CN103149370A

CN103149370A - 脂蛋白(a)检测试剂盒

Info

Publication number: CN103149370A
Application number: CN2013100616682A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 方亮; 刘献文; 周海滨
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Meikang biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: CN103149370B

Abstract

本发明为一种脂蛋白(a)检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及参考校准品，其中试剂R1为HEPES缓冲体系，包括：0.5～10g/L HEPES、2～20g/L氯化纳、0.05～1.0ml/L吐温-20、0.1～2g/L牛血清蛋白、5-25g/L聚乙二醇-6000、1～5g/L EDTA、0.1～2g/L Proclin300；试剂R2包括：采用化学交联法制备得到的包被有抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体的表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物，0.5～10g/L HEPES缓冲液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜与试剂R2的重量体积比为0.01～0.5：100（g/L）。参考校准品为添加人重组载脂蛋白(a)的人血清或者类似血清基质的液体。本发明的试剂盒具有检测灵敏度，准确度高，精密度好，检测范围内线性好，稳定性好，生产成本低，空白吸光度低且具有抗干扰性能。

Description

脂蛋白(a)检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医学检测试剂盒，具体涉及一种运用胶乳增强免疫比浊法测定人血清中脂蛋白(a)的试剂盒。

背景技术

脂蛋白(a)(Lipoprotein(a),LP(a))是与低密度脂蛋白相似的一种脂蛋白，其核心部分除了含有和低密度脂蛋白组分相似的甘油三酯，磷脂，胆固醇，胆固醇酯等脂质和载脂蛋白B100(ApoB100)外，还含有低密度脂蛋白中没有的载脂蛋白(a)(Apolipoprotein(a),Apo(a))。因此，通常医学上通过检测载脂蛋白(a)的浓度来反应脂蛋白(a)在血清中的含量。载脂蛋白(a)的cDNA序列在1993已经被报道，从而推测出蛋白质的一级结构，发现它的相对分子质量为（250-800kDa），含有4529个氨基酸。载脂蛋白(a)通过双硫键联结于载脂蛋白B100。研究发现脂蛋白(a)在个体血清中浓度相对稳定，除遗传因素外，几乎不受年龄，性别，吸烟，饮食，脂代谢，药物，环境等因素的影响。因此脂蛋白(a)是一种比较稳定的生物标记物，大量的基础研究和临床研究表现脂蛋白(a)与动脉硬化性脑血管疾病的发生相关，是心脑血管疾病，糖尿病，肝胆疾病，终末期肾病及妇科等疾病的重要危险因素。

目前，已知的检测脂蛋白(a)浓度的方法有酶联免疫法，放射免疫法，荧光免疫测定法等检测方法，上述的测定方法的操作比较复杂，检测用时长，过度浪费资源的缺点，不适合做常规检测。中国国家知识产权局网站上公开了一种脂蛋白(a)检测试剂盒检测，采用胶乳增强免疫透射比浊法，具有稳定性好，检测方便的优点，但是人血清中含有的类风湿因子对试剂盒检测值易产生了干扰，使得个别类风湿因子含量高的血清产生了测量值出现假阳性。此外现有的胶乳增强免疫透射比浊法通过物理吸附法把多克隆抗体标记在不带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上，该不带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒的稳定性比较差，而且物理吸附的效果也不好，很容易会造成抗体从胶乳颗粒表面脱落。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种脂蛋白(a)检测试剂盒，它通过化学交联法把多克隆抗体标记在表面带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上的胶乳增强免疫透射比浊法，具有检测灵敏度高，准确度高，精密度好，检测范围内线性好，稳定性好，生产成本低，空白吸光度低且具有抗干扰性能的优点。

本发明所采用的技术方案为：一种脂蛋白(a)检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及参考校准品，其中试剂R1为HEPES缓冲体系，包括：0.5～10g/LHEPES、2～20g/L氯化纳、0.05～1.0ml/L吐温-20、0.1～2g/L牛血清蛋白、5～25g/L聚乙二醇-6000、1～5g/L EDTA、0.1～2g/L Proclin300；试剂R2包括：采用化学交联法制备得到的包被有抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体的表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物，0.5～10g/L HEPES缓冲液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜与试剂R2的重量体积比为0.01～0.5：100（g/L）；参考校准品：为添加人重组载脂蛋白(a)的人血清或者类似血清基质的液体，所述人重组载脂蛋白(a)蛋白由大肠杆菌或者酵母表达，经过亲和、离子交换纯化后得到。

