を水解したりして、偽陽性を示すことが知られて
いる（原田敏枝他、J.Med. Enzymol., 3, 43-60, 1978
）。したがって、セリンプロテアーゼを含有する試料
中のエンドトキシンをリムルステストにより測定するこ
とはこれまでまったく不可能であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、ライセート試薬を用いて検体中のエンドトキシンを
測定するに際し、ライセートに含まれるβ−グルカン感
受性因子（Ｇ因子）の影響を受けずに、Ｃ因子系反応の
みを利用して、エンドトキシンを特異的に測定すること
である。
は、ライセート試薬を用いて検体中のエンドトキシンを
測定するに際し、ライセートに含まれるβ−グルカン感
受性因子（Ｇ因子）の影響を受けずに、Ｃ因子系反応の
みを利用して、エンドトキシンを特異的に測定すること
である。
【００１０】本発明の第二の目的は、ライセート試薬を
用いてセリンプロテアーゼを含有する検体中のエンドト
キシンを測定するに際し、ライセート中のＣ因子系反応
に関与する活性型の各因子の活性を阻害せずに、検体中
のセリンプロテアーゼの活性を特異的に阻害して偽陽性
反応を排除し、エンドトキシンを正確に測定することで
ある。
用いてセリンプロテアーゼを含有する検体中のエンドト
キシンを測定するに際し、ライセート中のＣ因子系反応
に関与する活性型の各因子の活性を阻害せずに、検体中
のセリンプロテアーゼの活性を特異的に阻害して偽陽性
反応を排除し、エンドトキシンを正確に測定することで
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記第一
の目的を達成するために、ライセート中のＣ因子系反応
を阻害せずに、Ｇ因子系反応、すなわちβ−グルカンに
よるＧ因子の活性化および／または活性型Ｇ因子の活性
を選択的に阻害する物質について検討した。その結果、
多くのセリンプロテアーゼ阻害剤のうち、アプロチニン
の適量を用いればエンドトキシンによるＣ因子系反応を
実質的に阻害せず、かつβ−グルカンによるＧ因子系反
応を強く阻害する事を見出した。
の目的を達成するために、ライセート中のＣ因子系反応
を阻害せずに、Ｇ因子系反応、すなわちβ−グルカンに
よるＧ因子の活性化および／または活性型Ｇ因子の活性
を選択的に阻害する物質について検討した。その結果、
多くのセリンプロテアーゼ阻害剤のうち、アプロチニン
の適量を用いればエンドトキシンによるＣ因子系反応を
実質的に阻害せず、かつβ−グルカンによるＧ因子系反
応を強く阻害する事を見出した。
【００１２】また本発明者らは、上記第二の目的を達成
するために、ライセート中のＣ因子系反応を阻害せず
に、検体中のセリンプロテアーゼのみを選択的に阻害す
る物質について検討した。その結果、多くのセリンプロ
テアーゼ阻害剤のうち、アプロチニンの適量を共存させ
てリムルス反応を行うか、予め検体を適量のアプロチニ
ンと接触させることにより、エンドトキシンによるＣ因
子系反応を実質的に阻害せず、かつ検体中のセリンプロ
テアーゼのみを特異的に阻害できることを見出した。
するために、ライセート中のＣ因子系反応を阻害せず
に、検体中のセリンプロテアーゼのみを選択的に阻害す
る物質について検討した。その結果、多くのセリンプロ
テアーゼ阻害剤のうち、アプロチニンの適量を共存させ
てリムルス反応を行うか、予め検体を適量のアプロチニ
ンと接触させることにより、エンドトキシンによるＣ因
子系反応を実質的に阻害せず、かつ検体中のセリンプロ
テアーゼのみを特異的に阻害できることを見出した。
【００１３】すなわち、アプロチニンのほかに、セリン
プロテアーゼ阻害剤として知られるα1 −アンチトリプ
シン、アンチトロンビンIII 、α2 −プラスミンインヒ
ビター、オボムコイドインヒビター、ヒルジン、メシル
酸ガベキサート等を用いて検討したが、アプロチニンの
みがリムルス反応のうちのＧ因子系反応を優先的に阻害
し、他のセリンプロテアーゼ阻害剤は検体中のセリンプ
ロテアーゼも不活化するが、すべてＧ因子系反応とＣ因
子系反応を同時に阻害し、その結果リムルス反応全体を
阻害することを見出した。本発明はこのような知見をさ
らに発展させた結果完成されたものである。
プロテアーゼ阻害剤として知られるα1 −アンチトリプ
シン、アンチトロンビンIII 、α2 −プラスミンインヒ
ビター、オボムコイドインヒビター、ヒルジン、メシル
酸ガベキサート等を用いて検討したが、アプロチニンの
みがリムルス反応のうちのＧ因子系反応を優先的に阻害
し、他のセリンプロテアーゼ阻害剤は検体中のセリンプ
ロテアーゼも不活化するが、すべてＧ因子系反応とＣ因
子系反応を同時に阻害し、その結果リムルス反応全体を
阻害することを見出した。本発明はこのような知見をさ
らに発展させた結果完成されたものである。
【００１４】本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ラ
イセート試薬にアプロチニンを共存させることを特徴と
するエンドトキシン特異的測定剤を提供するものであ
る。また本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬とアプロチニンを有効成分とする試薬とを構成
試薬として含有するエンドトキシン特異的測定キットを
提供するものである。
イセート試薬にアプロチニンを共存させることを特徴と
するエンドトキシン特異的測定剤を提供するものであ
る。また本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬とアプロチニンを有効成分とする試薬とを構成
試薬として含有するエンドトキシン特異的測定キットを
提供するものである。
【００１５】さらに本発明は、カブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬を用いて検体中のエンドトキシンを
測定するに際し、カブトガニ・アメボサイト・ライセー
ト試薬中および／または検体中にアプロチニンを共存さ
せることを特徴とするエンドトキシンの測定法を提供す
るものである。特に上記測定法において、カブトガニ・
アメボサイト・ライセート試薬中に含まれ、（１→３）
−β−Ｄ−グルカンによって活性化されるＧ因子の活性
化を阻害するために有効な量のアプロチニンをカブトガ
ニ・アメボサイト・ライセート試薬および／または検体
中に共存させる方法、および検体がセリンプロテアーゼ
を含有するものであり、カブトガニ・アメボサイト・ラ
イセート試薬および／または検体中に、検体中のセリン
プロテアーゼを阻害するために有効な量のアプロチニン
を共存させる方法を提供する。
ト・ライセート試薬を用いて検体中のエンドトキシンを
測定するに際し、カブトガニ・アメボサイト・ライセー
ト試薬中および／または検体中にアプロチニンを共存さ
せることを特徴とするエンドトキシンの測定法を提供す
るものである。特に上記測定法において、カブトガニ・
アメボサイト・ライセート試薬中に含まれ、（１→３）
−β−Ｄ−グルカンによって活性化されるＧ因子の活性
化を阻害するために有効な量のアプロチニンをカブトガ
ニ・アメボサイト・ライセート試薬および／または検体
中に共存させる方法、および検体がセリンプロテアーゼ
を含有するものであり、カブトガニ・アメボサイト・ラ
イセート試薬および／または検体中に、検体中のセリン
プロテアーゼを阻害するために有効な量のアプロチニン
を共存させる方法を提供する。
【００１６】さらに本発明は、カブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬を用いてセリンプロテアーゼを含有
する検体中のエンドトキシンを測定するに際し、検体を
アプロチニンを固定化した不溶性担体と予め接触させる
ことを特徴とするエンドトキシンの測定法を提供するも
のである。さらに本発明は、アプロチニンを固定化した
不溶性担体からなることを特徴とする、セリンプロテア
ーゼを含有する検体中のエンドトキシンをカブトガニ・
アメボサイト・ライセート試薬を用いて測定する際に使
用する前処理剤を提供するものである。
ト・ライセート試薬を用いてセリンプロテアーゼを含有
する検体中のエンドトキシンを測定するに際し、検体を
アプロチニンを固定化した不溶性担体と予め接触させる
ことを特徴とするエンドトキシンの測定法を提供するも
のである。さらに本発明は、アプロチニンを固定化した
不溶性担体からなることを特徴とする、セリンプロテア
ーゼを含有する検体中のエンドトキシンをカブトガニ・
アメボサイト・ライセート試薬を用いて測定する際に使
用する前処理剤を提供するものである。
【００１７】そして、本発明は、（１→３）−β−Ｄ−
グルカンによって活性化されるＧ因子を含有するカブト
ガニ・アメボサイト・ライセート試薬にアプロチニンを
共存させることを特徴とするＧ因子の活性化を阻害する
方法、およびアプロチニンを有効成分として含有し、カ
ブトガニ・アメボサイト中のＧ因子の（１→３）−β−
Ｄ−グルカンによる活性化を阻害することを特徴とする
Ｇ因子活性化阻害剤を提供するものである。
グルカンによって活性化されるＧ因子を含有するカブト
ガニ・アメボサイト・ライセート試薬にアプロチニンを
共存させることを特徴とするＧ因子の活性化を阻害する
方法、およびアプロチニンを有効成分として含有し、カ
ブトガニ・アメボサイト中のＧ因子の（１→３）−β−
Ｄ−グルカンによる活性化を阻害することを特徴とする
Ｇ因子活性化阻害剤を提供するものである。
【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。アプロチ
ニン（aprotinin）とは、塩基性膵臓トリプシンインヒ
ビターとも呼ばれ、ウシの肺、膵臓または耳下腺から抽
出されるアミノ酸５８残基の塩基性ポリペプチド（等電
点10.5）で、カリクレイン、プラスミン、トリプシン、
キモトリプシン、その他各種の細胞内プロテアーゼを阻
害するインヒビターであり、医薬品としてはトラジロー
ル（Trasylol）の商品名でバイエル社から販売されてい
る。
ニン（aprotinin）とは、塩基性膵臓トリプシンインヒ
ビターとも呼ばれ、ウシの肺、膵臓または耳下腺から抽
出されるアミノ酸５８残基の塩基性ポリペプチド（等電
点10.5）で、カリクレイン、プラスミン、トリプシン、
キモトリプシン、その他各種の細胞内プロテアーゼを阻
害するインヒビターであり、医薬品としてはトラジロー
ル（Trasylol）の商品名でバイエル社から販売されてい
る。
【００１９】本発明で使用されるカブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬（以下、単にライセート試薬とも
いう）としては、リムルス・ポリフェムス（Limulus p
olyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypl
eus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（T. giga
s）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carci
noscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ液
から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-10
21(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げること
ができる。また、これらの抽出物にＣ因子の活性化に有
効な二価金属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水
素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエ
ンザイムの基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのような合成基質）、ｐＨ調整剤
（トリス−塩酸緩衝液などの緩衝剤）を必要に応じて添
加したものであってもよい。さらに、ライセート試薬と
しては、販売されている市販のものも使用することがで
きる。なお、このようなライセート試薬は液体、粉末、
固形物等のいずれの形態であってもよい。
イト・ライセート試薬（以下、単にライセート試薬とも
いう）としては、リムルス・ポリフェムス（Limulus p
olyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypl
eus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（T. giga
s）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carci
noscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ液
から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-10
21(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げること
ができる。また、これらの抽出物にＣ因子の活性化に有
効な二価金属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水
素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエ
ンザイムの基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのような合成基質）、ｐＨ調整剤
（トリス−塩酸緩衝液などの緩衝剤）を必要に応じて添
加したものであってもよい。さらに、ライセート試薬と
しては、販売されている市販のものも使用することがで
きる。なお、このようなライセート試薬は液体、粉末、
固形物等のいずれの形態であってもよい。
【００２０】また、本発明は、ライセート試薬にＧ因子
が存在する形態のものが、通常、好適に用いられるが、
Ｇ因子を除いたものか、Ｇ因子をアプロチニン以外のも
ので不活性化したもの等も使用でき得る。前記の第一の
本発明の目的を達成するためには、（Ａ）ライセート試
薬にアプロチニンを添加することによって共存させ、Ｇ
因子系反応に関与する成分が不活化されたライセート試
薬（以下「アプロチニン含有ライセート試薬」というこ
ともある）として測定に供する方法、または（Ｂ）検体
中にアプロチニンを添加することによって共存させ、通
常のライセート試薬を使用してこのアプロチニン添加検
体を測定する際にライセート試薬中のＧ因子系反応に関
与する成分の活性化を阻害する方法、あるいは（Ａ）お
よび（Ｂ）の併用、すなわちライセート試薬と検体中に
アプロチニンを共存させる方法等が採用される。
が存在する形態のものが、通常、好適に用いられるが、
Ｇ因子を除いたものか、Ｇ因子をアプロチニン以外のも
ので不活性化したもの等も使用でき得る。前記の第一の
本発明の目的を達成するためには、（Ａ）ライセート試
薬にアプロチニンを添加することによって共存させ、Ｇ
因子系反応に関与する成分が不活化されたライセート試
薬（以下「アプロチニン含有ライセート試薬」というこ
ともある）として測定に供する方法、または（Ｂ）検体
中にアプロチニンを添加することによって共存させ、通
常のライセート試薬を使用してこのアプロチニン添加検
体を測定する際にライセート試薬中のＧ因子系反応に関
与する成分の活性化を阻害する方法、あるいは（Ａ）お
よび（Ｂ）の併用、すなわちライセート試薬と検体中に
アプロチニンを共存させる方法等が採用される。
【００２１】ここで、ライセート試薬中のＧ因子系反応
を完全に阻害するのに必要なアプロチニンの量は、例え
ば、次のようにして決定することができる。氷冷下、一
定量のライセート試薬に、アプロチニン（エンドトキシ
ンを含有しないもの）の量を変えて加え、それらに通常
の測定条件下においてライセート試薬を充分に活性化す
る一定量のβ−グルカン（エンドトキシンを含有しない
もの）を加えて、通常のライセート試薬使用時と同条件
で反応させる。この条件下でβ−グルカンによるライセ
ート試薬の活性化を完全に阻害するアプロチニンの量を
求める。
を完全に阻害するのに必要なアプロチニンの量は、例え
ば、次のようにして決定することができる。氷冷下、一
定量のライセート試薬に、アプロチニン（エンドトキシ
ンを含有しないもの）の量を変えて加え、それらに通常
の測定条件下においてライセート試薬を充分に活性化す
る一定量のβ−グルカン（エンドトキシンを含有しない
もの）を加えて、通常のライセート試薬使用時と同条件
で反応させる。この条件下でβ−グルカンによるライセ
ート試薬の活性化を完全に阻害するアプロチニンの量を
求める。
【００２２】このようにして求めたアプロチニン量か
ら、検体中のエンドトキシン濃度に応じたＣ因子系反応
の活性を得るアプロチニン量を決定する。前記の第二の
本発明の目的を達成するためには、（Ｃ）検体のセリン
プロテアーゼをアプロチニンと反応させ、次いでこの反
応混合物とアプロチニン含有ライセート試薬と反応させ
ること、（Ｄ）検体にライセート試薬のＧ因子の活性を
も阻害し得るアプロチニン量を添加し、ライセート試薬
を用いてこれらを反応させること、（Ｅ）ライセート試
薬に予め必要量のアプロチニンを添加しておき、そのＧ
因子の阻害に消費した余剰のアプロチニンにより検体中
のセリンプロテアーゼの活性を阻害するようにするこ
と、または（Ｆ）セリンプロテアーゼを含有する検体を
アプロチニンを固定化した不溶性担体と予め接触させる
ことによってセリンプロテアーゼを除去または不活化
し、ライセート試薬を使用してこのアプロチニン固定化
担体処理検体を測定する方法が採用される。
ら、検体中のエンドトキシン濃度に応じたＣ因子系反応
の活性を得るアプロチニン量を決定する。前記の第二の
本発明の目的を達成するためには、（Ｃ）検体のセリン
プロテアーゼをアプロチニンと反応させ、次いでこの反
応混合物とアプロチニン含有ライセート試薬と反応させ
ること、（Ｄ）検体にライセート試薬のＧ因子の活性を
も阻害し得るアプロチニン量を添加し、ライセート試薬
を用いてこれらを反応させること、（Ｅ）ライセート試
薬に予め必要量のアプロチニンを添加しておき、そのＧ
因子の阻害に消費した余剰のアプロチニンにより検体中
のセリンプロテアーゼの活性を阻害するようにするこ
と、または（Ｆ）セリンプロテアーゼを含有する検体を
アプロチニンを固定化した不溶性担体と予め接触させる
ことによってセリンプロテアーゼを除去または不活化
し、ライセート試薬を使用してこのアプロチニン固定化
担体処理検体を測定する方法が採用される。
【００２３】ただし、（Ｅ）の場合は、Ｃ因子の活性を
阻害しないアプロチニン量の範囲で可能である点に留意
すべきである。また、（Ｃ）〜（Ｅ）の場合、Ｅｔ特異
的ライセート試薬を使用するとセリンプロテアーゼの活
性を阻害するためのアプロチニン量のみでＥｔの測定が
可能であるので、Ｃ因子系反応をより制御し易いため、
より正確で簡易な測定が期待できる。その場合のアプロ
チニン量は、該Ｇ因子の阻害に必要なアプロチニン量を
上記範囲から除くことが望ましいことは明らかである
が、そのままの量を用いてもＥｔの測定が可能であれ
ば、その限りではない。
阻害しないアプロチニン量の範囲で可能である点に留意
すべきである。また、（Ｃ）〜（Ｅ）の場合、Ｅｔ特異
的ライセート試薬を使用するとセリンプロテアーゼの活
性を阻害するためのアプロチニン量のみでＥｔの測定が
可能であるので、Ｃ因子系反応をより制御し易いため、
より正確で簡易な測定が期待できる。その場合のアプロ
チニン量は、該Ｇ因子の阻害に必要なアプロチニン量を
上記範囲から除くことが望ましいことは明らかである
が、そのままの量を用いてもＥｔの測定が可能であれ
ば、その限りではない。
【００２４】（Ｃ）〜（Ｅ）の場合は、検体そのものが
セリンプロテアーゼ（即ち、セリンプロテアーゼ中のＥ
ｔの存否を調べる場合）、または検体中にセリンプロテ
アーゼが混入している場合が考えられ、そのアプロチニ
ンの添加量の決定法は以下の通りである。合成基質法に
おいては、合成基質法リムルステスト試薬の成分中のう
ちのライセート成分の代わりに蒸留水を加えた反応系で
検体と種々の濃度のアプロチニンを添加して、３７℃で
通常のリムルス反応と同様に反応させ、ブランクと同一
の値になるアプロチニン量を求め、その量をその検体測
定時に添加すればよい。
セリンプロテアーゼ（即ち、セリンプロテアーゼ中のＥ
ｔの存否を調べる場合）、または検体中にセリンプロテ
アーゼが混入している場合が考えられ、そのアプロチニ
ンの添加量の決定法は以下の通りである。合成基質法に
おいては、合成基質法リムルステスト試薬の成分中のう
ちのライセート成分の代わりに蒸留水を加えた反応系で
検体と種々の濃度のアプロチニンを添加して、３７℃で
通常のリムルス反応と同様に反応させ、ブランクと同一
の値になるアプロチニン量を求め、その量をその検体測
定時に添加すればよい。
【００２５】ゲル化法ならびに比濁法においては、例え
ば、ライセート成分のうちＣ因子およびＧ因子を除去ま
たは失活させたもので、コアギュローゲンを含むもの
に、検体と種々の濃度のアプロチニンを添加して、３７
℃で通常のリムルス反応と同様に反応させ、ブランクと
同一の値になるアプロチニン量を求め、その量をその検
体測定時に添加すればよい。
ば、ライセート成分のうちＣ因子およびＧ因子を除去ま
たは失活させたもので、コアギュローゲンを含むもの
に、検体と種々の濃度のアプロチニンを添加して、３７
℃で通常のリムルス反応と同様に反応させ、ブランクと
同一の値になるアプロチニン量を求め、その量をその検
体測定時に添加すればよい。
【００２６】なお、上記アプロチニン量は、理想値であ
り、エンドトキシンの測定に支障が生じない範囲でこの
値より若干多くすることもできる。その添加量としては
該検体中に含まれるセリンプロテアーゼの種類、量に依
存するわけだが、検体中に含有されるセリンプロテアー
ゼを充分阻害する量でかつＣ因子系反応に実質的に影響
を及ぼさない量のアプロチニンを使用すればよく、通
常、モル比で１〜２０００倍ほど添加すればよく、実際
には３００μｇ〜１０ｍｇほど添加すればよい。
り、エンドトキシンの測定に支障が生じない範囲でこの
値より若干多くすることもできる。その添加量としては
該検体中に含まれるセリンプロテアーゼの種類、量に依
存するわけだが、検体中に含有されるセリンプロテアー
ゼを充分阻害する量でかつＣ因子系反応に実質的に影響
を及ぼさない量のアプロチニンを使用すればよく、通
常、モル比で１〜２０００倍ほど添加すればよく、実際
には３００μｇ〜１０ｍｇほど添加すればよい。
【００２７】従って、セリンプロテアーゼを含有する検
体の測定に使用されるアプロチニン量は、ライセート試
薬として、Ｇ因子を含むものを使用する場合は、その中
のＧ因子を阻害するに必要なアプロチニンと上記セリン
プロテアーゼを阻害するための必要量の総和になる。
（Ｆ）法において、不溶性担体に固定化されるアプロチ
ニン量は、検体中に含まれるセリンプロテアーゼ量等に
より適宜決定され得るが、通常、該セリンプロテアーゼ
量に対しモル比で２〜１００倍の範囲が挙げられる。ま
た、不溶性担体としては、Ｅｔが存在しないものであっ
て、活性を損なわずにアプロチニンを化学的に固定でき
るものであれば、特に制限はなく、具体的にはポリアミ
ド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミ
ド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジル
メタクリレートとの多孔性共重合体）等を挙げることが
できる。アプロチニンの固定化法としては、従来公知の
方法が適用でき、例えば、セルロースゲルにホルミル基
を導入して、ＮａＣＮＢＨ3 の存在下アプロチニンと結
合させる方法、ジアゾ化法、ＣＮＢｒ法、酸アジド法等
を挙げることができる。
体の測定に使用されるアプロチニン量は、ライセート試
薬として、Ｇ因子を含むものを使用する場合は、その中
のＧ因子を阻害するに必要なアプロチニンと上記セリン
プロテアーゼを阻害するための必要量の総和になる。
（Ｆ）法において、不溶性担体に固定化されるアプロチ
ニン量は、検体中に含まれるセリンプロテアーゼ量等に
より適宜決定され得るが、通常、該セリンプロテアーゼ
量に対しモル比で２〜１００倍の範囲が挙げられる。ま
た、不溶性担体としては、Ｅｔが存在しないものであっ
て、活性を損なわずにアプロチニンを化学的に固定でき
るものであれば、特に制限はなく、具体的にはポリアミ
ド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミ
ド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジル
メタクリレートとの多孔性共重合体）等を挙げることが
できる。アプロチニンの固定化法としては、従来公知の
方法が適用でき、例えば、セルロースゲルにホルミル基
を導入して、ＮａＣＮＢＨ3 の存在下アプロチニンと結
合させる方法、ジアゾ化法、ＣＮＢｒ法、酸アジド法等
を挙げることができる。
【００２８】（Ｆ）法においては、セリンプロテアーゼ
含有検体をアプロチニンを固定化した不溶性担体に接触
させ、その非吸着液を使用するので、その前処理工程で
Etに汚染されないように注意する必要がある。従って、
（Ｃ）〜（Ｅ）法の方が、Ｅｔ汚染の危険も少なく、か
つ簡便・迅速といえる。（Ｆ）方法を除く、（Ａ）〜
（Ｅ）等のエンドトキシンを測定する方法においてアプ
ロチニンをライセート試薬および／または検体中に共存
