JP4235279B2 - 新規酵素反応測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応の測定を行う方法に関し、詳細には、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応の新規測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
経時的に酵素反応パラメータ値が変化する酵素反応の測定は、特に医療分野において、その必要性が高い。しかしながら、酵素反応パラメータ値の変化が一定でない場合にはこのような反応の測定を正確に行うことは困難である。
【０００３】
一例を挙げると、医療分野においては種々の感染症が知られており、免疫能の低下に伴い、重篤化する症例も非常に多いため、その予防には細心の注意が払われているが、このような感染症において、原因菌に由来するエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン、ペプチドグリカンなどの酵素反応に関与する物質を定量することによってこれらの感染症の診断ができることが知られている。
【０００４】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在する糖脂質であり、グラム陰性菌に感染した際に、上記エンドトキシンが血中に混入することで、生体に対し敗血症、発熱またはショックを引き起こすことが知られており、医療現場において医薬品及び医療用具からエンドトキシンを除去することが必須とされている。
【０００５】
(1→3)-β-D-グルカンは酵母、カビ、キノコなどの真菌類、植物などの細胞壁成分として自然界に広く分布している多糖の総称であり、構造も多様である（Aketagawa,J., Tamura,H., and Tanaka,S., J.Antibact.Antifung.Agents, 23, 7, 413-419(1995)）。(1→3)-β-D-グルカンはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導などを含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性など多彩の生物活性を示す。さらに、当該物質はアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、体内に入った当該物質が前述のエンドトキシンの作用を増強するとの報告もあり、異物として血中に混入することは好ましいことではなく、医薬品並びに医療用具などへの混入及び付着が医療上重大な問題になりつつある。
【０００６】
上記エンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンを血液、その他の体液、医薬品、医療用具などから除去するためには、これらの物質の混入量を正確に測定することが必要である。
【０００７】
エンドトキシンの測定は、従来はウサギ発熱性試験と呼ばれる生物試験法が行われてきたが、個体差やコスト的な問題に加え、大量処理も困難であるため、それに替わる簡便かつ経済的な方法としてリムルス反応を用いたエンドトキシン試験法が広く用いられている。
【０００８】
リムルス反応を利用する測定法は、カブトガニの血球抽出液の複数の因子がエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンにより順次活性化され最終的に凝固する（ゲル化する）性質又は添加したペプチド合成基質を水解する性質を利用した方法である。このリムルス反応は特徴的で、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンが存在すると、一定の不応時間（ラグタイム）の後に、徐々にその反応速度が増加し、一定速度の反応段階（0次反応）を経て、徐々に低下する、Ｓ字状の反応曲線を示すため、リムルス反応に基づくエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量の正確な測定には考慮すべき点が多く、いくつかの測定法が提案されている。
【０００９】
例えば、リムルス反応を用いたエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量の測定法の一つにカイネティック法（比色反応時間法（比色時間分析法）、比濁反応時間法（比濁時間分析法）、比色反応速度法及び比濁反応速度法）がある。比色反応時間法及び比濁反応時間法は、それぞれ、吸光度及び濁度を測定し、反応開始から予め定めた吸光度又は濁度に達するまでの時間を酵素反応量と結びつけることによりリムルス反応の測定を行い、その測定値を基にエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量を、算出する手法である。また、比色反応速度法及び比濁反応速度法は、予め定めた一定時間内に起こるリムルス反応において、吸光度又は濁度の一定の時間当たりの変化率を求め、当該値を酵素反応量と結びつけることにより、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量を算出する手法である。
【００１０】
従来、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量をカイネティック法で測定する方法としては、比色反応時間法及び比濁反応時間法が主に用いられてきたが、カブトガニ血球抽出液がエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンと接触した後、活性化されるまでに不応時間（ラグタイム）を要し、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの濃度や調製法及び由来（菌種）などにより不応時間がそれぞれ異なる場合がある。同一濃度のエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン等の含有物を含む検体においても、前記含有物の調製法、由来により測定法毎に測定値に大きな相違が見られる場合があった。この測定値の測定法による相違のため、例えば人工透析などの医療現場において、医療用具や人工透析液中のエンドトキシン量が過小に算出され（許容量を超えたエンドトキシン汚染があっても充分に検出されないため、偽陰性反応となる）、しばしばエンドトキシンショック等の重篤な症状を引き起こし、患者が危険にさらされることがある。
【００１１】
また、従来リムルス反応を用いたエンドトキシン測定法として最も信頼性が高い反応速度法は、感度と定量性に優れる反面、測定範囲が限定され、検体によっては適宜希釈を要するなどの煩雑な面があり、必ずしも実用的な方法とは言い難い面もあった。
【００１２】
上述のエンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンと同様に生体に対し好ましくはない生物活性を有する物質として、ペプチドグリカンが挙げられる。ペプチドグリカンは、細菌類の細胞壁構成成分であり、熱に対して非常に安定な物質として知られている。当該物質は、生体に対し発熱性、肝臓または腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）など、多くの生物活性を有しており、エンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンと同様に生体内、医薬品や医療用具からの除去が必要となる。
【００１３】
