CN104198725B - 抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒 - Google Patents
抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒;所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;所述试剂R2是将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂20~500mmol/L和防腐剂1~10‰的50mM?Tirs缓冲液洗涤分散制备而得;所述CCP抗原胶乳颗粒是由CCP抗原与聚苯乙烯胶乳微球发生化学交联并封闭后形成。本发明的试剂盒采用乳胶增强免疫比浊法检测抗CCP抗体含量,灵敏度高,稳定性好,检测快速,从测定开始到得出结果仅需5~10分钟;能够在常规生化仪上进行大批量样本测定,大大提高了检测工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及乳胶增强免疫比浊法技术,具体涉及一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
背景技术
抗环瓜氨酸肽抗体是风湿自身抗体系统的一种,类风湿关节炎(RA)具有高特异性的瓜氨酸相关自身抗体系统包括AKA、APF、AFA、抗CCP抗体,这些抗体对早期RA诊断具有较好的特异性,类风湿关节炎(RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎症以及对称性、破坏性的关节病变为主要临床特征,其病程长,易反复,给患者造成很大痛苦。该病在我国的发病率约为0.4%,全球为0.5~1.0%,患者发病年龄多在20~50岁,女性多于男性,男女之比为1∶3。
抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片段,是以IgG型为主的抗体,对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性,且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病。在全世界大约有1%的人罹患此病。RA能引起关节的疼痛、僵直及肿胀。在发病2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤,并可引起多种并发症,如神经系统疾病、心包炎、淋巴腺炎等。因此,及早诊断RA及给予缓解病情的药物治疗,对控制病情非常重要。1998年,国外,首次报道的抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cycliccirullinatedpeptideantibodies,抗CCP抗体)的检测,对RA具有较高的敏感性和特异性,是RA新的血清标志物。
研究表明,在RA患者的血清中可以检测到抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA),其抗原位点是环瓜氨酸多肽(CCP)。该肽段是在肽基精氨酸脱亚胺酶的催化下,由蛋白中的精氨酸转化而成。由于CCP可以通过人工合成,对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性,而且抗环瓜氨酸多肽抗体的检测较APF和AKA检测具有一定的优越性,因此抗环瓜氨酸多肽抗体的检测对与RA的诊断具有重要意义。
一、间接免疫荧光法
该法的基本原理是用特异性的抗体与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物,继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗体。该方法评价:由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。但是其不足也是明显的:
(1)在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别;
(2)操作相对复杂,需要价格较昂贵的荧光显微镜,在很多基层医院难以推广,也不太适用于标本量较多的实验室;
(3)荧光测定中的本底较高,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难;
(4)结果判定需要有经验的专业人员,分析结果的客观性不足;
(5)只能进行定性检测,不能进行定量测定。
二、放射免疫分析法
放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗原,同抗体发生竞争性抑制反应,是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测抗原的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异,但其却需要具备尖端复杂的设备,且成本也不低。同时,还需要特殊的预防措施,因为其要用到放射性物质。因此,如今放射免疫分析法在很大程度上已经被ELISA所取代。
三、免疫印迹法
免疫印迹是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。其不足之处在于:
(1)只能进行定性和半定量分析,无法得出被检物质具体的量。
(2)操作步骤繁琐,试验用时较长。
(3)检测的灵敏度还有待提高。
四、酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法(ELISA)被广泛应用于检测抗环瓜氨酸多肽抗体,但该方法也存在着下述的不足之处:
酶联免疫法自动化程度不高,且受人为因素影响较大;放射免疫法存在着环境污染问题;而化学发光法灵敏度虽高,但测定线性范围较小且检测成本较高,需要特定化学发光检测仪,这些原因导致其应用范围较小。