させる方法としては、例えば、下記〜等が挙げられ
る。 ライセート試薬の抽出調製時にアプロチニンを添加
して調製したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 抽出したライセート試薬にアプロチニンを添加した
アプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品をアプロチニン含有溶
液で溶解したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液にアプロチニンを添加して調製したアプロチニ
ン含有ライセート試薬を使用する方法。 アプロチニンを添加して抽出調製したライセート試
薬またはライセート試薬中に予め必要量のアプロチニン
を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解
したアプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品をアプロチ
ニン含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶解して
調製した溶液に、アプロチニンを添加する方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
のアプロチニンを共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当
な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量のアプロチニンを検体に添加する方法。 検体試料をライセート試薬に添加後、直ちに該アプ
ロチニンを添加する方法。
含有検体をアプロチニンを固定化した不溶性担体に接触
させ、その非吸着液を使用するので、その前処理工程で
Etに汚染されないように注意する必要がある。従って、
（Ｃ）〜（Ｅ）法の方が、Ｅｔ汚染の危険も少なく、か
つ簡便・迅速といえる。（Ｆ）方法を除く、（Ａ）〜
（Ｅ）等のエンドトキシンを測定する方法においてアプ
ロチニンをライセート試薬および／または検体中に共存
させる方法としては、例えば、下記〜等が挙げられ
る。 ライセート試薬の抽出調製時にアプロチニンを添加
して調製したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 抽出したライセート試薬にアプロチニンを添加した
アプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品をアプロチニン含有溶
液で溶解したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液にアプロチニンを添加して調製したアプロチニ
ン含有ライセート試薬を使用する方法。 アプロチニンを添加して抽出調製したライセート試
薬またはライセート試薬中に予め必要量のアプロチニン
を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解
したアプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品をアプロチ
ニン含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶解して
調製した溶液に、アプロチニンを添加する方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
のアプロチニンを共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当
な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量のアプロチニンを検体に添加する方法。 検体試料をライセート試薬に添加後、直ちに該アプ
ロチニンを添加する方法。
【００２９】尚、は、単独でも〜との併用でもよ
い。要するに、本発明のＥｔの測定法においては、ライ
セート試薬中のＣ因子系反応が正常あるいは一般性を失
わない範囲で機能し、Ｅｔの定量もしくは定性的測定が
可能であれば、アプロチニンの使用法は任意である。本
発明の測定剤を用いてエンドトキシンを測定するには、
図１のカスケード反応によって、活性化されて生成する
クロッティングエンザイムの活性を公知の方法で測定す
ればよい。
い。要するに、本発明のＥｔの測定法においては、ライ
セート試薬中のＣ因子系反応が正常あるいは一般性を失
わない範囲で機能し、Ｅｔの定量もしくは定性的測定が
可能であれば、アプロチニンの使用法は任意である。本
発明の測定剤を用いてエンドトキシンを測定するには、
図１のカスケード反応によって、活性化されて生成する
クロッティングエンザイムの活性を公知の方法で測定す
ればよい。
【００３０】クロッティングエンザイムのアミダーゼ活
性の測定には、基質として、例えば前記の発色性残基を
有するペプチド合成基質、またはこれと同様の配列のペ
プチドであって、Ｃ末端のアルギニンのカルボキシル基
に前記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光
性残基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペ
プチド合成基質を使用することができる。クロッティン
グエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反
応生成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測
定を行うことができる。具体的には、本発明の測定剤と
エンドトキシンを含む反応系に上記ペプチド合成基質を
共存させ、反応（カスケード反応および必要に応じて生
成物の他色素等への変換反応）によって生成する色素、
蛍光物質またはアンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光
光度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特
開昭６２−１４８８６０）等によって測定する方法を例
示することができる。
性の測定には、基質として、例えば前記の発色性残基を
有するペプチド合成基質、またはこれと同様の配列のペ
プチドであって、Ｃ末端のアルギニンのカルボキシル基
に前記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光
性残基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペ
プチド合成基質を使用することができる。クロッティン
グエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反
応生成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測
定を行うことができる。具体的には、本発明の測定剤と
エンドトキシンを含む反応系に上記ペプチド合成基質を
共存させ、反応（カスケード反応および必要に応じて生
成物の他色素等への変換反応）によって生成する色素、
蛍光物質またはアンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光
光度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特
開昭６２−１４８８６０）等によって測定する方法を例
示することができる。
【００３１】クロッティングエンザイムのプロテアーゼ
活性の測定には、本発明の測定剤中に含まれる（もしく
は別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。
活性の測定には、本発明の測定剤中に含まれる（もしく
は別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。
【００３２】本発明の測定に使用する際には、前記カス
ケード反応系の活性化に有効な２価金属塩を共存させる
必要がある。このような２価金属塩としては、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類
金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物、硫酸塩等）が例示
される。また、本発明の測定剤は、上記金属塩はリムル
ス反応時に独立して添加してもよいが、通常ライセート
試薬に上記２価金属塩を共存させた状態で、非加熱条件
下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を行って固体状態
にしたものが望ましい。さらに、上記アミダーゼ活性を
測定するための測定剤は、２価金属塩のほかに前記ペプ
チド合成基質を共存させたものであることが好ましく、
これを乾燥処理したものであってもよい。
ケード反応系の活性化に有効な２価金属塩を共存させる
必要がある。このような２価金属塩としては、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類
金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物、硫酸塩等）が例示
される。また、本発明の測定剤は、上記金属塩はリムル
ス反応時に独立して添加してもよいが、通常ライセート
試薬に上記２価金属塩を共存させた状態で、非加熱条件
下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を行って固体状態
にしたものが望ましい。さらに、上記アミダーゼ活性を
測定するための測定剤は、２価金属塩のほかに前記ペプ
チド合成基質を共存させたものであることが好ましく、
これを乾燥処理したものであってもよい。
【００３３】本発明によりＥｔが測定される検体として
は、基本的には特に制限なく、Ｅｔ定量の必要があるも
のあるいはその存否を確認する必要があるものであれば
よい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用する
水等を挙げることができる。本発明は、特に、セリンプ
ロテアーゼを含む検体に有力であることは上記の通りで
ある。
は、基本的には特に制限なく、Ｅｔ定量の必要があるも
のあるいはその存否を確認する必要があるものであれば
よい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用する
水等を挙げることができる。本発明は、特に、セリンプ
ロテアーゼを含む検体に有力であることは上記の通りで
ある。
【００３４】本発明において、検体中に含まれるセリン
プロテアーゼの種類としては、アプロチニンによりその
活性が阻害されるものであれば、特に限定されるもので
はない。該セリンプロテアーゼとしては、カリクレイ
ン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、トロン
ビン等が例示できる。
プロテアーゼの種類としては、アプロチニンによりその
活性が阻害されるものであれば、特に限定されるもので
はない。該セリンプロテアーゼとしては、カリクレイ
ン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、トロン
ビン等が例示できる。
【００３５】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１：アプロチニンを、ライセート試薬に添加する
例 １）日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．
０Ｌを４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈
殿部分（アメボサイト）約２１g に０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナ
イザー（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinemati
ca社製造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００
ｘＧで３０分間冷却遠心し、上澄液（ライセート試薬）
１９０ｍＬを得た。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１：アプロチニンを、ライセート試薬に添加する
例 １）日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．
０Ｌを４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈
殿部分（アメボサイト）約２１g に０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナ
イザー（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinemati
ca社製造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００
ｘＧで３０分間冷却遠心し、上澄液（ライセート試薬）
１９０ｍＬを得た。
【００３６】このライセート試薬０．０４ｍＬにアプロ
チニン０．５、１．０、２．０、４．０、６．０ｍｇを
含有する０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ０．０２ｍ
Ｌを加え、アプロチニン含有ライセート試薬を得た（本
発明）。また別のライセート試薬０．０４ｍＬにアプロ
チニンを含有しない０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫
酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと
４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
０．０２ｍＬを加えた。それらに検体として、蒸留水
（以下、ＤＷと記す。これをブランクとして用いる）、
後述により調製したβ−グルカン（５００ｎｇ／ｍＬ）
を別々に０．１ｍＬ加えた。それらを３７℃、３０分間
加温して反応させ、生じたパラニトロアニリンを０．０
４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ塩酸溶液）、０．３
％スルファミン酸アンモニウム、０．０７％Ｎ−１−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々０．５ｍＬずつ
順次加えてジアゾカップリングさせ、５４５ｎｍで吸光
度を測定し、ブランクとの差を反応性として、表１に示
した（尚、以下の実施例の表もしくは図中においてもΔ
の意味はブランクとの差を意味する。）。
チニン０．５、１．０、２．０、４．０、６．０ｍｇを
含有する０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ０．０２ｍ
Ｌを加え、アプロチニン含有ライセート試薬を得た（本
発明）。また別のライセート試薬０．０４ｍＬにアプロ
チニンを含有しない０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫
酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと
４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
０．０２ｍＬを加えた。それらに検体として、蒸留水
（以下、ＤＷと記す。これをブランクとして用いる）、
後述により調製したβ−グルカン（５００ｎｇ／ｍＬ）
を別々に０．１ｍＬ加えた。それらを３７℃、３０分間
加温して反応させ、生じたパラニトロアニリンを０．０
４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ塩酸溶液）、０．３
％スルファミン酸アンモニウム、０．０７％Ｎ−１−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々０．５ｍＬずつ
順次加えてジアゾカップリングさせ、５４５ｎｍで吸光
度を測定し、ブランクとの差を反応性として、表１に示
した（尚、以下の実施例の表もしくは図中においてもΔ
の意味はブランクとの差を意味する。）。
【００３７】
【表１】
【００３８】表１から明らかなように、ライセート試薬
０．０４ｍＬに対して、アプロチニンを２．０ｍｇ以上
添加すれば、β−グルカンによるライセート試薬中のＧ
因子の活性化を完全に阻害することができることがわか
る。２）ライセート試薬に１）で求めたライセート試薬
中のβ−グルカンによるＧ因子系反応を完全に阻害した
アプロチニン（２．０、４．０、６．０ｍｇ）をそれぞ
れ含有する０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネ
シウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍ
Ｌを加え、アプロチニン含有ライセート試薬を得た。ま
た別のライセート試薬０．０４ｍＬにアプロチニンを含
有しない０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ
を加えた。それらに検体として、ＤＷ（ブランク）、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１１１：
Ｂ４株由来Ｅｔ（シグマ社販売のＷｅｓｔｐｈａｌ ｔ
ｙｐｅ；６．２５、１２．５、２５．０、５０．０ｐｇ
／ｍＬ）を別々に０．１ｍＬ加えた。それらを１）と同
様にして反応させ、Ｅｔの検量線を作成した。その結果
を図２に示した。この結果から、アプロチニンの添加量
が増加するとともにＥｔに対する反応性も低下すること
がわかる。これらの検量線より、検体中のＥｔ濃度に応
じたライセート中のＣ因子系反応の活性を得るアプロチ
ニン量を任意に選ぶことができる。
０．０４ｍＬに対して、アプロチニンを２．０ｍｇ以上
添加すれば、β−グルカンによるライセート試薬中のＧ
因子の活性化を完全に阻害することができることがわか
る。２）ライセート試薬に１）で求めたライセート試薬
中のβ−グルカンによるＧ因子系反応を完全に阻害した
アプロチニン（２．０、４．０、６．０ｍｇ）をそれぞ
れ含有する０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネ
シウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍ
Ｌを加え、アプロチニン含有ライセート試薬を得た。ま
た別のライセート試薬０．０４ｍＬにアプロチニンを含
有しない０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ
を加えた。それらに検体として、ＤＷ（ブランク）、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１１１：
Ｂ４株由来Ｅｔ（シグマ社販売のＷｅｓｔｐｈａｌ ｔ
ｙｐｅ；６．２５、１２．５、２５．０、５０．０ｐｇ
／ｍＬ）を別々に０．１ｍＬ加えた。それらを１）と同
様にして反応させ、Ｅｔの検量線を作成した。その結果
を図２に示した。この結果から、アプロチニンの添加量
が増加するとともにＥｔに対する反応性も低下すること
がわかる。これらの検量線より、検体中のＥｔ濃度に応
じたライセート中のＣ因子系反応の活性を得るアプロチ
ニン量を任意に選ぶことができる。
【００３９】以上の結果より、通常のライセート試薬に
アプロチニンを添加してリムルステスト試薬を調製し、
検体の測定に用いることによって、β−グルカンの影響
を受けずに、Ｅｔを特異的に測定することができること
がわかる。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨZ、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷXL２本、Ｇ２５００ＰＷXL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品β−
グルカン標品を得た。
アプロチニンを添加してリムルステスト試薬を調製し、
検体の測定に用いることによって、β−グルカンの影響
を受けずに、Ｅｔを特異的に測定することができること
がわかる。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨZ、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷXL２本、Ｇ２５００ＰＷXL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品β−
グルカン標品を得た。
【００４０】尚、以下の実施例に使用されたβ−グルカ
ンも、上記と同様に調製されたものである。 実施例２：アプロチニンをライセート試薬の抽出調製時
に添加する例 日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．０Ｌ
を４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部
分（アメボサイト）約２１gにアプロチニン１２ｇを含
有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２
１０ｍＬを加え、ポリトロンＲ ＰＴ１０にて均一に破
砕および抽出し、１０，０００ｘＧで３０分間冷却遠心
し、上澄液（アプロチニン含有ライセート試薬）１９０
ｍＬを得た。
ンも、上記と同様に調製されたものである。 実施例２：アプロチニンをライセート試薬の抽出調製時
に添加する例 日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．０Ｌ
を４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部
分（アメボサイト）約２１gにアプロチニン１２ｇを含
有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２
１０ｍＬを加え、ポリトロンＲ ＰＴ１０にて均一に破
砕および抽出し、１０，０００ｘＧで３０分間冷却遠心
し、上澄液（アプロチニン含有ライセート試薬）１９０
ｍＬを得た。
【００４１】このアプロチニン含有ライセート試薬（本
発明例）と上記においてアプロチニンを添加しないで調
製したライセート試薬（比較例）各々０．０４ｍＬに２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ、
０．４Ｍ塩化マグネシウム０．０３ｍＬ、３．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ
を加え、さらに検体としてＤＷ（ブランク）、Ｅｔまた
はβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それ
ぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ
同時に添加した。それらを３７℃、３０分間加温して反
応させ、０．８Ｍ酢酸０．４ｍＬを加えて反応を停止さ
せ、４０５ｎｍの吸光度を測定して、生じたパラニトロ
アニリンを定量し、反応性を比較検討した。その結果を
表２に示した。この結果から、カブトガニ血リンパ液か
らライセート試薬を抽出する際にアプロチニンを添加し
て調製したアプロチニン含有ライセート試薬を用いれ
ば、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測
定することができることがわかる。言い換えれば、本発
明による測定においては、Ｃ因子系反応が阻害されるこ
となくＧ因子系反応が実質的に抑制されていることが証
明された。
発明例）と上記においてアプロチニンを添加しないで調
製したライセート試薬（比較例）各々０．０４ｍＬに２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ、
０．４Ｍ塩化マグネシウム０．０３ｍＬ、３．０ｍＭ
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ
を加え、さらに検体としてＤＷ（ブランク）、Ｅｔまた
はβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それ
ぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ
同時に添加した。それらを３７℃、３０分間加温して反
応させ、０．８Ｍ酢酸０．４ｍＬを加えて反応を停止さ
せ、４０５ｎｍの吸光度を測定して、生じたパラニトロ
アニリンを定量し、反応性を比較検討した。その結果を
表２に示した。この結果から、カブトガニ血リンパ液か
らライセート試薬を抽出する際にアプロチニンを添加し
て調製したアプロチニン含有ライセート試薬を用いれ
ば、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測
定することができることがわかる。言い換えれば、本発
明による測定においては、Ｃ因子系反応が阻害されるこ
となくＧ因子系反応が実質的に抑制されていることが証
明された。
【００４２】
【表２】
【００４３】実施例３：凍結乾燥ライセート試薬の溶解