一方昆虫の体液には、体液のメラニン化に関与する、フェノール酸化酵素前駆体カスケードと呼ばれる一連の酵素群からなるカスケード系が存在していることが知られている。上述の(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンはこのカスケード系の引き金となって、カスケード反応を経て最終的にメラニンが生成する（Onishi,Annot.Zool.Jpn.,27,33-39(1954)；Ashida and Onishi, Arch.Biochem.Biophys.,122,411-416(1967)；Brunet, Insect biochem.,10,467-500(1980)；Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis,239-265,Japan Sci. Press(1990)；Ashida and Dohke, Insect Biochem.,10,37-47(1980) ）。当該カスケードを利用して、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンの総量を測定する試薬が和光純薬工業株式会社から「SLP試薬」として販売され、その測定方法としては上述のリムルス反応の測定と類似した反応時間法が用いられている。しかしフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応も、前述のリムルス反応と同様にＳ字状の反応曲線を描く反応であるため、リムルス反応によるエンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンの測定と同様の問題点があり、正確な測定は困難である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上述した理由により、より正確に検体中のエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカン含量を反映し、迅速に実施できる、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応によるエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカンの測定法の開発が期待されている。本発明はこのような測定法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題点を鑑みて鋭意検討の結果、酵素反応パラメータ値の、酵素反応の初期の段階における特定の範囲の変化に要する時間を指標とすることにより上述の問題点を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、酵素反応に関与する物質の定量法であって、酵素反応パラメータ値を経時的に測定し、測定値が、第１の設定変化量に到達した時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、計測時間と酵素反応に関与する物質量を関連づけることを特徴とする酵素反応測定法（以下、本発明測定法ともいう）を提供する。
【００１７】
本発明測定法において、好ましくは、第１の設定変化量は反応開始時からの変化量であり、第２の設定変化量は第１の設定変化量からの変化量である。また、好ましくは、第１の設定変化量を酵素反応パラメータ値の最大変化量の0.1〜10％の範囲内に、第２の設定変化量を前記最大変化量の0.5〜25％の範囲内にそれぞれ設定する。
【００１８】
酵素反応パラメータ値は、好ましくは、吸光度、濁度、透過光量、蛍光偏光、蛍光消光又は散乱光量であり、これらは酵素反応によって発色合成基質から生じる発色物質量、メラニン量または検体のゲル化の程度により変化する。酵素反応に関与する物質は、好ましくは、エンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカンである。酵素反応は、好ましくは、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により、詳細に説明する。
本発明測定法は、酵素反応が関与する反応を測定することによって、前記酵素反応に関与する物質を定量するための方法である。より具体的には、酵素反応生成物により変化する酵素反応パラメータ値を経時的に測定して酵素反応に関与する物質を定量する方法であって、酵素反応パラメータ値の第１の設定変化量と第２の設定変化量を設定し、酵素反応パラメータ値の変化量が第１の設定変化量に到達した時点から時間の計測を開始し、第１の設定変化量からの酵素反応パラメータ値の変化量が、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、計測時間と酵素反応に関与する物質量を関連づけることを特徴とする酵素反応測定法である。
【００２０】
本発明において、酵素反応は酵素が複数関与する反応も包含する。前記酵素が複数関与する反応は、酵素反応が複数関与した複数の酵素が関与する段階的な酵素反応（カスケード反応）の全反応及びそれぞれの酵素反応を包含する。本発明測定方法により測定することが好ましい反応の例としては、▲１▼リムルス反応、すなわち、カブトガニの血液凝固カスケード機構を含む酵素反応、▲２▼フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応、すなわち、昆虫の体液のメラニン形成のためのカスケード機構を含む酵素反応が挙げられる。リムルス反応及びそれを利用したリムルステスト並びにフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応及びそれを利用したSLP試薬については、竹沢真吾編「透析液エンドトキシンがよくわかる本」東京医学社発行（1995年）第31頁〜第41頁及び第137頁〜第143頁に詳細な説明がある。
【００２１】
前記酵素反応に関与する物質とは、酵素反応の速度または生成物の量に影響を与える物質を意味し、例えば酵素反応の主体である酵素及びその基質並びに酵素前駆体の活性化のトリガーとなる物質が挙げられる。トリガーとなる物質としては、例えばリムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応の際に酵素前駆体を活性化して一連の反応の引き金（トリガー）となるエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンなどの物質が知られている。本発明測定法は、上記物質の定量に用いることが可能である。具体的には、例えばリムルス反応を用いるエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を用いるペプチドグリカン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量、あるいは血液凝固・線溶系による血液凝固因子及び線溶因子の定量など酵素反応が関与した反応を用いる測定に適用することが可能である。
【００２２】
酵素反応パラメータ値とは、上記酵素反応生成物の量の変化を正確に反映し、酵素反応生成物量により変化する。このような酵素反応パラメータ値は例えば、反応溶液の吸光度、濁度、透過光量、蛍光偏光、蛍光消光又は散乱光量などの他に酵素反応の結果変化したｐＨ、伝導度、比電離及び比抵抗などが挙げられ、磁気又は電気信号に変換、増幅しうるものであれば好ましい。上記リムルス反応及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応に関与する物質を測定する際の酵素反応パラメータ値としては、具体的には例えば吸光度、濁度、又は透過光量を測定することが好ましいがこれらに限定はされない。上記酵素反応生成物は例えばリムルス反応を利用したエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量において実際に用いられているゲル（濁度で測定）、公知のペプチド発色合成基質より生じる発色物質（吸光度で測定）又は、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応により生じるメラニン（吸光度で測定）等が挙げられる。