乳胶增强免疫比浊法也是测定血清中CCP浓度的常用方法,与其他几种方法相比较,存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此,胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值,但是目前市场上的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好、试剂本底太高或检测线性范围窄等问题,有待改进。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足,提供一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。本发明通过抗CCP抗原与胶乳微球偶联,采用胶乳增强比浊法来测定人体血清CCP抗体的含量,运用该方法的试剂应具有操作简单,准确度高,重复性好,灵敏度高,且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪以及分光光度计上使用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;所述试剂R2是将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂20~500mmol/L和防腐剂1~10‰的50mmol/LTirs缓冲液洗涤分散制备而得;所述CCP抗原胶乳颗粒是由CCP抗原与聚苯乙烯胶乳微球发生化学交联并封闭后形成。
优选的,所述CCP抗原胶乳颗粒是通过包含如下步骤的方法制备而得:
A、将抗CCP抗原在pH值为4.0~6.0的20mmol/LMES溶液中进行活化;
B、将步骤A所得溶液用PBS(磷酸盐)缓冲溶液调节pH至6.1,加入粒径为50~500nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球溶液,在37℃孵育2~4小时;
C、将步骤B所得溶液用pH值为7.0~8.5的封闭液在37℃封闭5个小时以上;
D、将步骤C所得溶液经离心或过滤后,取沉淀,即得所述CCP抗原胶乳颗粒。
优选的,所述CCP抗原选自天然抗原、基因重组抗原、化学合成抗原或多肽中的一种或几种。
优选的,所述羧化改性聚苯乙烯胶乳微球为核壳结构,所述壳层为苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基苯烯酸形成的共聚物,所述核层为苯乙烯聚合物。
优选的,所述试剂R2中的第一稳定剂选自无关蛋白、无机盐、表面活性剂、助悬剂和抗氧化剂中的一种或多种。
更优选的,所述试剂R2中的无关蛋白选自牛血清白蛋白或明胶。
更优选的,所述试剂R2中的无机盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的一种或多种。
更优选的,所述试剂R2中的表面活性剂选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。该表面活性剂能够吸附在胶乳颗粒的表面,降低胶乳颗粒表面张力,使胶乳颗粒不易聚集,有效提高胶乳颗粒在溶液中的稳定性。
更优选的,所述试剂R2中的助悬剂选自乙二醇、丙三醇或麦芽糖。
更优选的,所述试剂R2中的抗氧化剂选自2,6-二叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、棓酸丙酯中的一种或几种。
优选的,所述试剂R2中的防腐剂选自山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚、PC300中的一种或几种。
优选的,
所述试剂R1含pH=7.0~7.6的缓冲液20~500mmol/L、表面活性剂50~300mmol/L、螯合剂5~100mmol/L、助悬剂5~200ml/L、加速剂5~500mmol/L和防腐剂1~10‰;
所述标准品是将含98~105U/ml抗环瓜氨酸肽抗体、1~30mg/ml缓冲液、15~120mol/L第二稳定剂、2~30mg/ml赋形剂和1~5‰防腐剂的混合溶液经分装冻干而成;
所述标准品稀释液含磷酸氢二钠2.6g/L、磷酸二氢钠4.8g/L、氯化钠5~25mmol/L;螯合剂10~60mmol/L,BSA(牛血清白蛋白)0.5~2%、蔗糖0.5~2.5%和防腐剂1~10‰。
优选的,所述试剂R1中的缓冲液选自Tirs(三羟甲基氨基甲烷)、MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、磷酸盐、MOPSO(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)中的一种或几种。
优选的,所述试剂R1中的表面活性剂选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。
优选的,所述试剂R1中的螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、二乙基三胺五乙酸或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸。
优选的,所述试剂R1中的助悬剂选自乙二醇、丙三醇或麦芽糖。采用乙二醇、丙三醇、麦芽糖等作为一种助悬剂,可以提高溶液的密度和粘度,使标准品中的胶乳颗粒能够长期悬浮在溶液中不会沉降而起到很好的稳定作用。
优选的,所述试剂R1中的加速剂选自PEG(乙二醇)200-10000或葡聚糖4000-12000中的一种或几种。更优选加速剂浓度为250~500mmol/L。
优选的,所述试剂R1中的防腐剂选自山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚、PC300中的一种或几种。
优选的,所述标准品中的缓冲液选自Tirs(三羟甲基氨基甲烷)、MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、磷酸盐、MOPSO(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)中的一种或几种。
优选的,所述标准品中的第二稳定剂选自无关蛋白和无机盐。
更优选的,所述标准品中的无关蛋白选自牛血清白蛋白或明胶。
更优选的,所述标准品中的无机盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的一种或多种。
优选的,所述标准品中的赋形剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乳糖、麦芽糖中的一种或几种。
优选的,所述标准品中的防腐剂选自山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚、PC300中的一种或几种。
