CN104132913A - 内毒素的检测和/或定量 - Google Patents

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Abstract

本文公开了使用生物层干涉量度法检测和/或定量内毒素。

Description

内毒素的检测和/或定量
发明背景
细菌内毒素可以从革兰氏阴性菌产生、分泌和/或释放。细菌内毒素会污染很多材料，诸如水、食物、药品和胃肠外制品。细菌内毒素可能会很危险，有时对人类来说是致命的。在众多工业中，药品、医疗装置、食品和饮料工业的制造商必须满足标准，以证明他们的产品没有包含可能有损接受者或消费者健康的水平的污染物。例如，一些药品和医疗装置的制造商可能不得不保证他们的产品没有可检测水平的革兰氏阴性菌内毒素。另外，为了迅速地开始对可能感染革兰氏阴性菌的患者进行适当医疗治疗，重要的是尽可能早地确定是否存在内毒素，并且如果可能，还应确定患者体内内毒素的浓度。
典型的用于内毒素的检验使用鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)，其中将LAL暴露于内毒素，导致产生一种产物的凝结级联，对该产物通过凝胶法(Gel-clot assay)、终点浊度分析法、动态比浊法或终点显色法来进行分析。
然而，还需要用于检测内毒素的存在和/或浓度的改进的方法和系统。
发明简述
本发明的一个实施方案提供了一种用于检验样本内毒素的方法，所述方法包括：(a)将待检验样本与LAL试剂接触，其中如果样本中存在内毒素的话，则内毒素与试剂反应，形成凝结产物；(b)用光纤顶部接触所述样本，其中如果存在凝结产物的话，所述凝结产物形成于光纤的顶部和/或与光纤顶部结合，其中所述光纤顶部具有光学厚度，当凝结产物形成和/或结合于光纤顶部时，所述光学厚度从初始厚度增加；(c)测定在接触样本后的所述光纤顶部的光学厚度，其中光学厚度从初始厚度增加表明存在内毒素，光学厚度没有增加表明不存在内毒素。在一些实施方案中，所述方法包括测定样本中的内毒素浓度。
在一些实施方案中，所述方法包括接触多个光纤顶部，并在接触样本后测定所述多个光纤顶部的光学厚度。在包括多个光纤的所述方法的那些实施方案中，这些光纤可以被单个使用和/或被安排成束。
在另一个实施方案中，提供了用于检验样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括具有光纤的生物传感器和LAL试剂，所述光纤具有顶部。
在另一个实施方案中，提供了用于分析样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括外壳，该外壳包括基座和盖罩，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，该反应室具有穿通所述侧壁的孔，该孔与所述槽相通；盖罩包括样本接收室和突出物，该突出物包括侧壁和至少一个通过突出物侧壁的孔，其中所述盖罩可拆卸地与基座接合。在更优选的实施方案中，所述反应室中具有LAL试剂，和/或光纤被安排在基座的槽中，其中所述光纤顶部通过所述孔与反应室相通。
根据本发明另一个实施方案，用于检验样本内毒素的试剂盒包括具有光纤的生物传感器、LAL试剂和外壳，所述光纤具有顶部，所述外壳包括基座和盖罩，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，该反应室具有通过所述侧壁的孔，所述孔与槽相通；盖罩包括样本接收室和突出物，突出物包括侧壁和至少一个通过所述突出物侧壁的孔，其中所述盖罩可拆卸地与所述基座接合，所述反应室中具有LAL试剂，所述光纤被安排在所述基座的槽内，其中光纤顶部通过孔与反应室相通。
附图的几个视图的简述
图1A和1B显示了适合用于根据本发明实施方案的检验的光学组件。
图2显示了在根据本发明实施方案的检验中不同内毒素浓度的剂量响应。