上述类似血清基质的液体即类似人血清基质的溶液，如0.1%BSA，0.9%NaCl，0.2%NaN₃，15mM磷酸盐缓冲液（pH7.5）。

作为优选，所述试剂R1为1～5g/L HEPES、5～15g/L氯化纳、0.1～0.5ml/L吐温-20、0.5～1.5g/L牛血清蛋白、10～20g/L聚乙二醇-6000、2～3g/L EDTA、0.2～1g/L Proclin300。

进一步地，所述试剂R1为1.5g/L HEPES、9g/L氯化纳、0.2ml/L吐温-20、1g/L牛血清蛋白、10g/L聚乙二醇-6000、2.9g/L EDTA、0.9g/L Proclin300。

进一步地，所述HEPES的pH值为5.5～8.5。

进一步地，所述HEPES的pH值为7.0～7.8。

进一步地，所述试剂R1和试剂R2的容积比为4:1。

进一步地，所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的平均粒径为60～300nm。

进一步地，所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的平均粒径为100～200nm。

进一步地，所述试剂R2中阿斯巴甜与试剂R2的重量体积比为0.05～0.2：100（g/L）。

更进一步地，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。

本发明中的试剂盒运用了胶乳颗粒增强的免疫透射比浊法来测定血清中脂蛋白(a)的含量，其原理是将多克隆抗体通过化学交联的方法包被在表面带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上，多克隆抗体和生物样本中（通常是指血液和尿液）相应的抗原特异性结合形成复合物后，使包被抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒之间发生凝集。胶乳凝集的越多，越会阻碍光线的透过性，反应液的吸光度就越大，反应液吸光度的大小和胶乳颗粒凝集程度是成正比，即血液样本中抗原的浓度是和反应吸光度成正比。

与现有技术相比，本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的优点和有益效果：

1.本发明的试剂盒采用化学交联法把多克隆抗体标记在表面带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上。通过化学共价交联，抗体和胶乳的结合力更强，包被了抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒稳定性更高。通过上述化学交联方法制备的检测试剂盒，具有灵敏度高，特异性好、准确性高、抗干扰能力高及生产成本低的优点。

2.本发明试剂盒中的试剂R2中含有阿司巴甜，从而可以减轻或者去除血清中类风湿因子对试剂测值的干扰，避免对个别类风湿因子含量高的血清产生测值假阳性的问题。

附图说明

图1所示的是本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的脂蛋白(a)标准品的标准曲线图；

图2所示的是本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的线性分析图；

图3所示的是本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的相关性分析图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

脂蛋白(a)检测试剂盒的制备和测定方法

本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：

1．由本公司按照常规方法自制的羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体，亲和纯化后采用间接ELISA法测定效价为1:100000，满足本试剂的要求。该抗体特异性好，和其它抗原没有交叉反应。

2．本发明仅采用带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验，相应的检测波长为600nm。

3.重组载脂蛋白(a)由本公司自制，经过大肠杆菌或者酵母表达，亲和和离子交换纯化后的载脂蛋白(a)，纯度高，稳定性好，用于作为本试剂的标准品。

主要试剂和参考标准配制如下：

试剂R1为100mM HEPES缓冲液（pH7.5）。向该缓冲液中分别加入NaCl，BSA，吐温-20，PEG6000，EDTA和Proclin300。各组分的终浓度分别为0.9%NaCl，0.02%吐温-20，0.1%BSA，1%PEG6000和0.09%Proclin300。向缓冲液里添加完各组分后，用NaOH调节pH值到7.5。

试剂R2：用100mM pH=6.0的MES（2-吗啉乙磺酸缓冲液溶液）稀释胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。往胶乳溶液中加入EDAC，胶乳和EDAC的比例为10:1，混合均匀后，室温下反应15min，激活胶乳颗粒表面的羧基。反应后离心去上清液后，用15mM磷酸盐缓冲液（pH7.4）清洗胶乳颗粒。胶乳颗粒最终悬浮于15mM磷酸盐缓冲液中。在室温下，用15mM磷酸盐缓冲液稀释羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体，最后加入到胶乳颗粒悬浮液中，将两者混匀后在室温下反应3小时，抗体序列中的NH残基和活化后的胶乳颗粒表面羧基进行化学交联，之后加入封闭液（含0.1%BSA甘氨酸缓冲液）封闭1小时，离心去上清，用10mM HEPES缓冲液稀释至浓度为0.5%，再加入0.1%阿斯巴甜后获得试剂R2。