【００２３】
本発明においては設定変化量として２値を設定する。上記設定変化量のうち第１の設定変化量は、通常には、反応を開始した時点での酵素反応パラメータ値（初期値）からの変化量であり、好ましくは該酵素反応パラメータ値の最大変化量（便宜上最大変化量をΔmaxと記載する）の0.1〜10％、より好ましくは0.5〜7％の範囲内に設定する。また、第２の設定変化量は、通常には、第１の設定変化量からの変化量であり、好ましくはΔmaxの0.5〜25％、より好ましくは1〜10％の範囲内に設定する。
【００２４】
最大変化量は、既知濃度の酵素反応に関与する物質を標準物質として用いて予備試験を行うことによって算出できる。また、ペプチド発色合成基質などを用いて測定を行う場合は、酵素反応パラメータ値の最大変化量は使用するペプチド発色合成基質量により予め決定できるため、前記設定変化量を発色合成基質量から予め算出してもよい。このように最大変化量を算出すれば、各設定変化量を予め設定しておくことが可能になる。
【００２５】
あるいは、迅速性が必要とされない場合には、反応の終了後に、酵素反応パラメータ値の全測定値を得た後、その最大変化量を算出し、第１及び第２の設定変化量を設定し、測定値が第１の設定変化量変化した時点から、第２の設定変化量変化するまでの時間を上記測定値から算出してもよい。
【００２６】
上記酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に達した時点から、引き続き第２の設定変化量に到達するまでの時間は、酵素反応パラメータをある一定間隔で読みとった数値を連続的にプロットして算出する方法、及び該パラメータが設定した設定変化量に充たない直前の値と超えた直後の値を連続変化量と仮定し、それらの一次回帰式により換算した補正値として求める方法などが挙げられるが、後者が精度の点で好ましい。
【００２７】
上記酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に到達時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間と、酵素反応に関与する物質量の関連づけは、この物質の標準物質を用いて検量線を作成し、検体に関し測定された時間と検量線を用いて物質量を求めることによって行えばよい。
【００２８】
なお、本発明測定法は、設定変化量を２値設定し、酵素反応パラメータ値の初期値からの変化量が第１の設定変化量に達した時点から、さらに第２の設定変化量変化するまでの時間を計測する他は、従来の酵素反応パラメータ値の測定に基づく酵素反応測定法と同様にして行うことができる。すなわち、用いる試薬や反応条件は従来と同様でもよい。
【００２９】
エンドトキシンを定量する場合の具体例としては、リムルス反応に関与する各因子であるＣ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体、及び、凝固酵素の基質としてのペプチド発色合成基質(Boc-Leu-Gly-Arg-CONH-pNAなど）またはコアグロゲンを含むリムルス試薬の全てまたは一部を検体または標準物質溶液と混合し、所定の温度で反応させ、反応液の吸光度または透過光量が本発明の所定の変化に要した時間を測定し、標準物質について測定された時間から作成した検量線に基づき検体中のエンドトキシン量を求める方法が挙げられる。
【００３０】
(1→3)-β-D-グルカンを定量する場合の具体例としては、リムルス試薬として、Ｇ因子、凝固酵素前駆体、及び、凝固酵素の基質としてのペプチド発色合成基質(Boc-Leu-Gly-Arg-CONH-pNAなど）またはコアグロゲンを含むリムルス試薬を用いる方法が挙げられる。
【００３１】
ペプチドグリカンを定量する試薬の具体例としては、例えば▲１▼SLP試薬などの少なくともペプチドグリカンに反応するフェノール酸化酵素前駆体カスケードが存在する試薬又は昆虫体液、及び▲２▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質、抗(1→3)-β-D-グルカン抗体、(1→3)-β-D-グルカン分解酵素、アプロチニン及びアルキルグルコシド等の(1→3)-β-D-グルカンによるフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を実質的に阻害する物質を▲１▼の試薬または昆虫体液に混合したものが挙げられる。このような試薬を検体又はペプチドグリカン標準物質溶液と混合し、所定の温度で反応させ、反応液の吸光度又は透過光量が本発明方法の所定の設定変化量変化するのに要した時間を測定し、前記ペプチドグリカン標準物質について測定された時間から作成した検量線に基づき検体中のペプチドグリカン量を求める方法が挙げられる。前記吸光度の測定は、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応により生成するメラニン色素の吸光度を測定する公知の方法を採用することができる。
【００３２】
また(1→3)-β-D-グルカンをフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を利用して測定する場合、▲１▼少なくとも(1→3)-β-D-グルカンをトリガーとするフェノール酸化酵素前駆体カスケードが含まれる試薬又は昆虫体液、または▲２▼▲１▼の試薬または昆虫体液に抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、強アルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化リチウム又は水酸化カリウムなど）、リゾチーム、タンパク質分解酵素又は抗ペプチドグリカン抗体を混合した試薬等を用いることができる。これらの試薬を用いて上記ペプチドグリカンと同様に、検体中の(1→3)-β-D-グルカンを定量することも可能である。
【００３３】
本発明測定法を実施するための測定機器としては、少なくとも下記記載の構成を含むものが挙げられる。
１．設定変化量を入力し、当該設定変化量を記憶する手段
２．酵素反応パラメータ値を測定し、当該測定値を入力及び記憶する手段
３．酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に到達した時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、当該値を記憶する手段
４．上記変化時間を表示する手段
【００３４】
１記載の設定変化量の入力手段としては例えばキーボード、タッチパネル、テンキーなどが挙げられ特に限定はされない。２記載の酵素反応パラメータ値の測定手段としては、上記本発明測定法中に記載の酵素反応パラメータ値を測定することが可能な構成を有していれば特に限定はされないが、上記酵素反応パラメータ値の好ましい形態として記載した吸光度及び透過光量を測定することが可能な構成としては、吸光光度計又は分光光度計等を構成要素とすることが好ましい。４記載の表示の手段は例えば電光表示パネル又は液晶パネルなどが挙げられる。また、上記１〜３記載の値、時間を記憶する手段としては、例えば電子記憶媒体（例えばRAM、メモリーカードなど）、磁気記憶媒体（光ディスク、ハードディスク、フロッピーディスクなど）又は紙媒体（パンチカードなど）が挙げられ、特に限定はされない。