图3显示了在根据本发明实施方案的使用不同生物传感器和不同样本室的检验中不同内毒素浓度的剂量响应。图3A和3B显示了分别具有聚苯乙烯样本室和聚丙烯样本室的氨丙基甲硅烷(APS)官能化的生物传感器；图3C和3D显示了分别具有聚苯乙烯样本室和聚丙烯样本室的SiO2官能化的生物传感器。
图4显示了根据本发明实施方案，在包括振摇样本(图4A)和不振摇样本(图4B)的检验中具有不同内毒素浓度的剂量响应。
图5显示了根据本发明实施方案的试剂盒，示出了包括基座和盖罩的外壳，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，所述室具有通过侧壁的孔；所述盖罩包括样本接收室和突出物，所述突出物包括侧壁和至少一个通过突出物侧壁的孔，其中所述盖罩可拆卸地与所述基座接合。图5A显示了透视图和局部分解图，图5B和5C分别示出了基座的顶视图和前视图，还示出了安排在基座的槽内的具有顶部的光纤，其中所述顶部通过孔与所述反应室相通。
发明详述
在根据本发明的一个实施方案中，提供了一种检验样本内毒素的方法，所述方法包括:(a)将待检验样本与LAL试剂接触，其中如果样本中存在内毒素的话，则内毒素与试剂反应，形成凝结产物；(b)用光纤顶部接触所述样本，其中如果存在凝结产物的话，则凝结产物形成于光纤的顶部和/或与光纤顶部结合，其中所述光纤顶部具有光学厚度，当凝结产物形成和/或结合于光纤顶部时，所述光学厚度从初始厚度增加；(c)测定在接触样本后的所述光纤顶部的光学厚度，其中光学厚度从初始厚度增加表明存在内毒素，光学厚度没有增加表明不存在内毒素。
在一些实施方案中，所述方法包括测定样本中的内毒素浓度。
在一些实施方案中，所述方法包括接触多个光纤顶部，并在接触样本后测定所述多个光纤顶部的光学厚度。在包括多个光纤的所述方法的那些实施方案中，这些光纤可以被单个使用和/或被安排成束。
在一个实施方案中，提供了用于检验样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括具有光纤的生物传感器和LAL试剂，所述光纤具有顶部。
在另一个实施方案中，提供了用于检验样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括外壳，该外壳包括基座和盖罩，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，该反应室具有穿通所述侧壁的孔，该孔与所述槽相通；盖罩包括样本接收室和突出物，该突出物包括侧壁和至少一个通过突出物侧壁的孔，其中所述盖罩可拆卸地与基座接合。在更优选的实施方案中，所述反应室中具有LAL试剂，和/或光纤被安排在基座的槽中，其中所述光纤顶部通过所述孔与反应室相通。
在另一个实施方案中，提供了用于分析样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括具有光纤的生物传感器、LAL试剂和外壳，所述光纤具有顶部，所述外壳包括基座和盖罩，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，该反应室具有通过所述侧壁的孔，所述孔与槽相通；盖罩包括样本接收室和突出物，突出物包括侧壁和至少一个通过所述突出物侧壁的孔，其中所述盖罩可拆卸地与所述基座接合，所述反应室中具有LAL试剂，所述光纤被安排在所述基座的槽内，其中光纤顶部通过孔与反应室相通。
在试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒包括多个光纤；更优选其中所述试剂盒包括多个反应室，每个反应室包括至少一个光纤。
用于检测内毒素的传统系统具有以下一个或多个缺点：例如确定凝结是否形成可能是一个主观判断，和/或振摇样本可防止凝结形成或破坏所述凝结；浊度测量可能受到样本或样本室内存在的杂质的影响；加入试剂的时间和开始检测的时间必须仔细定好，需要色度法标记和/或次级染料；必须测定基质颜色的变化，和/或只可能进行终点测量，而不是进行实时监测。