优选的,所述标准品稀释液中的螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、二乙基三胺五乙酸或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸。
优选的,所述标准品稀释液中的防腐剂选自山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚、PC300中的一种或几种。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
所述试剂R2组成中的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球,是一种核壳形式的胶乳,胶乳核是苯乙烯聚合物,乳壳是苯乙烯,丙烯酸正丁酯,甲基苯烯酸形成的共聚物;本试剂盒采用苯乙烯聚合物形成的微球,具有高的折光系数和化学惰性,在其表面吸附或交联抗体或抗原,用免疫比浊法的原理检测样本中抗体或抗原的浓度,可以增加散射光和透射光的变化强度,从而提高检测灵敏度。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为2种不同含量的CCP参考标准的标准曲线,每个点代表不同含量CCP的参考标准,其中X轴表示CCP的含量,Y轴表示吸光度;
图2为对本试剂盒的线性范围验证示意图;其中X轴表示的是本发明试剂实际测试结果,Y轴表示的是稀释理论浓度,相关系数为R2=0.9981,回归方程为y=1.0327x+0.5524;
图3分别采用本发明试剂和武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂,采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关分析的示意图;其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果,Y轴表示的是某知名公司试剂测定的病人血清结果,相关系数R2=0.9951,回归方程为y=0.9911x+0.9066。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中的原料均为现有常用原料,可以直接通过商家购买获得。本发明以下实施例中没有特别说明的操作,均可以采用现有常规技术手段。
实施例1
本实施例的CCP检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;其制备具体如下:
试剂R1:
各种成分可以室温下依次添加,密封保存,备用。
试剂R2:
所述CCP抗原的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
步骤1:将抗CCP抗原在pH值为5.0~5.5的20mMMES溶液中进行活化;
步骤2:将步骤1所得溶液用PBS溶液调节pH至6.1,加入粒径为100~300nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球溶液,在37℃孵育2~3小时;
步骤3:将步骤2所得溶液用pH值为7.0~7.5的50mMTris在37℃封闭5个小时以上;
步骤4:将步骤3所得溶液经离心或过滤后,取沉淀,即CCP抗原胶乳颗粒;
步骤5:将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂(BSA)200~250mmol/L和防腐剂(NaN3)3~4‰的50mMTirs缓冲液洗涤分散即得试剂R2。
CCP标准品的制备:
将CCP用标准品稀释液稀释浓度至98~105U/ml的重组蛋白溶于30mg/mlBSA、30mg/ml甘露醇、mol/L氯化钠、1‰叠氮化钠,混合均匀。以0.5ml/瓶分装进行冻干,即得CCP标准品的冻干粉。取10瓶用0.5ml的纯化水复溶,作为样本用武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂,每瓶重复测试3次,计算总均值即为标识值,浓度为100.26U/ml。
CCP标准品的冻干粉用0.5ml的纯化水复溶,即可得到浓度为100U/ml的,并用纯化水稀释为不同浓度的标准品(5U/ml、100U/ml)。
上述标准品稀释液含磷酸氢二钠2.6g/L、磷酸二氢钠4.8g/L、氯化钠5~10mmol/L;乙二胺四乙酸二钠10~20mmol/L,BSA(牛血清白蛋白)0.5~1%、蔗糖0.5~1.0%和叠氮化钠1~3‰。
实施例2
将实施例1描述的CCP检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表1。分析方法:两点终点法,即试剂R1;R2的用量分别为150ul和50ul,样本量5ul。
采用本试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的2种不同含量的CCP标准品(自制)的曲线(如图1所示),每个点代表一个含量的参考标准品,其中X轴表示CCP含量(U/ml);Y轴表示吸光度。
表1
实施例3、线性范围
将接近线性范围上限的CCP的高浓度样本(100.26U/ml),用CCP稀释液将其按1/2,1/10,1/15,1/30,1/60稀释,共配制成6个不同浓度的溶液,用实施例2所述方法检测各浓度,每浓度重复测定3次,将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析,计算回归方程为y=1.0327x+0.5524,相关系数为R2=0.9981,表明本发明试剂盒在5.00U/ml~100.00U/ml线性范围内相关性较好,见图2。
实施例4
本实施例的CCP检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;其制备具体如下:
试剂R1:
各种成分可以室温下依次添加,密封保存,备用。
试剂R2:
所述CCP抗原的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
步骤1:将抗CCP抗原在pH值为5.5~6.0的20mMMES溶液中进行活化;
步骤2:将步骤1所得溶液用PBS溶液调节pH至6.1,加入粒径为300~500nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球溶液,在37℃孵育3~4小时;
步骤3:将步骤2所得溶液用pH值为8.0~8.5的50mMTris在37℃封闭5个小时以上;