【００３５】
また、上記１〜４記載の構成以外に更にそれぞれの構成において記憶された値を表示する仕組み（例えば電光表示パネル又は液晶パネルなど）、恒温漕、タイマー又はプリンターなど必要に応じて他の構成を含むことを妨げない。また、96穴マルチプレートなどを反応容器として使用し、多検体に対して本発明測定法を同時に行うことを可能とするための電子制御機構を備えていてもよい。さらに、標準物質の濃度と標準物質それぞれを用いて測定した変化時間の関係を示す回帰式を算出し、算出された回帰式及び検体の変化時間から、検体中の測定対象物質の濃度を算出する手段、前記検体中の測定対象物質の濃度を表示する手段等を備えていてもよい。
【００３６】
上記構成はそれぞれ別の装置であってもよく、また一体型の一装置の形態であってもよい。
【００３７】
【実施例】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の目的を逸脱しない限りにおいて種々の実施形態をとりうるものであり、本実施例により本発明は制限されるものではない。
【００３８】
【実施例１】
E.coli UKT-B由来の日本薬局方エンドトキシン標準品を注射用蒸留水で適宜希釈し、10EU/ml、2.5EU/ml、0.625EU/ml、0.156EU/ml、0.039EU/mlの計5濃度のエンドトキシン溶液を調製した。これらの標準液及び日局方ウサギ発熱性試験を行った検体の50μｌを96ウェルマイクロプレート（トキシペットプレート96F、生化学工業）のウェルに分注し、さらにエンドトキシン特異的比色法リムルス試薬（エンドスペシー、生化学工業）50μｌを加え、測定機器にセットし、37℃で30分間反応を行ない、405nm（対照 492nm）における吸光度変化を15秒毎にモニターした（カイネティック比色法）。次に、このモニター値から以下の▲１▼及び▲２▼の方法によってそれぞれ測定値を算出した。
【００３９】
▲１▼本発明測定法（delta T assay）
第１の設定変化量を0.005、第２の設定変化量を0.015に設定（第１の設定変化量0.005は最大変化量0.7（エンドトキシン特異的比色法リムルス試薬に含まれるペプチド発色合成基質量から算出）の0.7％に相当、第２の設定変化量0.015は上記最大変化量0.7の1.9％に相当）し、吸光度が0.005に達した時点から、前記0.005からの当該酵素反応パラメータ値の変化量が0.015である吸光度0.020に達するまでの時間を測定した。
▲２▼比色反応時間法
反応開始から設定吸光度0.015に達するまでの時間を測定した。
【００４０】
つぎに、これらのモードでの測定値の対数値をエンドトキシン濃度の対数値に対してプロットして検量線を作成した。その検量線より日局方ウサギ発熱性試験を行った３検体中のエンドトキシン濃度を自動算出した。なお、用いたウサギは、体重1.8〜2kgの栄養状態の良好な健康個体で、３匹の個体に注射した後、直腸内における体温を1時間間隔で3回測定し、体温上昇0.6℃以上のウサギが2〜3匹の時を陽性と判定した（0.5EU/mL以上で陽性となる）。それらの結果を表１に示す。表１から明らかなように、３種のエンドトキシン濃度が異なる検体について、一定のしきい値に到達するまでの時間を解析する従来の反応時間法（delta OD-time assay）の１つである比色反応時間法では、ウサギ発熱性試験に比べ低い活性しか得られず、ウサギ発熱試験の代わりに比色反応時間法で注射薬の安全性を評価すると、検体No.2のように偽陰性（＜0.5EU/ml）となってしまうものも認められた。一方、本発明測定法では、このような乖離がなく、リムルス試験法以外のエンドトキシン測定法としてのウサギ発熱性試験による発熱活性との同等性が認められた。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【実施例２】
実施例１で用いたエンドトキシン及び検体の50μlをそれぞれ別々にトキシペットプレート96Fのウェルに分注し，さらにリムルスHSテストワコー（和光純薬工業）50μlを加え、測定機器にセットし、37℃で60分間反応を行い、405nmにおける吸光度変化を15秒毎にモニターした（カイネティック比濁法）。このモニター値を上記実施例１と同様に第１の設定変化量を0.010 、第２の設定変化量を0.020に設定して、濁度変化量が第１の設定変化量に到達した時点から時間の計測を開始し、第１の設定変化量からの濁度変化量が第２の設定変化量に到達するまでの時間（min）を計測した（▲１▼本発明測定法）。また、同様に試験管にエンドトキシン及び検体を100μlずつ別々に分注し、さらにリムルスHSテストワコーを100μl加えて混合し、経時的に透過光量を測定し、一定の濁度に達するまでの時間（min）を計測する比濁時間分析装置（トキシノメーターET301、和光純薬工業）にセットし、37℃で60分間反応させ測定した（▲２▼比濁時間分析法）。それらの結果を表２に示す。表２から明らかなように本発明測定法をカイネティック比濁法に適用した場合も、実施例１のカイネティック比色法に適用した場合と同様にすべての検体に対して発熱活性と乖離がなく、同等の力価が得られ、それに対し従来の比濁時間分析法では実施例１の比色反応時間法同様発熱活性に比べ低い活性しか得られず乖離してしまい、発熱活性に対して検体No.2のように偽陰性（＜0.5EU/mL）となるものが認められた。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【実施例３】
E.coli UKT-B由来の日本薬局方エンドトキシン標準品とE.coli 0113由来の米国薬局方エンドトキシン標準品を用いて、それらの種々の濃度の50μlをトキシペットプレート96Fのウェルに分注し、エンドスペシー50μlを加えて、測定機器にセットし、実施例１と同様に測定した。それらの測定値から実施例１と同様の本発明測定法及び従来の比色反応時間法により得られる時間を算出した。それらの対数値をエンドトキシン濃度の対数値に対してプロットし、１次回帰式を算出してそれぞれ４種の検量線の同等性につき比較検討した。それらの結果を表３に示す。
【００４５】
表３より明らかなように、一定の設定値に到達するまでの時間を解析する従来の比色反応時間法では、E.coli UKT-BとE.coli 0113由来のエンドトキシン標準品で、その回帰式の傾きに大きな相違が認められるが、本発明測定方法では、両者の間にほとんど有意差が認められない。すなわち本発明測定方法によれば、一種類のエンドトキシン標準品で作成した検量線から、検体中のエンドトキシンの種類に関わらず、検体中のエンドトキシン量が正確に定量できる。
【００４６】
【表３】
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、反応速度変化を有する酵素反応を、迅速にかつ誤差を大幅に縮小して正確に測定することが可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応の測定を行う方法に関し、詳細には、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応の新規測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
経時的に酵素反応パラメータ値が変化する酵素反応の測定は、特に医療分野において、その必要性が高い。しかしながら、酵素反応パラメータ値の変化が一定でない場合にはこのような反応の測定を正確に行うことは困難である。
【０００３】