時にアプロチニンを添加する例 「パイロテル−Ｔ」（Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓより抽
出調製されたライセート試薬の凍結乾燥品；ゲル化法リ
ムルステスト試薬製品；ケープコッド社製造、生化学工
業販売）１バイアルを、あらかじめアプロチニン２７０
ｍｇを溶かしたＤＷ５．０ｍＬで溶解した（本発明
例）。また、別の凍結乾燥品１バイアルはアプロチニン
を含有しないＤＷ５．０ｍＬで溶解した（比較例）。そ
れらの各０．１ｍＬを反応用試験管に分注した。さらに
検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカ
ンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それぞれに２倍濃
度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に添加
した。静かに混和後、比濁時間分析装置「トキシノメー
ターＥＴー２０１」（和光純薬工業販売）の専用アナリ
シスモジュールにセットし、３７℃、６０分間加温して
反応させ、ゲル化時間（Ｔｇ）を記録し、本発明の測定
剤の反応性を比較検討した。その結果を表３に示した。
この結果から、市販のライセート試薬の凍結乾燥品（ゲ
ル化法リムルステスト試薬）にアプロチニンを検体添加
前に添加することによって、β−グルカンの影響を受け
ずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわが
る。
時にアプロチニンを添加する例 「パイロテル−Ｔ」（Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓより抽
出調製されたライセート試薬の凍結乾燥品；ゲル化法リ
ムルステスト試薬製品；ケープコッド社製造、生化学工
業販売）１バイアルを、あらかじめアプロチニン２７０
ｍｇを溶かしたＤＷ５．０ｍＬで溶解した（本発明
例）。また、別の凍結乾燥品１バイアルはアプロチニン
を含有しないＤＷ５．０ｍＬで溶解した（比較例）。そ
れらの各０．１ｍＬを反応用試験管に分注した。さらに
検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカ
ンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それぞれに２倍濃
度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に添加
した。静かに混和後、比濁時間分析装置「トキシノメー
ターＥＴー２０１」（和光純薬工業販売）の専用アナリ
シスモジュールにセットし、３７℃、６０分間加温して
反応させ、ゲル化時間（Ｔｇ）を記録し、本発明の測定
剤の反応性を比較検討した。その結果を表３に示した。
この結果から、市販のライセート試薬の凍結乾燥品（ゲ
ル化法リムルステスト試薬）にアプロチニンを検体添加
前に添加することによって、β−グルカンの影響を受け
ずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわが
る。
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例４：ライセート試薬と合成基質の凍
結乾燥品の溶解時にアプロチニンを添加する例 「トキシカラーシステムＬＳ−２００セット」（T.trid
entatus より抽出調製されたライセート試薬とＢｏｃ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等との凍結乾燥品；発
色合成基質法リムルステスト試薬製品；生化学工業製造
販売）１バイアルを、あらかじめ、アプロチニン１４０
ｍｇを溶かした０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２．８ｍＬで溶解し、本発明の測定剤を調製した。
また、別の凍結乾燥品１バイアルはアプロチニンを含有
しない０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．
８ｍＬで溶解し、比較剤を調製した。それらの０．１ｍ
Ｌに検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グ
ルカンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それぞれに２
倍濃度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に
添加した。それらを実施例１−１）と同様にして反応さ
せ、本発明の測定剤の反応性を比較検討した。その結果
を表４に示した。
結乾燥品の溶解時にアプロチニンを添加する例 「トキシカラーシステムＬＳ−２００セット」（T.trid
entatus より抽出調製されたライセート試薬とＢｏｃ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等との凍結乾燥品；発
色合成基質法リムルステスト試薬製品；生化学工業製造
販売）１バイアルを、あらかじめ、アプロチニン１４０
ｍｇを溶かした０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２．８ｍＬで溶解し、本発明の測定剤を調製した。
また、別の凍結乾燥品１バイアルはアプロチニンを含有
しない０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．
８ｍＬで溶解し、比較剤を調製した。それらの０．１ｍ
Ｌに検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グ
ルカンを別々に０．１ｍＬ加えた。また、それぞれに２
倍濃度のＥｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に
添加した。それらを実施例１−１）と同様にして反応さ
せ、本発明の測定剤の反応性を比較検討した。その結果
を表４に示した。
【００４６】
【表４】
【００４７】この結果から、市販の発色合成基質法リム
ルステスト試薬（凍結乾燥品）にアプロチニンを検体添
加前に添加することによって、β−グルカンの影響を受
けずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわ
かる。 実施例５：アプロチニンを添加して抽出調製したライセ
ート試薬の凍結乾燥品を使用する例 実施例２と同様にアプロチニンを添加して抽出調製した
アプロチニン含有ライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ
塩化マグネシウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して
本発明のエンドトキシン特異的測定剤を得た。また、同
じく実施例１−１）と同様に調製したアプロチニンを含
まないライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ塩化マグネ
シウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して比較の測定
剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれＤＷ２．０ｍＬに溶
解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加
え、静かに混和後、３７℃、６０分間静置加温し、１８
０゜転倒してゲル形成の有無を肉眼で判定し、本発明の
測定剤の反応性を比較検討した。その結果を表５に示し
た。表中＋はゲル化したことを、−はゲル化しなかった
ことを表す。
ルステスト試薬（凍結乾燥品）にアプロチニンを検体添
加前に添加することによって、β−グルカンの影響を受
けずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわ
かる。 実施例５：アプロチニンを添加して抽出調製したライセ
ート試薬の凍結乾燥品を使用する例 実施例２と同様にアプロチニンを添加して抽出調製した
アプロチニン含有ライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ
塩化マグネシウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して
本発明のエンドトキシン特異的測定剤を得た。また、同
じく実施例１−１）と同様に調製したアプロチニンを含
まないライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ塩化マグネ
シウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して比較の測定
剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれＤＷ２．０ｍＬに溶
解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加
え、静かに混和後、３７℃、６０分間静置加温し、１８
０゜転倒してゲル形成の有無を肉眼で判定し、本発明の
測定剤の反応性を比較検討した。その結果を表５に示し
た。表中＋はゲル化したことを、−はゲル化しなかった
ことを表す。
【００４８】
【表５】
【００４９】この結果から、アプロチニンを添加して抽
出調製したアプロチニン含有ライセート試薬を凍結乾燥
することによって、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅ
ｔを特異的に測定することができることがわかる。 実施例６：ライセート試薬と合成基質とアプロチニンと
を混和後、凍結乾燥したＥｔ特異的測定剤を使用する例 実施例１−１）で得たアプロチニン不含ライセート試薬
２．０ｍＬ、３．４ｍＭ発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）０．９ｍＬ、０．８Ｍ硫酸
マグネシウム１．０ｍＬならびにアプロチニン水溶液
（２４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬとを混和後、凍結乾燥
して本発明のＥｔ特異的測定剤を得た。また、アプロチ
ニン水溶液の代わりにＤＷ０．５ｍＬを混和後、凍結乾
燥して比較の測定剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれ
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５．０ｍＬ
に溶解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加え
た。また、それぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンを
０．０５ｍＬずつ添加した。以後、実施例１−１）と同
様に反応させ、本発明の測定剤の反応性を比較検討し
た。その結果を表６に示した。
出調製したアプロチニン含有ライセート試薬を凍結乾燥
することによって、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅ
ｔを特異的に測定することができることがわかる。 実施例６：ライセート試薬と合成基質とアプロチニンと
を混和後、凍結乾燥したＥｔ特異的測定剤を使用する例 実施例１−１）で得たアプロチニン不含ライセート試薬
２．０ｍＬ、３．４ｍＭ発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）０．９ｍＬ、０．８Ｍ硫酸
マグネシウム１．０ｍＬならびにアプロチニン水溶液
（２４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬとを混和後、凍結乾燥
して本発明のＥｔ特異的測定剤を得た。また、アプロチ
ニン水溶液の代わりにＤＷ０．５ｍＬを混和後、凍結乾
燥して比較の測定剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれ
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５．０ｍＬ
に溶解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加え
た。また、それぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンを
０．０５ｍＬずつ添加した。以後、実施例１−１）と同
様に反応させ、本発明の測定剤の反応性を比較検討し
た。その結果を表６に示した。
【００５０】
【表６】
【００５１】この結果から、ライセート試薬と合成基質