步骤4:将步骤3所得溶液经离心或过滤后,取沉淀,即CCP抗原胶乳颗粒;
步骤5:将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂(质量比为2∶1∶1的BSA、醋酸钾、丙三醇)350~500mmol/L和防腐剂(苯甲酸钠)8~10‰的50mMTirs缓冲液洗涤分散即得试剂R2。
CCP标准品的制备:
将CCP用标准品稀释液稀释浓度至98~105U/ml的重组蛋白溶于30mg/mlTirs缓冲液、30mg/ml明胶、15mg/ml海藻糖、60mol/L醋酸钠、5‰亚硝酸钠,混合均匀。以0.5ml/瓶分装进行冻干,即得CCP标准品的冻干粉。取10瓶用0.5ml的纯化水复溶,作为样本用武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂,每瓶重复测试3次,计算总均值即为标识值,浓度为100.26U/ml。
CCP标准品的冻干粉用0.5ml的纯化水复溶,即可得到浓度为100U/ml的,并用纯化水稀释为不同浓度的标准品(5U/ml、100U/ml)。
上述标准品稀释液含磷酸氢二钠2.6g/L、磷酸二氢钠4.8g/L、氯化钠20~25mmol/L;乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸40~60mmol/L,BSA(牛血清白蛋白)1.5~2%、蔗糖2.0~2.5%和苯甲酸钠8~10‰。
线性检测的方法同实施例3,测得本实施例的试剂盒在5.00U/ml~100.00U/ml线性范围内相关性较好;对照试剂武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂的线性范围为20.00U/ml~80.00U/ml。
实施例5
本实施例的CCP检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;其制备具体如下:
试剂R1:
各种成分可以室温下依次添加,密封保存,备用。
试剂R2:
所述CCP抗原的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
步骤1:将抗CCP抗原在pH值为4.0~5.0的20mMMES溶液中进行活化;
步骤2:将步骤1所得溶液用PBS溶液调节pH至6.1,加入粒径为50~100nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球溶液,在37℃孵育2~3小时;
步骤3:将步骤2所得溶液用pH值为7.5~8.0的50mMTris在37℃封闭5个小时以上;
步骤4:将步骤3所得溶液经离心或过滤后,取沉淀,即CCP抗原胶乳颗粒;
步骤5:将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂(质量比为1∶1的BSA、氯化钠)20~100mmol/L和防腐剂(NaN3)1~3‰的50mMTirs缓冲液洗涤分散即得试剂R2。
CCP标准品的制备:
将CCP用标准品稀释液稀释浓度至98~105U/ml的重组蛋白溶于5mg/mlMES缓冲溶液、5mg/mlBSA、2mg/ml右旋糖苷、10mol/L氯化钠、3‰PC300,混合均匀。以0.5ml/瓶分装进行冻干,即得CCP标准品的冻干粉。取10瓶用0.5ml的纯化水复溶,作为样本用武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂,每瓶重复测试3次,计算总均值即为标识值,浓度为100.26U/ml。
CCP标准品的冻干粉用0.5ml的纯化水复溶,即可得到浓度为100U/ml的,并用纯化水稀释为不同浓度的标准品(5U/ml、100U/ml)。
上述标准品稀释液含磷酸氢二钠2.6g/L、磷酸二氢钠4.8g/L、氯化钠15~20mmol/L;二乙基三胺五乙酸30~40mmol/L,BSA(牛血清白蛋白)1.0~1.5%、蔗糖1.5~2.0%和山梨酸钠5~7‰。
线性检测的方法同实施例3,测得本实施例的试剂盒在5.00U/ml~100.00U/ml线性范围内相关性较好。
实施例6、检测试剂的相关性试验
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂,采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关性分析。按照与上述CCP测定方法中的参数进行测定,测定结果见图3,X,Y轴均为测定值(CCP的含量U/ml),由图3的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.9951,回归方程为y=0.9911x+0.9066。结果表明本试剂与某知名试剂测定病人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。
此外,以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
对比例1
本对比例同实施例1,所不同之处在于:CCP抗原的胶乳试剂的制备过程中,加入的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球的核层为苯乙烯聚合物,壳层为共聚物。
线性检测的方法同实施例3,测得本对比例的试剂盒在10.00U/ml~70.00U/ml线性范围内相关性较好。
对比例2
本对比例同实施例1,所不同之处在于:CCP抗原的胶乳试剂的制备过程中,加入的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球的核层为苯乙烯聚合物,壳层为苯乙烯与丙烯酸正丁酯的共聚物。
线性检测的方法同实施例3,测得本对比例的试剂盒在10.00U/ml~75.00U/ml线性范围内相关性较好。
对比例3
本对比例同实施例1,所不同之处在于:CCP抗原的胶乳试剂的制备过程中,加入的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球的核层为苯乙烯聚合物,壳层为苯乙烯与甲基丙烯酸的共聚物。
线性检测的方法同实施例3,测得本对比例的试剂盒在10.00U/ml~80.00U/ml线性范围内相关性较好。
进一步通过武汉康珠公司的CCP乳胶增强免疫比浊法试剂、实施例1试剂、对比例1、对比例2、对比例3在灵敏性、重复性和准确性方面的比较(表2),结果显示:本发明的聚苯乙烯胶乳微球具有更高的折光系数和化学惰性,在其表面吸附或交联抗体或抗原后,用免疫比浊法的原理检测样本中抗体或抗原的浓度在灵敏度、重复性和准确性方面具有明显优势。