与此相反，本发明提供了一种可再现的、可靠的、不需要标记的检验方法，需要用户最少的手工步骤，不需要控制定时。不需要测量浊度或基质颜色。该检验适合用于凝胶法和浊度计型LAL试剂。另外，可以迅速获得定量实时数据。
根据本发明，使用如下方法来测定样本内的内毒素的存在和/或
量：即，生物层干涉量度法(BLI)，一种无标记技术，涉及对于从两个表面反射的白光的分析：生物传感器顶部的表面(其可以包括形成层的结合材料)，和内参考层。在生物传感器顶部的材料或分子的结合将会增加顶部的光学厚度，导致波长移位，这是在顶部的层的厚度变化的直接量度。未结合材料或分子、周围介质的折射率变化和/或流速变化不会影响顶部层的厚度。传统上，BLI已经被用于与分析物和分析物-结合分子，其中一种类型的分子(例如分析物-结合分子)被固定在生物传感器顶部，将生物传感器顶部被放置在样本体积内，其它类型的分子(例如分析物分子)如果存在于样本体积的话，会特异地结合固定的分子，增加顶部层的厚度。
然而，本发明的发明人出人意料地发现，BLI可用于内毒素分析，不需要分析物和分析物-结合分子，不需要固定一种类型的分子到顶部用以特异性地结合样本中的其它类型分子。相反，在内毒素检验中，凝结级联产物可以分开并独立于生物传感器顶部形成，该产物随后结合到生物传感器顶部和/或所述凝结级联产物可以形成于生物传感器顶部。
本发明实施方案可以用于多种应用，例如用于在线、近线、实验室和医院、设施的内毒素污染的检测，在众多工业中，对于药品、医疗设备、食品、饮料，和电子工业的生产商特别有用。
根据本发明的实施方案可以对很多样本进行检验，样本来源自：例如水、原材料(诸如，但不限于，尿液，和用于制备药品的原料)，和生物样本。生物样本包括生物液，其包括任何处理或未处理的与活生物体相关的液体、尿液、脑脊液、腹水、唾液和血液，包括全血、脐带血、储存的或新鲜血；处理过的血液，例如用至少一种生理溶液，包括但不限于盐水、营养液，和/或抗凝剂溶液稀释过的血液；血液成分，诸如血小板浓缩物(PC)、富含血小板的血浆(PRP)、贫耗血小板的血浆(PPP)、无血小板血浆、血浆、新鲜冰冻血浆(FFP)、获自血浆的成分，浓集红细胞(PRC)、血沉棕黄层(BC)；衍生自血液或血液成分或衍生自骨髓的血制品；干细胞、分离自血浆并再悬浮于生理溶液或冷冻保护液的红细胞；和分离自血浆并再悬浮于生理溶液或冷冻保护液的血小板；在本文中，血液制品或生物流体指的是上面描述的那些成分，以及通过其他方法获得的并具有相似特性的类似血液制品或生物流体。上面描述的生物样本也可包括一种或多种如下另外的成分，例如：EDTA和肝素(例如包含血浆的生物样本也可包含EDTA和/或肝素)。
下面的定义用于本发明。
LAL试剂：LAL试剂包括获自甲壳纲动物的任何阿米巴样溶解产物，所述甲壳纲动物诸如鲎(例如(诸如美洲鲎属(Limulus spp.)、亚洲鲎属(Tachypleus spp.)，和蝎鲎属Carcinoscorpius spp.))以及合成的LAL试剂。很多LAL试剂适合用于本发明，并且适合的LAL试剂也是本领域已知的。适合的可商购的LAL试剂可以从例如CharlesRiver Laboratories,Associates of Cape Cod,Inc.,Wako ChemicalsUSA,和Lonza购买。LAL试剂典型的是冻干的，并用不含内毒素的水或低内毒素水(LEW)(有时称为“LAL试剂水”)重构。
生物层干涉量度法(BLI)：如上所述，BLI是无标记技术，涉及分析反射自两个表面的白光：生物传感器顶部的表面(其可包括形成层的结合材料)和内部参考层。在生物传感器顶部的材料或分子的结合将增加顶部的光学厚度，导致波长移位，这是顶部层厚度变化的直接量度。用于根据本发明实施方案的BLI技术公开在例如美国专利5,804,453和7,394,547,以及美国专利申请公开号2010/0093106和国际公开号WO2006/138294。很多化学方法适合于提供根据本发明实施方案的生物传感器官能化顶部。