一例を挙げると、医療分野においては種々の感染症が知られており、免疫能の低下に伴い、重篤化する症例も非常に多いため、その予防には細心の注意が払われているが、このような感染症において、原因菌に由来するエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン、ペプチドグリカンなどの酵素反応に関与する物質を定量することによってこれらの感染症の診断ができることが知られている。
【０００４】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在する糖脂質であり、グラム陰性菌に感染した際に、上記エンドトキシンが血中に混入することで、生体に対し敗血症、発熱またはショックを引き起こすことが知られており、医療現場において医薬品及び医療用具からエンドトキシンを除去することが必須とされている。
【０００５】
(1→3)-β-D-グルカンは酵母、カビ、キノコなどの真菌類、植物などの細胞壁成分として自然界に広く分布している多糖の総称であり、構造も多様である（Aketagawa,J., Tamura,H., and Tanaka,S., J.Antibact.Antifung.Agents, 23, 7, 413-419(1995)）。(1→3)-β-D-グルカンはマクロファージからの各種サイトカインの産生誘導などを含む網内系の活性化、補体系の活性化、抗腫瘍活性など多彩の生物活性を示す。さらに、当該物質はアレルギー性呼吸器疾患の原因物質の一つとして挙げられている他、体内に入った当該物質が前述のエンドトキシンの作用を増強するとの報告もあり、異物として血中に混入することは好ましいことではなく、医薬品並びに医療用具などへの混入及び付着が医療上重大な問題になりつつある。
【０００６】
上記エンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンを血液、その他の体液、医薬品、医療用具などから除去するためには、これらの物質の混入量を正確に測定することが必要である。
【０００７】
エンドトキシンの測定は、従来はウサギ発熱性試験と呼ばれる生物試験法が行われてきたが、個体差やコスト的な問題に加え、大量処理も困難であるため、それに替わる簡便かつ経済的な方法としてリムルス反応を用いたエンドトキシン試験法が広く用いられている。
【０００８】
リムルス反応を利用する測定法は、カブトガニの血球抽出液の複数の因子がエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンにより順次活性化され最終的に凝固する（ゲル化する）性質又は添加したペプチド合成基質を水解する性質を利用した方法である。このリムルス反応は特徴的で、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンが存在すると、一定の不応時間（ラグタイム）の後に、徐々にその反応速度が増加し、一定速度の反応段階（0次反応）を経て、徐々に低下する、Ｓ字状の反応曲線を示すため、リムルス反応に基づくエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量の正確な測定には考慮すべき点が多く、いくつかの測定法が提案されている。
【０００９】
例えば、リムルス反応を用いたエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量の測定法の一つにカイネティック法（比色反応時間法（比色時間分析法）、比濁反応時間法（比濁時間分析法）、比色反応速度法及び比濁反応速度法）がある。比色反応時間法及び比濁反応時間法は、それぞれ、吸光度及び濁度を測定し、反応開始から予め定めた吸光度又は濁度に達するまでの時間を酵素反応量と結びつけることによりリムルス反応の測定を行い、その測定値を基にエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量を、算出する手法である。また、比色反応速度法及び比濁反応速度法は、予め定めた一定時間内に起こるリムルス反応において、吸光度又は濁度の一定の時間当たりの変化率を求め、当該値を酵素反応量と結びつけることにより、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量を算出する手法である。
【００１０】
従来、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカン含量をカイネティック法で測定する方法としては、比色反応時間法及び比濁反応時間法が主に用いられてきたが、カブトガニ血球抽出液がエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンと接触した後、活性化されるまでに不応時間（ラグタイム）を要し、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの濃度や調製法及び由来（菌種）などにより不応時間がそれぞれ異なる場合がある。同一濃度のエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン等の含有物を含む検体においても、前記含有物の調製法、由来により測定法毎に測定値に大きな相違が見られる場合があった。この測定値の測定法による相違のため、例えば人工透析などの医療現場において、医療用具や人工透析液中のエンドトキシン量が過小に算出され（許容量を超えたエンドトキシン汚染があっても充分に検出されないため、偽陰性反応となる）、しばしばエンドトキシンショック等の重篤な症状を引き起こし、患者が危険にさらされることがある。
【００１１】
また、従来リムルス反応を用いたエンドトキシン測定法として最も信頼性が高い反応速度法は、感度と定量性に優れる反面、測定範囲が限定され、検体によっては適宜希釈を要するなどの煩雑な面があり、必ずしも実用的な方法とは言い難い面もあった。
【００１２】
上述のエンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンと同様に生体に対し好ましくはない生物活性を有する物質として、ペプチドグリカンが挙げられる。ペプチドグリカンは、細菌類の細胞壁構成成分であり、熱に対して非常に安定な物質として知られている。当該物質は、生体に対し発熱性、肝臓または腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）など、多くの生物活性を有しており、エンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンと同様に生体内、医薬品や医療用具からの除去が必要となる。
【００１３】
一方昆虫の体液には、体液のメラニン化に関与する、フェノール酸化酵素前駆体カスケードと呼ばれる一連の酵素群からなるカスケード系が存在していることが知られている。上述の(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンはこのカスケード系の引き金となって、カスケード反応を経て最終的にメラニンが生成する（Onishi,Annot.Zool.Jpn.,27,33-39(1954)；Ashida and Onishi, Arch.Biochem.Biophys.,122,411-416(1967)；Brunet, Insect biochem.,10,467-500(1980)；Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis,239-265,Japan Sci. Press(1990)；Ashida and Dohke, Insect Biochem.,10,37-47(1980) ）。