表2
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、标准品和标准品稀释液;所述试剂R2是将CCP抗原胶乳颗粒用含第一稳定剂20~500mmol/L和防腐剂1~10‰的50mmol/LTris缓冲液洗涤分散制备而得;所述CCP抗原胶乳颗粒是由CCP抗原与聚苯乙烯胶乳微球发生化学交联并封闭后形成;
所述CCP抗原胶乳颗粒是通过包含如下步骤的方法制备而得:
A、将CCP抗原在pH值为4.0~6.0的20mmol/LMES溶液中进行活化;
B、将步骤A所得溶液用PBS溶液调节pH至6.1,加入粒径为50~500nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳微球溶液,在37℃孵育2~4小时;
C、将步骤B所得溶液用pH值为7.0~8.5的封闭液在37℃封闭5个小时以上;
D、将步骤C所得溶液经离心或过滤后,取沉淀,即得所述CCP抗原胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述CCP抗原选自天然抗原、基因重组抗原、化学合成抗原或多肽中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述羧化改性聚苯乙烯胶乳微球为核壳结构,所述壳层为苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基苯烯酸形成的共聚物,所述核层为苯乙烯聚合物。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的第一稳定剂选自无关蛋白、无机盐、表面活性剂、助悬剂和抗氧化剂中的一种或多种。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述试剂R1含pH=7.0~7.6的缓冲液20~500mmol/L、表面活性剂50~300mmol/L、螯合剂5~100mmol/L、助悬剂5~200ml/L、加速剂5~500mmol/L和防腐剂1~10‰;
所述标准品是将含98~105U/ml抗环瓜氨酸肽抗体、1~30mg/ml缓冲液、15~120mol/L第二稳定剂、2~30mg/ml赋形剂和1~5‰防腐剂的混合溶液经分装冻干而成;
所述标准品稀释液含磷酸氢二钠2.6g/L、磷酸二氢钠4.8g/L、氯化钠5~25mmol/L;螯合剂10~60mmol/L,BSA0.5~2%、蔗糖0.5~2.5%和防腐剂1~10‰。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1、标准品中的缓冲液分别选自Tris、MES、磷酸盐、MOPSO、DIPSO中的一种或几种;螯合剂分别选自乙二胺四乙酸二钠、二乙基三胺五乙酸或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的表面活性剂选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂;助悬剂选自乙二醇、丙三醇或麦芽糖;加速剂选自PEG200-10000、葡聚糖4000-12000中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1、试剂R2、标准品、标准品稀释液中的防腐剂分别选自山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硫柳汞、苯酚、PC300中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述标准品中的第二稳定剂选自无关蛋白和无机盐,赋形剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乳糖、麦芽糖中的一种或几种。
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CN106093425A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定抗角蛋白抗体的试剂盒及其制备方法 |
CN106153946A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-23 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种抗环瓜氨酸肽的测定试剂及其制备方法 |
CN106771251B (zh) * | 2017-01-10 | 2019-03-15 | 柏荣诊断产品(上海)有限公司 | 兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒 |
CN108414336B (zh) * | 2017-07-19 | 2021-01-01 | 北京北方生物技术研究所有限公司 | 一种提高抗原和抗体稳定性的稀释液 |
CN107942067B (zh) * | 2017-11-15 | 2019-01-11 | 浙江夸克生物科技有限公司 | 抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 |
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CN108614122A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-10-02 | 金华市强盛生物科技有限公司 | 一种抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 |
CN109100515A (zh) * | 2018-09-14 | 2018-12-28 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种测定抗环瓜氨酸肽抗体浓度的试剂盒及其制备方法 |
CN109724929A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-05-07 | 镇江金太医学检验实验室有限公司 | 一种抗坏瓜氨酸肽抗体的检测方法 |