很多材料适合用于包含样本体积，例如反应室或反应器皿、样本容器或包含所述反应室、反应器皿，和/或样本容器的试剂盒。如果需要，所述材料还可以适合包含例如LAL试剂和/或无LAL的水。可用于本发明的材料(用于形成容器、室和/或器皿的材料)通常是聚合物或玻璃，并包括例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚碳酸酯、玻璃(包括硼硅酸盐玻璃)和聚四氟乙烯(PTFE)。在一些实施方案中，用材料来涂敷所述容器、室和/或反应器皿(例如，用聚乙二醇(PEG)来涂敷，从而例如减少非特异性结合)。合适的材料和涂层是本领域已知的，包括可以商购的材料和涂层。
如在下面将要讨论的，在一些实施方案中，可能需要生物传感器顶部表面(例如顶部化学)比反应器皿的表面更具亲水性。
检验可以在多种形式上进行，例如，样本容器、反应室和/或反应器皿可包括管、池、筒、孔或支撑物，诸如多孔板(例如96-孔或384孔板)。样本可进行不止一种应用的测试，例如，用于研究实验室用途和/或医疗装置测试，和/或药品测试。
本发明实施方案可以在静态流体样本或流动流体样本上进行。
样本可以是任何合适的体积。典型的样本体积在大约4μl－大约250μl升范围，还可以使用更高或更低的体积。
检验可以在任何合适的温度进行，典型的温度范围在大约30℃－大约45℃，在一些实施方案中，优选的温度是37±0.5/1℃。
检验可以在任何合适的pH下进行，典型的pH范围在大约6-8。
本发明实施方案可以与多种数据分析方法兼容，所述数据分析方法包括，例如时间对阈值、曲线拟合(确定EC50和Hill斜率)、曲线下面积(AUC)、一阶导数、滞后时间的确定和改进的Ct算法。
可以如下进行本发明实施方案：使用多种BLI基的商购设备和系统，并可包括单个传感器和多个传感器(例如16个传感器)的设备和系统，其可以是无开关的，或者更优选有开关的设备和系统。合适的BLI基可商购的设备和系统包括，例如，购买自(Pall生命科学分公司,Port Washington,NY)商标名设备平台(例如,QK384/RED384,RED96,QKe/QK)，以及BLITZTM系统。
通常，用于本发明实施方案的BLI基系统包括光源、含有生物传感器的光学组件、从光源延伸到光学组件的第一光波导或光纤、携带从光学组件反射的光到检测器单元的第二光波导或光纤(所述检测器单元用于检测从光学组件反射的干涉光波长产生的干涉信号)，和光学耦合到光纤的光耦合器。来自光源的光被导向通过光学组件，并通过光学耦合组件反射回检测器。合适的光源、检测器单元、光纤和耦合组件都是本领域已知的。
以下将更详细地描述本发明的每个组件，相似的组件具有相似的参考符。
图1A示出了一个示例性的光学组件，其包括生物传感器26，以及从光源延伸到生物传感器的第一光波导或光纤32的远端区域的连接部分，其中所述光纤被固定连接到生物传感器。示出的生物传感器包括具有分别形成于其底部(远端)和上部(近端)面的第一和第二反射表面42、40的透明光学元件38。第一反射表面42的表面由凝结级联产物层形成。第二反射表面40形成为透明材料层，其具有明显高于光学元件38的折射率，使得该层用作反射导向生物传感器的一部分光。通过生物传感器内两个反射表面反射光束的干涉，可以测量在生物传感器的凝结级联产物的存在、浓度和/或结合率。由于所有其他层的厚度都保持不变，从所述两个表面反射的光波形成的干涉波根据厚度变化发生相位移。