とアプロチニンとを混和して凍結乾燥することによっ
て、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測
定することができることがわかる。 実施例７：アプロチニンを事前に検体に添加する例 検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔ、β−グルカンお
よびそれぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンの等量混合
液各々０．０５ｍＬを用意する。それらにアプロチニン
水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを加え、次い
でそれらに０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
２．８ｍＬで溶解した「トキシカラーシステム ＬＳ−
２００セット」０．１ｍＬを加え、以後、実施例１−
１）と同様にして反応させた。また、上記アプロチニン
水溶液の代わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検
討した。その結果を表７に示した。
とアプロチニンとを混和して凍結乾燥することによっ
て、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測
定することができることがわかる。 実施例７：アプロチニンを事前に検体に添加する例 検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔ、β−グルカンお
よびそれぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンの等量混合
液各々０．０５ｍＬを用意する。それらにアプロチニン
水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを加え、次い
でそれらに０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
２．８ｍＬで溶解した「トキシカラーシステム ＬＳ−
２００セット」０．１ｍＬを加え、以後、実施例１−
１）と同様にして反応させた。また、上記アプロチニン
水溶液の代わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検
討した。その結果を表７に示した。
【００５２】
【表７】
【００５３】この結果から、アプロチニンを検体にあら
かじめ添加することによって、β−グルカンの影響を受
けずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわ
かる。 実施例８：検体をライセート試薬に添加後、直ちにアプ
ロチニンを添加する例 「パイロテル」（Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓより抽出調
製されたライセート試薬の凍結乾燥品；ゲル化法リムル
ステスト試薬製品；ケープコッド社製造、生化学工業販
売）１バイアルをＤＷ５．０ｍＬで溶解し、その０．１
ｍＬを氷冷下で試験管に分注し、検体として、ＤＷ（ブ
ランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．０５ｍ
Ｌ添加し、次いで直ちにアプロチニン水溶液（１１０ｍ
ｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを添加し、静かに混和後、３７
℃、６０分間静置加温して、ゲル形成の有無を実施例５
と同様にして判定した。また、上記アプロチニン水溶液
の代わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検討し
た。その結果を表８に示した。
かじめ添加することによって、β−グルカンの影響を受
けずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわ
かる。 実施例８：検体をライセート試薬に添加後、直ちにアプ
ロチニンを添加する例 「パイロテル」（Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓより抽出調
製されたライセート試薬の凍結乾燥品；ゲル化法リムル
ステスト試薬製品；ケープコッド社製造、生化学工業販
売）１バイアルをＤＷ５．０ｍＬで溶解し、その０．１
ｍＬを氷冷下で試験管に分注し、検体として、ＤＷ（ブ
ランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．０５ｍ
Ｌ添加し、次いで直ちにアプロチニン水溶液（１１０ｍ
ｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを添加し、静かに混和後、３７
℃、６０分間静置加温して、ゲル形成の有無を実施例５
と同様にして判定した。また、上記アプロチニン水溶液
の代わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検討し
た。その結果を表８に示した。
【００５４】
【表８】
【００５５】この結果から、検体をライセート試薬に添
加後、直ちにアプロチニンを添加することによってβ−
グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測定するこ
とができることがわかる。 実施例９：セリンプロテアーゼを有する検体にアプロチ
ニンを添加する例 トリプシン（ウシ膵臓由来、マイルス社製造、生化学工
業販売）溶液（１００μｇ／ｍＬ）またはＤＷ０．０１
ｍＬにＤＷまたはＥｔ溶液（４００ｐｇ／ｍＬ）を０．
０１ｍＬ添加後、アプロチニン水溶液（５．０ｍｇ／ｍ
Ｌ）を０．０８ｍＬ加え、混合した。それらにＥｔ特異
的発色合成基質法リムルステスト試薬（エンドスペシ
ー、生化学工業販売）を０．１ｍＬ加え、実施例１−
１）と同様にして反応させ、トリプシン検体へのＥｔの
添加回収率を求めた。また、別にアプロチニン水溶液の
代わりにＤＷ０．０８ｍＬを加えたものも調製し、同様
に測定した。それらの結果を表９に示した。
加後、直ちにアプロチニンを添加することによってβ−
グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測定するこ
とができることがわかる。 実施例９：セリンプロテアーゼを有する検体にアプロチ
ニンを添加する例 トリプシン（ウシ膵臓由来、マイルス社製造、生化学工
業販売）溶液（１００μｇ／ｍＬ）またはＤＷ０．０１
ｍＬにＤＷまたはＥｔ溶液（４００ｐｇ／ｍＬ）を０．
０１ｍＬ添加後、アプロチニン水溶液（５．０ｍｇ／ｍ
Ｌ）を０．０８ｍＬ加え、混合した。それらにＥｔ特異
的発色合成基質法リムルステスト試薬（エンドスペシ
ー、生化学工業販売）を０．１ｍＬ加え、実施例１−
１）と同様にして反応させ、トリプシン検体へのＥｔの
添加回収率を求めた。また、別にアプロチニン水溶液の
代わりにＤＷ０．０８ｍＬを加えたものも調製し、同様
に測定した。それらの結果を表９に示した。
【００５６】
【表９】
【００５７】表９から明らかなようにトリプシン検体に
あらかじめアプロチニンを添加し、リムルステストで測
定すれば、トリプシン中のＥｔが正確に定量できること
がわかる。 実施例１０：セリンプロテアーゼを有する検体の測定に
おいて、アプロチニンをライセート試薬に添加する例 トキシカラーシステムＬＳ−２００セット０．１ｍＬに
アプロチニン水溶液（８ｍｇ／ｍＬ）を０．０８ｍＬ加
え、混合した。これに別途、トロンビン（ウシ血清由
来、シグマ社販売）溶液（１０単位／ｍＬ）またはＤＷ
に等容量のＥｔ溶液（４００ｐｇ／ｍＬ）を混合した溶
液０．０２ｍＬを加え、実施例１−１）と同様にして反
応させ、トロンビン検体へのＥｔの添加回収率を求め
た。また、別にアプロチニン水溶液の代わりにＤＷ０．
０８ｍＬを加えたものも調製し、同様に測定した。それ
らの結果を表１０に示した。
あらかじめアプロチニンを添加し、リムルステストで測
定すれば、トリプシン中のＥｔが正確に定量できること
がわかる。 実施例１０：セリンプロテアーゼを有する検体の測定に
おいて、アプロチニンをライセート試薬に添加する例 トキシカラーシステムＬＳ−２００セット０．１ｍＬに
アプロチニン水溶液（８ｍｇ／ｍＬ）を０．０８ｍＬ加
え、混合した。これに別途、トロンビン（ウシ血清由
来、シグマ社販売）溶液（１０単位／ｍＬ）またはＤＷ
に等容量のＥｔ溶液（４００ｐｇ／ｍＬ）を混合した溶
液０．０２ｍＬを加え、実施例１−１）と同様にして反
応させ、トロンビン検体へのＥｔの添加回収率を求め
た。また、別にアプロチニン水溶液の代わりにＤＷ０．
０８ｍＬを加えたものも調製し、同様に測定した。それ
らの結果を表１０に示した。
【００５８】
【表１０】
【００５９】表１０から明らかなようにリムルステスト
試薬にアプロチニンを共存させ、トロンビン検体を測定
すれば、トロンビン中のＥｔが正確に定量できることが
わかる。 実施例１１：セリンプロテアーゼを有する検体をリムル
ステスト前に前処理剤により処理する例 トリプシン（ブタ膵臓由来、シグマ社製）溶液（２００
μｇ／ｍＬ）１０ｍＬを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有）で平衡化し
たＥｔ不含のアプロチニン固定化セルロファイン（調製
方法は後記）カラム（１．２×４．０ｃｍ）に添加し、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ含有）にて洗浄後、素通り画分を集めた。そ
の０．１ｍＬまたはＤＷ０．１ｍＬにＥｔ溶液（４００
ｐｇ／ｍＬ）を０．０１ｍＬ添加後、エンドスペシーを
０．１ｍＬ加え、実施例１−１）と同様にして反応さ
せ、素通り画分へのＥｔの添加回収率を求めた。また、
別に無処理のトリプシン溶液０．１ｍＬにＤＷまたはＥ
ｔ溶液を０．０１ｍＬ添加し、エンドスペシーを０．１
ｍＬ加え、同様に測定した。それらの結果を表１１に示
した。
試薬にアプロチニンを共存させ、トロンビン検体を測定
すれば、トロンビン中のＥｔが正確に定量できることが
わかる。 実施例１１：セリンプロテアーゼを有する検体をリムル
ステスト前に前処理剤により処理する例 トリプシン（ブタ膵臓由来、シグマ社製）溶液（２００
μｇ／ｍＬ）１０ｍＬを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有）で平衡化し
たＥｔ不含のアプロチニン固定化セルロファイン（調製
方法は後記）カラム（１．２×４．０ｃｍ）に添加し、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ含有）にて洗浄後、素通り画分を集めた。そ
の０．１ｍＬまたはＤＷ０．１ｍＬにＥｔ溶液（４００
ｐｇ／ｍＬ）を０．０１ｍＬ添加後、エンドスペシーを
０．１ｍＬ加え、実施例１−１）と同様にして反応さ
せ、素通り画分へのＥｔの添加回収率を求めた。また、
別に無処理のトリプシン溶液０．１ｍＬにＤＷまたはＥ
ｔ溶液を０．０１ｍＬ添加し、エンドスペシーを０．１
ｍＬ加え、同様に測定した。それらの結果を表１１に示
した。
【００６０】
【表１１】
【００６１】表１１から明らかなようにトリプシンをア
プロチニン固定化不溶性担体にあらかじめ接触させてか
ら、リムルステストで測定すれば、トリプシン中のＥｔ
が正確に定量できることがわかる。 〔アプロチニン固定化セルロファインの調製方法〕ホル
ミルセルロファイン１０ｇを０．１Ｍリン酸−Ｎａ緩衝
液（ｐＨ７．１）で充分洗浄し、アプロチニン溶液（２
０ｍｇ／ｍＬ０．１Ｍリン酸−Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．
１）２０ｍＬに懸濁し、ＮａＣＮＢＨ3 ５０ｍｇを加
え、溶解させる。ひきつづき室温で８時間ゆるやかに攪
拌し、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄、濾過し、１０ｍｇのＮａＣＮＢＨ3 を含む５ｍＬの
上記緩衝液を加え、室温で３時間振盪する。その後、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ含有）で充分洗浄する。
プロチニン固定化不溶性担体にあらかじめ接触させてか
ら、リムルステストで測定すれば、トリプシン中のＥｔ
が正確に定量できることがわかる。 〔アプロチニン固定化セルロファインの調製方法〕ホル
ミルセルロファイン１０ｇを０．１Ｍリン酸−Ｎａ緩衝
液（ｐＨ７．１）で充分洗浄し、アプロチニン溶液（２
０ｍｇ／ｍＬ０．１Ｍリン酸−Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．
１）２０ｍＬに懸濁し、ＮａＣＮＢＨ3 ５０ｍｇを加