CN110824160A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-21 | 迪亚莱博(张家港)生物科技有限公司 | 抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法 |
CN111208303A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-29 | 叶卫玲 | 一种定量检测抗环胍氨酸多肽抗体的检测方法及试剂盒 |
CN111579794A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-25 | 山东博科生物产业有限公司 | 抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒 |
CN112495319B (zh) * | 2020-09-29 | 2023-07-04 | 海丰生物科技(北京)有限公司 | 一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用 |
CN114167063B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-11-17 | 上海云泽生物科技有限公司 | 胶乳增强竞争免疫比浊检测试剂盒和方法及剑麻皂素的应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1863553A (zh) * | 2003-08-06 | 2006-11-15 | 美国政府健康及人类服务部 | 多糖-蛋白轭合物疫苗 |
CN102507918A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-06-20 | 四川省新成生物科技有限责任公司 | 抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 |
CN102809654A (zh) * | 2012-08-23 | 2012-12-05 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒 |
CN101819202B (zh) * | 2010-05-06 | 2012-12-26 | 上海太阳生物技术有限公司 | D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) |
CN102854314A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-02 | 深圳康美生物科技股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 |
CN103389383A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-13 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒 |
CN103439515A (zh) * | 2013-08-14 | 2013-12-11 | 南方医科大学 | 一种抗体效价的检测方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102327649A (zh) * | 2011-11-01 | 2012-01-25 | 浙江大学 | 二氧化钛纳米棒阵列嫁接rgd生物信号分子的方法 |
-
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- 2014-08-14 CN CN201410401284.5A patent/CN104198725B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1863553A (zh) * | 2003-08-06 | 2006-11-15 | 美国政府健康及人类服务部 | 多糖-蛋白轭合物疫苗 |
CN101819202B (zh) * | 2010-05-06 | 2012-12-26 | 上海太阳生物技术有限公司 | D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) |
CN102507918A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-06-20 | 四川省新成生物科技有限责任公司 | 抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 |
CN102809654A (zh) * | 2012-08-23 | 2012-12-05 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒 |
CN102854314A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-02 | 深圳康美生物科技股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 |
CN103389383A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-13 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒 |
CN103439515A (zh) * | 2013-08-14 | 2013-12-11 | 南方医科大学 | 一种抗体效价的检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in leprosy patients with articular involvement;S.L.E. Ribeiro,et al.;《Brazilian Journal of Medical and Biological Research》;20081231;第41卷;第1005-1010页 * |
抗环瓜氨酸肽抗体检测方法的研究进展;付琳 等;《广东医学》;20120630;第33卷(第12期);第1850-1853页 * |
Also Published As
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