当該カスケードを利用して、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンの総量を測定する試薬が和光純薬工業株式会社から「SLP試薬」として販売され、その測定方法としては上述のリムルス反応の測定と類似した反応時間法が用いられている。しかしフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応も、前述のリムルス反応と同様にＳ字状の反応曲線を描く反応であるため、リムルス反応によるエンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンの測定と同様の問題点があり、正確な測定は困難である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上述した理由により、より正確に検体中のエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカン含量を反映し、迅速に実施できる、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応によるエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカンの測定法の開発が期待されている。本発明はこのような測定法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題点を鑑みて鋭意検討の結果、酵素反応パラメータ値の、酵素反応の初期の段階における特定の範囲の変化に要する時間を指標とすることにより上述の問題点を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、酵素反応に関与する物質の定量法であって、酵素反応パラメータ値を経時的に測定し、測定値が、第１の設定変化量に到達した時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、計測時間と酵素反応に関与する物質量を関連づけることを特徴とする酵素反応測定法（以下、本発明測定法ともいう）を提供する。
【００１７】
本発明測定法において、好ましくは、第１の設定変化量は反応開始時からの変化量であり、第２の設定変化量は第１の設定変化量からの変化量である。また、好ましくは、第１の設定変化量を酵素反応パラメータ値の最大変化量の0.1〜10％の範囲内に、第２の設定変化量を前記最大変化量の0.5〜25％の範囲内にそれぞれ設定する。
【００１８】
酵素反応パラメータ値は、好ましくは、吸光度、濁度、透過光量、蛍光偏光、蛍光消光又は散乱光量であり、これらは酵素反応によって発色合成基質から生じる発色物質量、メラニン量または検体のゲル化の程度により変化する。酵素反応に関与する物質は、好ましくは、エンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカンである。酵素反応は、好ましくは、リムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により、詳細に説明する。
本発明測定法は、酵素反応が関与する反応を測定することによって、前記酵素反応に関与する物質を定量するための方法である。より具体的には、酵素反応生成物により変化する酵素反応パラメータ値を経時的に測定して酵素反応に関与する物質を定量する方法であって、酵素反応パラメータ値の第１の設定変化量と第２の設定変化量を設定し、酵素反応パラメータ値の変化量が第１の設定変化量に到達した時点から時間の計測を開始し、第１の設定変化量からの酵素反応パラメータ値の変化量が、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、計測時間と酵素反応に関与する物質量を関連づけることを特徴とする酵素反応測定法である。
【００２０】
本発明において、酵素反応は酵素が複数関与する反応も包含する。前記酵素が複数関与する反応は、酵素反応が複数関与した複数の酵素が関与する段階的な酵素反応（カスケード反応）の全反応及びそれぞれの酵素反応を包含する。本発明測定方法により測定することが好ましい反応の例としては、▲１▼リムルス反応、すなわち、カブトガニの血液凝固カスケード機構を含む酵素反応、▲２▼フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応、すなわち、昆虫の体液のメラニン形成のためのカスケード機構を含む酵素反応が挙げられる。リムルス反応及びそれを利用したリムルステスト並びにフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応及びそれを利用したSLP試薬については、竹沢真吾編「透析液エンドトキシンがよくわかる本」東京医学社発行（1995年）第31頁〜第41頁及び第137頁〜第143頁に詳細な説明がある。
【００２１】
前記酵素反応に関与する物質とは、酵素反応の速度または生成物の量に影響を与える物質を意味し、例えば酵素反応の主体である酵素及びその基質並びに酵素前駆体の活性化のトリガーとなる物質が挙げられる。トリガーとなる物質としては、例えばリムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応の際に酵素前駆体を活性化して一連の反応の引き金（トリガー）となるエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン及びペプチドグリカンなどの物質が知られている。本発明測定法は、上記物質の定量に用いることが可能である。具体的には、例えばリムルス反応を用いるエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を用いるペプチドグリカン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量、あるいは血液凝固・線溶系による血液凝固因子及び線溶因子の定量など酵素反応が関与した反応を用いる測定に適用することが可能である。
【００２２】
酵素反応パラメータ値とは、上記酵素反応生成物の量の変化を正確に反映し、酵素反応生成物量により変化する。このような酵素反応パラメータ値は例えば、反応溶液の吸光度、濁度、透過光量、蛍光偏光、蛍光消光又は散乱光量などの他に酵素反応の結果変化したｐＨ、伝導度、比電離及び比抵抗などが挙げられ、磁気又は電気信号に変換、増幅しうるものであれば好ましい。上記リムルス反応及びフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応に関与する物質を測定する際の酵素反応パラメータ値としては、具体的には例えば吸光度、濁度、又は透過光量を測定することが好ましいがこれらに限定はされない。上記酵素反応生成物は例えばリムルス反応を利用したエンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンの定量において実際に用いられているゲル（濁度で測定）、公知のペプチド発色合成基質より生じる発色物質（吸光度で測定）又は、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応により生じるメラニン（吸光度で測定）等が挙げられる。
【００２３】
本発明においては設定変化量として２値を設定する。上記設定変化量のうち第１の設定変化量は、通常には、反応を開始した時点での酵素反応パラメータ値（初期値）からの変化量であり、好ましくは該酵素反応パラメータ値の最大変化量（便宜上最大変化量をΔmaxと記載する）の0.1〜10％、より好ましくは0.5〜7％の範囲内に設定する。また、第２の設定変化量は、通常には、第１の設定変化量からの変化量であり、好ましくはΔmaxの0.5〜25％、より好ましくは1〜10％の範囲内に設定する。
【００２４】