图1B示出了另一个示例性的光学组件，其包括可拆卸地安装在第一光波导或光纤52远端的生物传感器50。示出的生物传感器包括具有第一和第二反射表面62、64的透明光学元件60，所述第一和第二反射表面62、64对应于图1A显示的第一和第二反射表面42、40。示出的生物传感器还包括第二光学元件66，第二光学元件66具有通常大于100nm、优选大于200nm的厚度。其中层64(优选具有小于约30nm的厚度)被夹在光学元件60和66之间，如所显示的。图1B还显示了柔性啮合臂54，其设计用来在光纤的末端上滑动，并通过形成于臂中的互补凹陷与光纤上的周缘或齿(détente)56啮合来抓住光纤。这种连接可以将生物传感器定位在光纤上，以提供光纤远端和光学组件正面(上部)之间的空隙58，通常该空隙大约100nm或更小，或等于大约2微米或更大。
生物传感器近端和远端之间的厚度“d”，即图1A和1B显示的两个反射面之间的厚度通常至少50nm,在一些实施方案中，为至少100nm(例如在大约100至大约5,000nm之间,更典型的大约400至大约1,000nm之间)。折射率和用于形成生物传感器的材料的实例包括公开于例如美国专利5,804,453和7,394,547,以及美国专利申请公开号2010/0093106，国际公开号WO2006/138294中的那些。
在一些实施方案(未显示)中，生物传感器包括可以连接到顶部连接器(可包括光纤束)的一次性检测器顶部(例如国际专利公开号WO2006/138294公开的那些)，其中所述一次性检测器顶部包括光纤部分(具有近端和远端，所述近端通过顶部连接器耦合到光纤；所述远端包括上面讨论的两个反射表面)和连接结构，检验系统被设计为一次可具有2个或更多个一次性顶部(例如8个顶部)。这样的系统可包括光耦合组件，用于执行光纤组件和连接器的收集，并可以在相同的光源和/或检测器单元中允许使用不同类型的耦合组件，在相同的光学耦合组件中允许使用不同类型的检测器顶部。
图5示出了用于本发明的示例性试剂盒1000，该试剂盒包括外壳500，该外壳500包括基座100和盖罩200，所述基座100包括槽120、具有侧壁110的反应室101(显示为环形室)，该室具有通过侧壁的孔111，该孔与槽相连通；盖罩200包括样本接收室(显示为环形室)201，端口202，突出物205，其包括侧壁210和至少一个通过突出物侧壁的孔211；其中所述盖罩可拆卸地接合到基座上。在示出的实施方案中，基座具有围绕样本接收室201的圈102，其中所述圈的内径通常对应于盖罩中突出物的外径。
如图5B(基座的顶视图)和5C(基座的前视图)所示，生物传感器的光纤优选被安排在基座的槽内，其中光纤顶部通过孔与反应室相通。在一些实施方案中，试剂盒还包括例如存在于反应室内的LAL试剂，这样，用户可以通过盖罩中的样本接收室加入样本，其中样本从样本接收室通过端口和突出物侧壁的孔进入到样本接收室，在此与LAL试剂接触，并且凝结级联产物形成在和/或结合于生物传感器的光纤顶部上。
在示出的实施方案中，所述试剂盒还包括固定组件300，用以将盖罩固定到基座和从基座释放盖罩。通常，固定组件包括至少一个臂(具有弯曲顶部的两个臂301显示为基座的一部分)和至少一个狭槽(作为盖罩一部分示出的两个狭槽302)，其中所述臂通过狭槽并且臂的顶部与盖罩的平面表面接合。优选构造固定组件使得只有当所述盖罩与基座准确对应时，盖罩才能与基座接合。例如，在示出的实施方案中，臂与狭槽偏移，于是盖罩和基座不能错误取向180°。
可以提供试剂盒作为无菌包装，例如作为硬壳和/或泡罩包装的一部分。
很多种反应室、反应器皿、样本容器和/或包含反应室、反应器皿、和/或样本容器的试剂盒适合用于本发明。
下列实施例用于说明本发明，但当然不应被视作以任何方式限制本发明的范围。在下列实验中，使用对照标准内毒素(Control StandardEndotoxin(CSE))或参考标准内毒素(Reference Standard Endotoxin(RSE))和低内毒素水(Low Endotoxin Water(LEW))来创建已知内毒素浓度标准。除非在实施例中另外说明，孔反应体积是80μl，包含320μg冻干LAL试剂；对照是不含内毒素的空白LEW；检验在37℃、pH6.3下进行。
经BLI，使用QKe设备(Pall生命科学分部,Port Washington,NY)分析实施例1、3-6和8的样本。