脂蛋白(a)试剂参考标准品制备：纯化好的重组载脂蛋白(a)蛋白，用相应的类似人血清基质的溶液（0.1%BSA，0.9%NaCl，0.2%NaN₃，15mM磷酸盐缓冲液pH7.5）进行稀释和过滤除菌，所述的脂蛋白(a)试剂盒校准品中载脂蛋白(a)含量分别为0mg/L，112.5mg/L，225mg/L，450mg/L，900mg/L，这些校准品均为无色透明液体。以国外著名厂家的脂蛋白(a)试剂盒，分别对制备的标准品进行测定和调整，调整合适后分别检测20次，求出平均值达到标准品所要求的四个梯度的浓度，分别为112.5mg/L，225mg/L，450mg/L，900mg/L，其中0mg/L为生理盐水。

脂蛋白(a)试剂测定方法是两点终点法，检测波长为600nm。试剂R1和试剂R2的用量分别为240μl和60μl。样本用量为4μl；反应方向向上，测定温度为37℃。样本与试剂R1混匀后，置37°C孵育5分钟，之后加入试剂R2，即开始读点，反应5min后读取另一点。使用日立7060自动生化分析仪测得5种不同含量的脂蛋白(a)标准品的标准曲线（如图1所示），其中X轴为脂蛋白(a)含量mg/l，Y轴为反应吸光度。

实施例2

脂蛋白(a)检测试剂盒在日立7060上各项性能指标测试

1.高值线性测定

添加重组载脂蛋白(a)于空白血清中，载脂蛋白(a)血清中的终浓度为1000mg/l。用0.9%Nacl稀释血清，得到5个含不同浓度载脂蛋白(a)的血清样本。载脂蛋白(a)理论浓度分别为62.5mg/L,125mg/L,250mg/L,500mg/L,1000mg/L。把空白血清作为载脂蛋白(a)浓度为0的样本。每个样品用本发明中的脂蛋白(a)试剂盒测3次，取均值。对测定值进行相关分析，从表1可见，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到1000mg/L，见图2，Y轴实测值，X轴理论值（载脂蛋白(a)的含量mg/L），相关系数的R²=0.999，回归方程Y=0.998x+1.514。说明本发明中脂蛋白(a)试剂盒线性好。

表1

	载脂蛋白(a)理论值(mg／L）	载脂蛋白(a)实际值(mg／L）
			1	0	0
2	62.5	60
			3	125	128
4	250	253
			5	500	505
6	1000	997

2.精密度试验

用本发明中的脂蛋白(a)试剂盒检测低、中、高值3个脂蛋白(a)含量的人血清样品各20次，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为1.2%，1.5和2.2%（见表2），而批间相对极差为2.7%（见表3）。

表2

样品1

样品2

样品3

测定次数	20	20	20
				平均值(mg／L)	35	150	500
最小值(mg／L)	33.3	148.2	495
				最大值(mg／L)	37.2	153.3	505.3
标准差(SD)	0.77	2.25	6
				变异系数(CV％)	2.2%	1.5%	1.2%

表3

3.抗干扰性试验

在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的样本测定值除以加入干扰物质前的样本测定值即为回收率，按照回收率在100%基础上，上下偏差不得超过10%来判断试剂是否受干扰物的影响。试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白，三酰甘油的浓度分别为640μmol/L，640μmol/L，8g/L,10mmol/L时，本发明的脂蛋白(a)试剂检测不受干扰物的影响（见表4）。

表4

4.稳定性试验

在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月和12月对同一血清样本进行测定，每个样本测20次（结果见表5）。血清样本分装后，储存于-20°C。4月，8月，12月与0月相比，测得值差异小，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。

表5

项目	0月	4月	8月	12月
					试剂空白吸光度A₀	0.6745	0.6654	0.6753	0.6678
样本测得值	145.2	148.8	140.1	139.2
					CV（%）	1.35	1.4	1.45	1.52