え、溶解させる。ひきつづき室温で８時間ゆるやかに攪
拌し、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄、濾過し、１０ｍｇのＮａＣＮＢＨ3 を含む５ｍＬの
上記緩衝液を加え、室温で３時間振盪する。その後、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ含有）で充分洗浄する。
【００６２】実施例１２ 実施例２において、検体として敗血症の合併が疑われる
患者から採取した多血小板血漿を過塩素酸処理後中和
し、その０．１ｍＬを使用した以外は、実施例２と同様
に本発明法で検体中のＥｔを測定すると共に検体の培養
を行ったところ大腸菌の検出とＥｔの反応性の定量化が
対応していることが確認された。
患者から採取した多血小板血漿を過塩素酸処理後中和
し、その０．１ｍＬを使用した以外は、実施例２と同様
に本発明法で検体中のＥｔを測定すると共に検体の培養
を行ったところ大腸菌の検出とＥｔの反応性の定量化が
対応していることが確認された。
【００６３】また、上記試験を実施例３〜実施例８に準
じて行ったところ、本発明の測定剤あるいは本発明の方
法が有効であることが確認された。
じて行ったところ、本発明の測定剤あるいは本発明の方
法が有効であることが確認された。
【００６４】
【発明の効果】本発明は、Ｅｔ特異的測定剤をライセー
ト試薬とアプロチニンを組み合わせるのみで容易に製造
ができるという経済性に優れ、かつＥｔの存在の有無が
明確でない感染症、敗血症を疑われている臨床検体を測
定する時に特に有用であり、真のグラム陰性菌感染症
（エンドトキセミア）を的確に判別できる利点に加える
に、従来リムルステストを強く妨害するためセリンプロ
テアーゼを含む検体は、リムルス試験ができなかった
か、非常に煩雑な前処理が必要であったが、本発明はセ
リンプロテアーゼを含む種々の検体に対しても容易かつ
正確にＥｔを測定できるという利点がある。
ト試薬とアプロチニンを組み合わせるのみで容易に製造
ができるという経済性に優れ、かつＥｔの存在の有無が
明確でない感染症、敗血症を疑われている臨床検体を測
定する時に特に有用であり、真のグラム陰性菌感染症
（エンドトキセミア）を的確に判別できる利点に加える
に、従来リムルステストを強く妨害するためセリンプロ
テアーゼを含む検体は、リムルス試験ができなかった
か、非常に煩雑な前処理が必要であったが、本発明はセ
リンプロテアーゼを含む種々の検体に対しても容易かつ
正確にＥｔを測定できるという利点がある。
【図１】リムルス反応の機構を説明する図。
【図２】エンドトキシン濃度に対する吸光度の検量線を
種々のアプロチニン添加量について示したもので、実施
例１−２）の結果を示す。
種々のアプロチニン添加量について示したもので、実施
例１−２）の結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】従って、セリンプロテアーゼを含有する検
体の測定に使用されるアプロチニン量は、ライセート試
薬として、Ｇ因子を含むものを使用する場合は、その中
のＧ因子を阻害するに必要なアプロチニンと上記セリン
プロテアーゼを阻害するための必要量の総和になる。
（Ｆ）法において、不溶性担体に固定化されるアプロチ
ニン量は、検体中に含まれるセリンプロテアーゼ量等に
より適宜決定され得るが、通常、該セリンプロテアーゼ
量に対しモル比で２〜１００倍の範囲が挙げられる。ま
た、不溶性担体としては、Ｅｔが存在しないものであっ
て、活性を損なわずにアプロチニンを化学的に固定でき
るものであれば、特に制限はなく、具体的にはポリアミ
ド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミ
ド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジル
メタクリレートとの多孔性共重合体）等を挙げることが
できる。形態は特に限定されない。例えば、ビーズ状、
チップ状、チューブ状、平膜状等に成型したものが例示
される。このような不溶性担体としては、市販のアフィ
ニティークロマトグラフィー用担体を使用することがで
き、例えば、臭化シアン処理によって活性化されたアガ
ロースゲル担体（例、セファロース（Sepharose:ファル
マシア製）など）、活性基としてホルミル基、カルボキ
シル基等を有するセルロース担体（例、ホルミル−セル
ロファイン、カルボキシセルロファイン（いずれも生化
学工業株式会社販売）など）が挙げられる。アプロチニ
ンの固定化法としては、従来公知の方法が適用でき、例
えば、セルロースゲルにホルミル基を導入して、ＮａＣ
ＮＢＨ3 の存在下アプロチニンと結合させる方法、ジア
ゾ化法、ＣＮＢｒ法、酸アジド法等を挙げることができ
る。
体の測定に使用されるアプロチニン量は、ライセート試
薬として、Ｇ因子を含むものを使用する場合は、その中
のＧ因子を阻害するに必要なアプロチニンと上記セリン
プロテアーゼを阻害するための必要量の総和になる。
（Ｆ）法において、不溶性担体に固定化されるアプロチ
ニン量は、検体中に含まれるセリンプロテアーゼ量等に
より適宜決定され得るが、通常、該セリンプロテアーゼ
量に対しモル比で２〜１００倍の範囲が挙げられる。ま
た、不溶性担体としては、Ｅｔが存在しないものであっ
て、活性を損なわずにアプロチニンを化学的に固定でき
るものであれば、特に制限はなく、具体的にはポリアミ
ド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミ
ド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グリシジル
メタクリレートとの多孔性共重合体）等を挙げることが
できる。形態は特に限定されない。例えば、ビーズ状、
チップ状、チューブ状、平膜状等に成型したものが例示
される。このような不溶性担体としては、市販のアフィ
ニティークロマトグラフィー用担体を使用することがで
き、例えば、臭化シアン処理によって活性化されたアガ
ロースゲル担体（例、セファロース（Sepharose:ファル
マシア製）など）、活性基としてホルミル基、カルボキ
シル基等を有するセルロース担体（例、ホルミル−セル
ロファイン、カルボキシセルロファイン（いずれも生化
学工業株式会社販売）など）が挙げられる。アプロチニ
ンの固定化法としては、従来公知の方法が適用でき、例
えば、セルロースゲルにホルミル基を導入して、ＮａＣ
ＮＢＨ3 の存在下アプロチニンと結合させる方法、ジア
ゾ化法、ＣＮＢｒ法、酸アジド法等を挙げることができ
る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】（Ｆ）法においては、セリンプロテアーゼ
含有検体をアプロチニンを固定化した不溶性担体に接触
させ、その非吸着液を使用するので、その前処理工程で
Etに汚染されないように注意する必要がある。従って、
（Ｃ）〜（Ｅ）法の方が、Ｅｔ汚染の危険も少なく、か
つ簡便・迅速といえる。（Ｆ）法を除く、（Ａ）〜
（Ｅ）等のエンドトキシンを測定する方法においてアプ
ロチニンをライセート試薬および／または検体中に共存
させる方法としては、例えば、下記〜等が挙げられ
る。 ライセート試薬の抽出調製時にアプロチニンを添加
して調製したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 抽出したライセート試薬にアプロチニンを添加した
アプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品をアプロチニン含有溶
液で溶解したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液にアプロチニンを添加して調製したアプロチニ
ン含有ライセート試薬を使用する方法。 アプロチニンを添加して抽出調製したライセート試
薬またはライセート試薬中に予め必要量のアプロチニン
を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解
したアプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品をアプロチ
ニン含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶解して
調製した溶液に、アプロチニンを添加する方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
のアプロチニンを共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当
な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量のアプロチニンを検体に添加する方法。 検体試料をライセート試薬に添加後、直ちに該アプ
ロチニンを添加する方法。上記、、、において、凍結乾燥品を溶解するた
めの溶解液としては、ライセート試薬中のＣ因子系反応
に関与する成分を安定に保持し、かつ、Ｃ因子系反応の
進行に適したｐＨ範囲（例えば、ｐＨ７．０〜８．５）
に保持できる適当な緩衝剤（例えば、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンマレエート、１，４−ピペラジンジエタン
スルホン酸、モルホリノプロパンスルホン酸、Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸、トリエタノールアミン、イミダゾールおよびトリ
ス（ヒドロキシメチル）イミダゾールなど）を含む上記
ｐＨ範囲の緩衝液または水が挙げられる。これらはエン
ドトキシンを含まないものであることは言うまでもな
い。また、上記、で使用するアプロチニン含有液は
上記溶解液に必要量のアプロチニンを添加したものが挙
げられる。
含有検体をアプロチニンを固定化した不溶性担体に接触
させ、その非吸着液を使用するので、その前処理工程で
Etに汚染されないように注意する必要がある。従って、
（Ｃ）〜（Ｅ）法の方が、Ｅｔ汚染の危険も少なく、か
つ簡便・迅速といえる。（Ｆ）法を除く、（Ａ）〜
（Ｅ）等のエンドトキシンを測定する方法においてアプ
ロチニンをライセート試薬および／または検体中に共存
させる方法としては、例えば、下記〜等が挙げられ
る。 ライセート試薬の抽出調製時にアプロチニンを添加
して調製したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 抽出したライセート試薬にアプロチニンを添加した
アプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品をアプロチニン含有溶
液で溶解したアプロチニン含有ライセート試薬を使用す
る方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液にアプロチニンを添加して調製したアプロチニ
ン含有ライセート試薬を使用する方法。 アプロチニンを添加して抽出調製したライセート試
薬またはライセート試薬中に予め必要量のアプロチニン
を共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な溶解液で溶解
したアプロチニン含有ライセート試薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品をアプロチ
ニン含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶解して
調製した溶液に、アプロチニンを添加する方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
のアプロチニンを共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当
な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量のアプロチニンを検体に添加する方法。 検体試料をライセート試薬に添加後、直ちに該アプ
ロチニンを添加する方法。上記、、、において、凍結乾燥品を溶解するた
めの溶解液としては、ライセート試薬中のＣ因子系反応
に関与する成分を安定に保持し、かつ、Ｃ因子系反応の
進行に適したｐＨ範囲（例えば、ｐＨ７．０〜８．５）
に保持できる適当な緩衝剤（例えば、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンマレエート、１，４−ピペラジンジエタン
スルホン酸、モルホリノプロパンスルホン酸、Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸、トリエタノールアミン、イミダゾールおよびトリ
ス（ヒドロキシメチル）イミダゾールなど）を含む上記
ｐＨ範囲の緩衝液または水が挙げられる。これらはエン