具体实施方式
实施例1
该实施例显示了在根据本发明实施方案检验的样本中可以测定多种内毒素浓度。
按照如美国专利7,394,547一般性描述的方法制备具有SiO2官能化顶部的生物传感器。
制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。用不含内毒素的水重新溶解冻干的LAL试剂(Associates of Cape CodInc.；East Falmouth,MA)，并将其与384孔聚丙烯板的孔中的RSE接触，以1000rpm搅拌。
经BLI分析样本，结果示于图2。
该实施例显示，检验的敏感度下至0.005EU/ml。
实施例2
该实施例使用折射计(model334610；Spectronic Instruments,Inc.,Rochester,NY)，测量了不同内毒素浓度下凝结发生时的折射率
在不含内毒素的微量离心管中混合溶液，并将20μl每种样本吸移到设备的样本台上。结果如下：
溶液 RI 温度(℃)
H2O 1.332 24
H2O+LAL试剂 1.333 24
H2O+LAL试剂+内毒素0.5EU/mL 1.333 24
H2O+LAL试剂+内毒素5EU/mL 1.333 24
H2O+LAL试剂+内毒素50EU/mL 1.333 24
H2O+LAL试剂+内毒素3000EU/mL 1.333 24
该实施例显示，即使使用浓度到3000EU/mL的不同浓度内毒素，在凝结发生时折射率(RT)也没有发生变化，因此，BLI信号与RI变化无关。
实施例3
该实施例显示，与传统的凝胶法检验相比，根据本发明实施方案使用凝胶法试剂进行的BLI检验具有更低的检测下限。
按照如美国专利7,394,547一般性描述的方法制备具有SiO2官能化顶部的生物传感器。
制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。用不含内毒素的水重新溶解冻干的LAL试剂(Associates of Cape CodInc.；East Falmouth,MA)，并将其与384孔聚丙烯板的孔中的内毒素接触，以1000rpm搅拌。
在50,5,0.5,0.05,0.005和0EU/mL内毒素浓度下，进行凝胶法检验(传统的)和根据本发明实施方案进行的BLI检验(使用凝胶法试剂)。在存在可检测浓度的内毒素时形成凝结。
传统的凝胶法检验显示，在60分钟后进行检验，在50,5,和0.5EU/mL的内毒素浓度下凝结保持。该检验显示在内毒素浓度为0.05EU/mL时发生不完全凝结，在0.005和0EU/mL内毒素浓度时没有发生凝结。
根据本发明实施方案使用凝胶法试剂进行的BLI检验，在34分钟后检验，显示在50,5,0.5和0.05EU/mL内毒素浓度下发生凝结。该检验显示，在0.005的内毒素浓度下显示弱的信号，而在0EU/mL内毒素浓度下没有信号。
该实施例显示，与传统的凝胶法检验相反，根据本发明实施方案的BLI检验具有至少0.05EU/mL的灵敏度，仅用了近乎一半的时间。
实施例4
该实施例显示了各种生物传感器化学和不同板可用于根据本发明实施方案的样本检验。
按照如美国专利7,394,547一般性描述的方法制备具有SiO2官能化顶部的生物传感器，按照美国专利申请公开号2010/0093106的一般性描述制备具有氨丙基甲硅烷(APS)官能化顶部的生物传感器。
制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。用不含内毒素的水重新溶解冻干的LAL试剂(Associates of Cape CodInc.；East Falmouth,MA)，并将其与96-孔聚苯乙烯板和384-孔聚丙烯板的孔中的内毒素接触，以1000rpm搅拌。
样本经BLI分析，结果显示于图3A-3D。