5.相关性试验

使用本发明脂蛋白(a)检测试剂盒和国外著名厂家的胶乳增强型脂蛋白(a)检测试剂盒，采用日立7060全自动生化分析仪对50份人血清（包含正常的异常标本）按各自设定的参数同时进行测定，（结果见图3，X、Y轴均为测定值，脂蛋白(a)浓度单位为mg/L）。两种试剂的相关系数为R²=0.991，回归方程为y=0.957x+5.130。结果表明本发明中的试剂盒与国外著名厂家的试剂盒测定血清标本中脂蛋白(a)浓度的相关性良好，具有很好的准确度。进一步，本试剂除了适用于日立7060全自动化分析仪，还可以用于其它的全自动或者半自动的生化分析仪。但是，本发明试剂盒和不同型号的生化仪使用时，具体测量参数可以根据主要参数做调整。

实施列3

本发明中的脂蛋白(a)检测试剂盒和同类型试剂盒在抗类风湿因子效果上的比较。

在同一份人血清样品中分别加入不同浓度的类风湿因子（600IU/ml,300IU/ml,150IU/ml,75IU/ml,38IU/ml,19IU/ml和0IU/ml）。加入类风湿因子后的样本测定值除以加入类风湿因子前的样本测定值即为回收率.在本实施列中，我们选择了某公司的脂蛋白(a)试剂盒和本发明中的脂蛋白(a)试剂盒在抗类风湿因子的效果上进行了比较。结果见表6、表7、表8：

表6.某公司脂蛋白(a)试剂抗类风湿因子性能检测

表7.本发明中的脂蛋白(a)试剂抗类风湿因子性能检测

表8本发明中的脂蛋白(a)试剂R2中无添加阿司巴甜的抗类风湿因子性能检测

实验结果表明，按照回收率在100%基础上，上下偏差不得超过10%来判断试剂的检测是否受干扰物的影响，某公司脂蛋白(a)试剂抗类风湿因子能力大约在150IU/ml。本发明中脂蛋白(a)试剂在检测的样本中含有600IU/ml类风湿因子的情况下，测得回收率仍然在偏差范围之内，说明本发明中的脂蛋白(a)试剂的抗类风湿因子能力至少可以达到600IU/ml。如本发明中的脂蛋白(a)试剂R2中无添加0.1%阿司巴甜，根据表8中的数据，试剂抗类风湿因子能力要差于某公司的脂蛋白(a)试剂。根据实验结果，阿司巴甜对增强试剂的抗类风湿因子能力起到了关键的作用。更进一步的说，含有阿司巴甜的本发明的脂蛋白(a)检测试剂盒的抗类风湿因子性能明显增强并且优于某公司的脂蛋白(a)检测试剂盒。

综上所述，本发明的脂蛋白(a)检测试剂盒具有空白吸光度低，特异性好、准确性好、稳定性好，抗干扰能力强及生产成本低的优点。

Claims

1.一种脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2及参考校准品，其中

试剂R1为HEPES缓冲体系，包括：HEPES0.5～10g/L、氯化纳2～20g/L、吐温-200.05～1.0ml/L、牛血清蛋白0.1～2g/L、聚乙二醇-60005-25g/L、EDTA1～5g/L、Proclin300 0.1～2g/L；

试剂R2包括：采用化学交联法制备得到的包被有抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体的表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物，0.5～10g/L HEPES缓冲液，阿斯巴甜，所述阿斯巴甜与试剂R2的重量体积比为0.01～0.5：100（g/L）；参考校准品：为添加人重组载脂蛋白(a)的人血清或者类似血清基质的液体，所述人重组载脂蛋白(a)蛋白由大肠杆菌或者酵母表达，经过亲和、离子交换纯化后得到。

2.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1为1～5g/L HEPES、5～15g/L氯化纳、0.1～0.5ml/L 吐温-20、0.5～1.5g/L牛血清蛋白、10～20g/L聚乙二醇-6000、2～3g/LEDTA、0.2～1g/L Proclin300。

3.根据权利要求2所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1为1.5g/L HEPES、9g/L氯化纳、0.2ml/L吐温-20、1g/L牛血清蛋白、10g/L聚乙二醇-6000、2.9g/L EDTA、0.9g/L Proclin300。

4.根据权利要求1～3中任一权利要求所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述HEPES的pH值为5.5～8.5。

5.根据权利要求4所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述HEPES的pH值为7.0～7.8。

6.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的容积比为4:1。

7.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的平均粒径为60～300nm。

8.根据权利要求7所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的平均粒径为100～200nm。

9.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中阿斯巴甜与试剂R2的重量体积比为0.05～0.2：100（g/L）。

10.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。