ドトキシンを含まないものであることは言うまでもな
い。また、上記、で使用するアプロチニン含有液は
上記溶解液に必要量のアプロチニンを添加したものが挙
げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】クロッティングエンザイムのアミダーゼ活
性の測定には、基質として、例えば前記の発色性残基を
有するペプチド合成基質、またはこれと類似の配列のペ
プチドであって、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に
前記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性
残基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペプ
チド合成基質を使用することができる。クロッティング
エンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反応
生成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測定
を行うことができる。具体的には、本発明の測定剤とエ
ンドトキシンを含む反応系に上記ペプチド合成基質を共
存させ、反応（カスケード反応および必要に応じて生成
物の他色素等への変換反応）によって生成する色素、蛍
光物質またはアンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光
度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特開
昭６２−１４８８６０）等によって測定する方法を例示
することができる。
性の測定には、基質として、例えば前記の発色性残基を
有するペプチド合成基質、またはこれと類似の配列のペ
プチドであって、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に
前記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性
残基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペプ
チド合成基質を使用することができる。クロッティング
エンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反応
生成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測定
を行うことができる。具体的には、本発明の測定剤とエ
ンドトキシンを含む反応系に上記ペプチド合成基質を共
存させ、反応（カスケード反応および必要に応じて生成
物の他色素等への変換反応）によって生成する色素、蛍
光物質またはアンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光
度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特開
昭６２−１４８８６０）等によって測定する方法を例示
することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】本発明の測定に使用する際には、前記カス
ケード反応系の活性化に有効な２価金属塩を共存させる
必要がある。このような２価金属塩としては、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類
金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物）、硫酸塩等が例示
される。また、本発明の測定剤は、上記金属塩はリムル
ス反応時に独立して添加してもよいが、通常ライセート
試薬に上記２価金属塩を共存させた状態で、非加熱条件
下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を行って固体状態
にしたものが望ましい。さらに、上記アミダーゼ活性を
測定するための測定剤は、２価金属塩のほかに前記ペプ
チド合成基質を共存させたものであることが好ましく、
これを乾燥処理したものであってもよい。こえらの成分
を適宜組み合わせたキットを作製することにより、より
簡便で迅速なエンドトキシン測定を行うことができる。
キット形態としては、例えばカブトガニ・アメボサイト
・ライセート（凍結乾燥品）とその溶解液、Ｇ因子の活
性化を阻害する有効量のアプロチニン（凍結乾燥品）と
その溶解液、標準エンドトキシン（凍結乾燥品）とその
溶解液およびブランク用蒸留水を含む発色合成基質法キ
ットなどを例示することが出来る。
ケード反応系の活性化に有効な２価金属塩を共存させる
必要がある。このような２価金属塩としては、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類
金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物）、硫酸塩等が例示
される。また、本発明の測定剤は、上記金属塩はリムル
ス反応時に独立して添加してもよいが、通常ライセート
試薬に上記２価金属塩を共存させた状態で、非加熱条件
下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を行って固体状態
にしたものが望ましい。さらに、上記アミダーゼ活性を
測定するための測定剤は、２価金属塩のほかに前記ペプ
チド合成基質を共存させたものであることが好ましく、
これを乾燥処理したものであってもよい。こえらの成分
を適宜組み合わせたキットを作製することにより、より
簡便で迅速なエンドトキシン測定を行うことができる。
キット形態としては、例えばカブトガニ・アメボサイト
・ライセート（凍結乾燥品）とその溶解液、Ｇ因子の活
性化を阻害する有効量のアプロチニン（凍結乾燥品）と
その溶解液、標準エンドトキシン（凍結乾燥品）とその
溶解液およびブランク用蒸留水を含む発色合成基質法キ
ットなどを例示することが出来る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】本発明によりＥｔが測定される検体として
は、基本的には特に制限はなく、Ｅｔ定量の必要がある
ものあるいはその存否を確認する必要があるものであれ
ばよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用す
る水等を挙げることができる。本発明は、特に、セリン
プロテアーゼを含む検体に有力であることは上記の通り
である。
は、基本的には特に制限はなく、Ｅｔ定量の必要がある
ものあるいはその存否を確認する必要があるものであれ
ばよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用す
る水等を挙げることができる。本発明は、特に、セリン
プロテアーゼを含む検体に有力であることは上記の通り
である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】以上の結果より、通常のライセート試薬に
アプロチニンを添加してリムルステスト試薬を調製し、
検体の測定に用いることによって、β−グルカンの影響
を受けずに、Ｅｔを特異的に測定することができること
がわかる。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨZ、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷXL２本、Ｇ２５００ＰＷXL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品（β
−グルカン標品）を得た。
アプロチニンを添加してリムルステスト試薬を調製し、
検体の測定に用いることによって、β−グルカンの影響
を受けずに、Ｅｔを特異的に測定することができること
がわかる。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨZ、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷXL２本、Ｇ２５００ＰＷXL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品（β
−グルカン標品）を得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】
【表９】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】
【表１０】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６２】実施例１２ 実施例２において、検体として敗血症の合併が疑われる
患者から採取した多血小板血漿をＵＳＰ４，４９５，２
９４記載の方法に準じて過塩素酸処理後中和し、その
０．１ｍＬを使用した以外は、実施例２と同様に本発明
法で検体中のＥｔを測定すると共に、常法に従って検体
の培養を行ったところ大腸菌の検出とＥｔの反応性の定
量化が対応していることが確認された。
患者から採取した多血小板血漿をＵＳＰ４，４９５，２
９４記載の方法に準じて過塩素酸処理後中和し、その
０．１ｍＬを使用した以外は、実施例２と同様に本発明
法で検体中のＥｔを測定すると共に、常法に従って検体
の培養を行ったところ大腸菌の検出とＥｔの反応性の定
量化が対応していることが確認された。
Claims (10)
- 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬にアプロチニンを共存させることを特徴とするエン
ドトキシン特異的測定剤。 - 【請求項２】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬が（１→３）−β−Ｄ−グルカンによって活性化さ
れるＧ因子を含有し、アプロチニンが該Ｇ因子の活性化
を阻害するための有効量共存する請求項１記載のエンド
トキシン特異的測定剤。 - 【請求項３】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬とアプロチニンを有効成分とする試薬とを構成試薬
として含有するエンドトキシン特異的測定キット。 - 【請求項４】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬を用いて検体中のエンドトキシンを測定するに際
し、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬中およ
び／または検体中にアプロチニンを共存させることを特
徴とするエンドトキシンの測定法。 - 【請求項５】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬中に含まれ、（１→３）−β−Ｄ−グルカンによっ
て活性化されるＧ因子の活性化を阻害するために有効な
量のアプロチニンをカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬および／または検体中に共存させる請求項４記
載のエンドトキシンの測定法。 - 【請求項６】 検体がセリンプロテアーゼを含有するも
のであり、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬
および／または検体中に、検体中のセリンプロテアーゼ
を阻害するために有効な量のアプロチニンを共存させる
請求項４記載のエンドトキシンの測定法。 - 【請求項７】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
試薬を用いてセリンプロテアーゼを含有する検体中のエ
ンドトキシンを測定するに際し、検体をアプロチニンを
固定化した不溶性担体と予め接触させることを特徴とす
るエンドトキシンの測定法。 - 【請求項８】 アプロチニンを固定化した不溶性担体か
らなることを特徴とする、セリンプロテアーゼを含有す
る検体中のエンドトキシンをカブトガニ・アメボサイト
・ライセート試薬を用いて測定する際に使用する前処理
剤。 - 【請求項９】 （１→３）−β−Ｄ−グルカンによって
活性化されるＧ因子を含有するカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬にアプロチニンを共存させることを
特徴とするＧ因子の活性化を阻害する方法。 - 【請求項１０】 アプロチニンを有効成分として含有
し、カブトガニ・アメボサイト中のＧ因子の（１→３）
−β−Ｄ−グルカンによる活性化を阻害することを特徴
とするＧ因子活性化阻害剤。
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