实施例显示，使用聚苯乙烯和聚丙烯板，通过SiO2官能化顶部和APS官能化顶部的生物传感器都可检测到50,5,和0.5EU/mL的内毒素浓度。使用聚苯乙烯和聚丙烯板，用APS官能化顶部的生物传感器还能够检测到0.05,和0.005EU/mL的内毒素浓度。
实施例5
该实施例显示根据本发明实施方案，在有或没有振摇的情况下检验样本都可以测定多种内毒素浓度。
按照如美国专利7,394,547一般性描述的方法制备具有SiO2官能化顶部的生物传感器。
制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。用不含内毒素的水重新溶解冻干的LAL试剂(Associates of Cape CodInc.；East Falmouth,MA)，并将其与384孔聚丙烯板的孔中的内毒素接触(孔反应体积是40μl；样本：LAL比例为4：1)，以1000rpm搅拌(振摇)和0rpm搅拌(无振摇)。
经BLI分析样本，结果显示于图4A和4B。
在该实施例中，没有振摇的显示反应下降，信号减弱，低浓度比高浓度更慢。然而，该实施例还显示，根据本发明实施方案，有或没有振摇都可以检测50,5,0.5,0.05,和0.005EU/mL的内毒素浓度。
实施例6
该实施例显示了根据本发明实施方案，经BLI可以在不同温度下检验样本时测定内毒素的浓度。
按照如美国专利7,394,547一般性描述的方法制备具有SiO2官能化顶部的生物传感器。制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。检验在33℃,35℃,37℃,和41℃温度下进行。
在所有4个温度下都可以检测到50,5,和0.5EU/mL的内毒素浓度。在33℃,35℃,和37℃下可检测到0.05EU的内毒素浓度。
实施例7
该实施例显示，根据本发明实施方案，经BLI检验样本在有或没有线性振摇(每分钟振摇次数)，与轨道振摇(rpm)相对，都可以在检验样本中测定内毒素浓度。
没有线性振摇地制备3000,300,30,3,和0EU/mL的内毒素浓度用于分析。
在线性振摇下制备350,35,3.5,和0.35EU/mL的内毒素浓度用于分析。
按照美国专利申请公开号2010/0093106的一般性描述制备具有APS官能化顶部的生物传感器。
使用BLITZTM系统(Pall生命科学分部,PortWashington,NY)经BLI分析该实施例的样本，所述系统可以使用线性振摇来振摇样本。
以每分钟1200下振摇一组样本，其他的则不振摇。
测试在25°下进行，每个振摇的分析的样本体积都是4μl，每个未振摇的样本体积都是200μl。
该实施例显示，可以在有或没有线性振摇的情况下检测样本的内毒素浓度，特别显示在没有振摇的情况下，可以在检验中测定3000,300,30,和3EU/mL的内毒素浓度，用线性振摇可以检测350,35,3.5,和0.35EU/mL的内毒素浓度。
实施例8
制备50,5,0.5,0.05,0.005,0.0005,和0EU/mL的内毒素浓度。按照美国专利申请公开号2010/0093106的一般性描述制备具有APS官能化顶部的生物传感器。
以100rpm,1000rpm,和1400rpm的轨道振摇速率振摇一组样本。
经BLI分析样本。在100rpm的振摇速率下，可以检测50,5,0.5,和0.05EU/mL的内毒素浓度。在1000rpm的振摇速率下,可以检测50,5,0.5,0.05,和0.005EU/mL的内毒素浓度。在1400rpm的振摇速率下，可以检测50,5,0.5,和0.05EU/mL的内毒素浓度。
该实施例显示，根据本发明实施方案，可以对在不同振摇速率下检验的样本中测定内毒素浓度。
该实施例还显示，振摇对于进行分析不是必需的，尽管一些振摇可以降低凝结时间，但更快地振摇对于进一步加速凝结并不是必需的。
这里引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利都通过参考以相同程度合并入本文，就如每个文献被单独并特别地指出将通过参考和列出全文内容引入一样。