最大変化量は、既知濃度の酵素反応に関与する物質を標準物質として用いて予備試験を行うことによって算出できる。また、ペプチド発色合成基質などを用いて測定を行う場合は、酵素反応パラメータ値の最大変化量は使用するペプチド発色合成基質量により予め決定できるため、前記設定変化量を発色合成基質量から予め算出してもよい。このように最大変化量を算出すれば、各設定変化量を予め設定しておくことが可能になる。
【００２５】
あるいは、迅速性が必要とされない場合には、反応の終了後に、酵素反応パラメータ値の全測定値を得た後、その最大変化量を算出し、第１及び第２の設定変化量を設定し、測定値が第１の設定変化量変化した時点から、第２の設定変化量変化するまでの時間を上記測定値から算出してもよい。
【００２６】
上記酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に達した時点から、引き続き第２の設定変化量に到達するまでの時間は、酵素反応パラメータをある一定間隔で読みとった数値を連続的にプロットして算出する方法、及び該パラメータが設定した設定変化量に充たない直前の値と超えた直後の値を連続変化量と仮定し、それらの一次回帰式により換算した補正値として求める方法などが挙げられるが、後者が精度の点で好ましい。
【００２７】
上記酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に到達時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間と、酵素反応に関与する物質量の関連づけは、この物質の標準物質を用いて検量線を作成し、検体に関し測定された時間と検量線を用いて物質量を求めることによって行えばよい。
【００２８】
なお、本発明測定法は、設定変化量を２値設定し、酵素反応パラメータ値の初期値からの変化量が第１の設定変化量に達した時点から、さらに第２の設定変化量変化するまでの時間を計測する他は、従来の酵素反応パラメータ値の測定に基づく酵素反応測定法と同様にして行うことができる。すなわち、用いる試薬や反応条件は従来と同様でもよい。
【００２９】
エンドトキシンを定量する場合の具体例としては、リムルス反応に関与する各因子であるＣ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体、及び、凝固酵素の基質としてのペプチド発色合成基質(Boc-Leu-Gly-Arg-CONH-pNAなど）またはコアグロゲンを含むリムルス試薬の全てまたは一部を検体または標準物質溶液と混合し、所定の温度で反応させ、反応液の吸光度または透過光量が本発明の所定の変化に要した時間を測定し、標準物質について測定された時間から作成した検量線に基づき検体中のエンドトキシン量を求める方法が挙げられる。
【００３０】
(1→3)-β-D-グルカンを定量する場合の具体例としては、リムルス試薬として、Ｇ因子、凝固酵素前駆体、及び、凝固酵素の基質としてのペプチド発色合成基質(Boc-Leu-Gly-Arg-CONH-pNAなど）またはコアグロゲンを含むリムルス試薬を用いる方法が挙げられる。
【００３１】
ペプチドグリカンを定量する試薬の具体例としては、例えば▲１▼SLP試薬などの少なくともペプチドグリカンに反応するフェノール酸化酵素前駆体カスケードが存在する試薬又は昆虫体液、及び▲２▼(1→3)-β-D-グルカン結合性タンパク質、抗(1→3)-β-D-グルカン抗体、(1→3)-β-D-グルカン分解酵素、アプロチニン及びアルキルグルコシド等の(1→3)-β-D-グルカンによるフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を実質的に阻害する物質を▲１▼の試薬または昆虫体液に混合したものが挙げられる。このような試薬を検体又はペプチドグリカン標準物質溶液と混合し、所定の温度で反応させ、反応液の吸光度又は透過光量が本発明方法の所定の設定変化量変化するのに要した時間を測定し、前記ペプチドグリカン標準物質について測定された時間から作成した検量線に基づき検体中のペプチドグリカン量を求める方法が挙げられる。前記吸光度の測定は、フェノール酸化酵素前駆体カスケード反応により生成するメラニン色素の吸光度を測定する公知の方法を採用することができる。
【００３２】
また(1→3)-β-D-グルカンをフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応を利用して測定する場合、▲１▼少なくとも(1→3)-β-D-グルカンをトリガーとするフェノール酸化酵素前駆体カスケードが含まれる試薬又は昆虫体液、または▲２▼▲１▼の試薬または昆虫体液に抗ペプチドグリカン認識タンパク質抗体、強アルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化リチウム又は水酸化カリウムなど）、リゾチーム、タンパク質分解酵素又は抗ペプチドグリカン抗体を混合した試薬等を用いることができる。これらの試薬を用いて上記ペプチドグリカンと同様に、検体中の(1→3)-β-D-グルカンを定量することも可能である。
【００３３】
本発明測定法を実施するための測定機器としては、少なくとも下記記載の構成を含むものが挙げられる。
１．設定変化量を入力し、当該設定変化量を記憶する手段
２．酵素反応パラメータ値を測定し、当該測定値を入力及び記憶する手段
３．酵素反応パラメータ値が第１の設定変化量に到達した時点から、第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、当該値を記憶する手段
４．上記変化時間を表示する手段
【００３４】
１記載の設定変化量の入力手段としては例えばキーボード、タッチパネル、テンキーなどが挙げられ特に限定はされない。２記載の酵素反応パラメータ値の測定手段としては、上記本発明測定法中に記載の酵素反応パラメータ値を測定することが可能な構成を有していれば特に限定はされないが、上記酵素反応パラメータ値の好ましい形態として記載した吸光度及び透過光量を測定することが可能な構成としては、吸光光度計又は分光光度計等を構成要素とすることが好ましい。４記載の表示の手段は例えば電光表示パネル又は液晶パネルなどが挙げられる。また、上記１〜３記載の値、時間を記憶する手段としては、例えば電子記憶媒体（例えばRAM、メモリーカードなど）、磁気記憶媒体（光ディスク、ハードディスク、フロッピーディスクなど）又は紙媒体（パンチカードなど）が挙げられ、特に限定はされない。
【００３５】
また、上記１〜４記載の構成以外に更にそれぞれの構成において記憶された値を表示する仕組み（例えば電光表示パネル又は液晶パネルなど）、恒温漕、タイマー又はプリンターなど必要に応じて他の構成を含むことを妨げない。また、96穴マルチプレートなどを反応容器として使用し、多検体に対して本発明測定法を同時に行うことを可能とするための電子制御機構を備えていてもよい。さらに、標準物質の濃度と標準物質それぞれを用いて測定した変化時間の関係を示す回帰式を算出し、算出された回帰式及び検体の変化時間から、検体中の測定対象物質の濃度を算出する手段、前記検体中の測定対象物質の濃度を表示する手段等を備えていてもよい。
【００３６】
上記構成はそれぞれ別の装置であってもよく、また一体型の一装置の形態であってもよい。
【００３７】
【実施例】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の目的を逸脱しない限りにおいて種々の実施形態をとりうるものであり、本実施例により本発明は制限されるものではない。
【００３８】
【実施例１】