使用的术语“一个”和“一种”和“这个”以及“至少一个”和类似的术语在描述本发明(特别是下文中的权利要求)的文中都涵盖单数和复数，除非本文中指出或清楚表明有相反的含义。使用术语“至少一个”之后列举的一个或多个项目(例如“A和B至少一个”)应该理解为选自所列项目(A或B)中的一个或所列项目(A和B)中任意两个或多个的组合，除非本文或文中其他地方明确表明相反含义。术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”应该理解为开放式术语(即“包括但不限于”)，除非另有指出。这里引用的数值范围意欲作为速记方法表示落在所述范围内的单个到每一个独立值，除非另外指出有别的含义。每个独立值都加入到说明书中就如特别引用的单个值那样。这里描述的所有方法都可以以适当的顺序执行，除非文中有特别指出或是清楚表明有相反含义。这里提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如“诸如”)仅仅为了更好地说明本发明，而不应该理解为对本发明范围的限制。说明书中没有任何语言应该被理解为表示未要求保护的元素为实施本发明必要的元素。
这里描述的本发明优选实施方案包括对于本发明人来说实施本发明已知最好的模式，这些优选实施方案的改变对于本领域技术人员来说在阅读说明书的基础上是显而易见的。本发明人预计本领域技术人员会适当地使用这些变化，本发明人预见本发明可以按照除这里具体描述以外的方法实施。因此，本发明包括所附权利要求说明的主题的任何修改和等同方式，按照可应用的法律允许的那样。另外，在所有可能的变化中，上述元素的任意组合也包括在本发明范围内，除非另外指出或清楚表明有相反含义。

Claims (8)

1.一种检验样本内毒素的方法，所述方法包括：
(a)将待检验样本与LAL试剂接触，其中如果样本中存在内毒素的话，则内毒素与试剂反应并形成凝结产物；
(b)用光纤顶部接触所述样本，其中，如果存在凝结产物的话，凝结产物在光纤顶部形成和/或结合于光纤顶部，其中所述光纤顶部具有光学厚度，当凝结产物形成于光纤顶部和/或结合于光纤顶部时，该光学厚度从初始厚度增加；
(c)测定在接触样本后的光纤顶部的光学厚度，其中光学厚度从初始厚度增加表明存在内毒素，光学厚度没有增加表明不存在内毒素。
2.权利要求1的方法，包括测定样本中内毒素的浓度。
3.权利要求1或2的方法，包括将样本放置在样本接收室内，将样本从样本接收室传送到其中具有LAL试剂的反应室，其中光纤顶部接触反应室内的样本，并测定在接触样本后光纤顶部的光学厚度。
4.权利要求1-3任一项的方法，包括将多个光纤顶部与样本接触，并确定接触样本后光纤顶部的光学厚度。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中将多个光纤顶部安排成束，所述方法包括将所述多个光纤顶部与样本接触，并确定接触样本后光纤顶部的光学厚度。
6.用于检验样本内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括生物传感器和外壳，所述生物传感器包括具有顶部的光纤；所述外壳包括基座和盖罩，所述基座包括槽和具有侧壁的反应室，所述反应室具有通过所述侧壁的孔，所述孔与槽相通；所述盖罩包括样本接收室和突出物，该突出物包括侧壁和通过所述突出物侧壁的至少一个孔，其中所述盖罩可拆卸地与所述基座接合。
7.权利要求6的试剂盒，进一步包括LAL试剂和生物传感器，所述生物传感器包括具有顶部的光纤，所述反应室中具有LAL试剂，所述光纤被安排在所述基座的槽内，其中所述光纤的顶部通过孔与所述反应室相通。
8.权利要求6或7的试剂盒，包括多个生物传感器和多个反应室，其中每个反应室与光纤顶部相通。
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