E.coli UKT-B由来の日本薬局方エンドトキシン標準品を注射用蒸留水で適宜希釈し、10EU/ml、2.5EU/ml、0.625EU/ml、0.156EU/ml、0.039EU/mlの計5濃度のエンドトキシン溶液を調製した。これらの標準液及び日局方ウサギ発熱性試験を行った検体の50μｌを96ウェルマイクロプレート（トキシペットプレート96F、生化学工業）のウェルに分注し、さらにエンドトキシン特異的比色法リムルス試薬（エンドスペシー、生化学工業）50μｌを加え、測定機器にセットし、37℃で30分間反応を行ない、405nm（対照 492nm）における吸光度変化を15秒毎にモニターした（カイネティック比色法）。次に、このモニター値から以下の▲１▼及び▲２▼の方法によってそれぞれ測定値を算出した。
【００３９】
▲１▼本発明測定法（delta T assay）
第１の設定変化量を0.005、第２の設定変化量を0.015に設定（第１の設定変化量0.005は最大変化量0.7（エンドトキシン特異的比色法リムルス試薬に含まれるペプチド発色合成基質量から算出）の0.7％に相当、第２の設定変化量0.015は上記最大変化量0.7の1.9％に相当）し、吸光度が0.005に達した時点から、前記0.005からの当該酵素反応パラメータ値の変化量が0.015である吸光度0.020に達するまでの時間を測定した。
▲２▼比色反応時間法
反応開始から設定吸光度0.015に達するまでの時間を測定した。
【００４０】
つぎに、これらのモードでの測定値の対数値をエンドトキシン濃度の対数値に対してプロットして検量線を作成した。その検量線より日局方ウサギ発熱性試験を行った３検体中のエンドトキシン濃度を自動算出した。なお、用いたウサギは、体重1.8〜2kgの栄養状態の良好な健康個体で、３匹の個体に注射した後、直腸内における体温を1時間間隔で3回測定し、体温上昇0.6℃以上のウサギが2〜3匹の時を陽性と判定した（0.5EU/mL以上で陽性となる）。それらの結果を表１に示す。表１から明らかなように、３種のエンドトキシン濃度が異なる検体について、一定のしきい値に到達するまでの時間を解析する従来の反応時間法（delta OD-time assay）の１つである比色反応時間法では、ウサギ発熱性試験に比べ低い活性しか得られず、ウサギ発熱試験の代わりに比色反応時間法で注射薬の安全性を評価すると、検体No.2のように偽陰性（＜0.5EU/ml）となってしまうものも認められた。一方、本発明測定法では、このような乖離がなく、リムルス試験法以外のエンドトキシン測定法としてのウサギ発熱性試験による発熱活性との同等性が認められた。
【００４１】
【表１】
【実施例２】
実施例１で用いたエンドトキシン及び検体の50μlをそれぞれ別々にトキシペットプレート96Fのウェルに分注し，さらにリムルスHSテストワコー（和光純薬工業）50μlを加え、測定機器にセットし、37℃で60分間反応を行い、405nmにおける吸光度変化を15秒毎にモニターした（カイネティック比濁法）。このモニター値を上記実施例１と同様に第１の設定変化量を0.010 、第２の設定変化量を0.020に設定して、濁度変化量が第１の設定変化量に到達した時点から時間の計測を開始し、第１の設定変化量からの濁度変化量が第２の設定変化量に到達するまでの時間（min）を計測した（▲１▼本発明測定法）。また、同様に試験管にエンドトキシン及び検体を100μlずつ別々に分注し、さらにリムルスHSテストワコーを100μl加えて混合し、経時的に透過光量を測定し、一定の濁度に達するまでの時間（min）を計測する比濁時間分析装置（トキシノメーターET301、和光純薬工業）にセットし、37℃で60分間反応させ測定した（▲２▼比濁時間分析法）。それらの結果を表２に示す。表２から明らかなように本発明測定法をカイネティック比濁法に適用した場合も、実施例１のカイネティック比色法に適用した場合と同様にすべての検体に対して発熱活性と乖離がなく、同等の力価が得られ、それに対し従来の比濁時間分析法では実施例１の比色反応時間法同様発熱活性に比べ低い活性しか得られず乖離してしまい、発熱活性に対して検体No.2のように偽陰性（＜0.5EU/mL）となるものが認められた。
【００４３】
【表２】
【実施例３】
E.coli UKT-B由来の日本薬局方エンドトキシン標準品とE.coli 0113由来の米国薬局方エンドトキシン標準品を用いて、それらの種々の濃度の50μlをトキシペットプレート96Fのウェルに分注し、エンドスペシー50μlを加えて、測定機器にセットし、実施例１と同様に測定した。それらの測定値から実施例１と同様の本発明測定法及び従来の比色反応時間法により得られる時間を算出した。それらの対数値をエンドトキシン濃度の対数値に対してプロットし、１次回帰式を算出してそれぞれ４種の検量線の同等性につき比較検討した。それらの結果を表３に示す。
【００４５】
表３より明らかなように、一定の設定値に到達するまでの時間を解析する従来の比色反応時間法では、E.coli UKT-BとE.coli 0113由来のエンドトキシン標準品で、その回帰式の傾きに大きな相違が認められるが、本発明測定方法では、両者の間にほとんど有意差が認められない。すなわち本発明測定方法によれば、一種類のエンドトキシン標準品で作成した検量線から、検体中のエンドトキシンの種類に関わらず、検体中のエンドトキシン量が正確に定量できる。
【００４６】
【表３】
【発明の効果】
本発明により、反応速度変化を有する酵素反応を、迅速にかつ誤差を大幅に縮小して正確に測定することが可能となる。
Claims (6)
- 酵素反応パラメータ値を経時的に測定し、測定値が、酵素反応パラメータ値の初期値からの変化量であって、酵素反応パラメータ値の最大変化量の０．１〜１０％の範囲内である第１の設定変化量に到達した時点から、第１の設定変化量からの変化量であって、前記酵素反応パラメータ値の最大変化量の０．５〜２５％の範囲内である第２の設定変化量に達するまでの時間を計測し、酵素反応に関与する物質の標準物質を用いて、前記第１の設定変化量から前記第２の設定変化量に達する時間と物質量に基いて作成した検量線を用い、計測時間と酵素反応に関与する物質量を関連づけることを特徴とする酵素反応に関与する物質の定量法。
- 酵素反応パラメータ値が、吸光度、濁度、透過光量、蛍光偏光、蛍光消光又は散乱光量であることを特徴とする請求項１に記載の定量法。
- 酵素反応に関与する物質がエンドトキシン、(1→3)-β-D-グルカン又はペプチドグリカンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の定量法。
- 酵素反応がリムルス反応又はフェノール酸化酵素前駆体カスケード反応であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の定量法。
- 酵素反応に関与する物質が、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンであり、第１の設定変化量が酵素反応パラメータ値の最大変化量の０．５〜７％であり、第２の設定変化量が酵素反応パラメータ値の最大変化量の１〜１０％であり、酵素反応がリムルス反応であり、酵素反応生成物として発色合成基質から生じる発色物質を用い、当該発色物質の量の変化を吸光度にて測定する方法である、請求項１〜４の何れか１項に記載の定量法。
- 酵素反応に関与する物質が、エンドトキシン又は(1→3)-β-D-グルカンであり、第１の設定変化量が酵素反応パラメータ値の最大変化量の０．５〜７％であり、第２の設定変化量が酵素反応パラメータ値の最大変化量の１〜１０％であり、酵素反応がリムルス反応であり、酵素反応パラメータ値として、酵素反応生成物であるゲルによる濁度を用いる方法である、請求項１〜４の何れか１項に記載の定量法。
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