CN112763731B - 一种脂蛋白(a)测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种脂蛋白(a)测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1由以下质量浓度的组分组成：缓冲液、无机盐、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、抗干扰剂、所述试剂2由以下质量浓度的组分组成：缓冲液、表面活性剂、稳定剂、封闭剂、脂蛋白(a)单抗乳胶颗粒、防腐剂。本发明试剂盒通过在试剂1中添加抗干扰剂，提高了脂蛋白(a)胶乳免疫比浊法试剂的抗干扰能力、分析灵敏度及精密度，且未提高试剂研发成本，更易适应现代化临床检验医学的发展。

Description

一种脂蛋白(a)测定试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白(a)测定试剂盒及其检测方法。

背景技术

脂蛋白(a)【Lipoprotein(a)，简称Lp(a)】，是一种富含胆固醇的特殊血浆脂蛋白，是1963年由挪威遗传学家Berg在制备低密度脂蛋白(LDL)抗体的过程中首先发现的特殊大分子脂蛋白，随后并将其命名为脂蛋白(a)。20世纪80年代末，人们发现脂蛋白(a)与动脉粥样硬化有关，与此同时，Mclean发现脂蛋白(a)与纤溶酶原(Plasminogen，PLG)的结构具有高度同源性。

肝脏是脂蛋白(a)合成的主要场所，其主要的生理功能是阻止血管内血块溶解，病理上可促进动脉粥样硬化心脑血管病、急性心肌梗死、家族性高胆固醇血症、糖尿病、大动脉瘤及某些癌症等形成。脂蛋白水平持续升高与心绞痛、心肌梗死、脑溢血有密切关系，是脑卒中和冠心病的独立危险因子，其减低通常见于肝脏疾病、酗酒、摄入新霉素等药物后。

脂蛋白(a)的核心部分由甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇酯等脂质和载脂蛋白B100组成，结构类似低密度脂蛋白(LDL)，但其含有一个独特的Apo(a)，后者在其它任何脂蛋白中都不存在。

脂蛋白(a)的浓度主要取决于其合成速率，而与分解速率基本无关。据有关资料显示，脂蛋白(a)浓度的个体差异大，在人群中呈偏态分布，低者为不能检测(定性为阴性，定量测定为零)，高者为显著高值(可达1000mg/L以上)，这种差异最主要由Apo(a)基因位点决定。但在同一个体内，水平保持相对稳定。各种方法测脂蛋白(a)所得参考范围大致相近，目前国内外所采用的判断标准基本相同：一般认为300mg/L为临界水平，大于300mg/L以上作为病理性增高。

早期检测脂蛋白(a)多用电泳法，观察β和前β脂蛋白之间是否出现额外的脂蛋白(a)区带，但此法灵敏度低，多用于定性检测。随后相继研制开发出一些直接测定脂蛋白(a)的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(RID)、电免疫扩散法(EID)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫浊度法【包括免疫散射比浊法(INA)和免疫透射比浊法(ITA)】、解离增强配体荧光免疫测定法(DELFIA)等。

辐射状免疫扩散法与电免疫扩散法因操作简便，不需特殊仪器，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。放射免疫测定法，由于试剂保存时间短、自动化程度低，同时会造成放射性物质环境污染，基本已被淘汰。解离增强配体荧光免疫测定法因需特殊仪器，国内也较少应用。

目前国内临床实验室最常用的方法为酶联免疫吸附试验(ELASA)法与免疫浊度法(INA、ITA)。酶联免疫吸附试验法虽然在临床上使用了近二十年，但是其精密度相对较低、操作复杂且耗时长，自动化程度低；免疫浊度法，又可分为散射比浊(INA)和透射比浊(ITA)，这类方法的优点是快速简便，精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测，缺点是抗体用量大(为ELISA)的数倍，对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力)。

免疫浊度法可分为散射比浊(INA)与透射比浊(ITA)。散射比浊(INA)法由于其光波接收方式的特点，通常测试结果的灵敏度与测速要优于透射比浊，但需要专门仪器的散射比浊仪或特种蛋白仪，与专用配套试剂，测定成本较高，不易于在基层医院中推广使用。透射比浊(ITA)法，操作简便适用性强，普通自动生化分析仪和分光光度计均可使用，更易于被常规分析所采用，几乎所有的各实验室、基层医院均能开展，不足的是灵敏度和精密度、抗干扰力均不够理想。

因此，需要在现有的脂蛋白(a)胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备基础上进行改良，以提高脂蛋白(a)胶乳免疫比浊法试剂的抗干扰能力、分析灵敏度及精密度，以适应现代化临床检验医学的发展。

发明内容

因此，针对现有技术的不足，本发明提供一种脂蛋白(a)测定试剂盒，在现有的胶乳免疫比浊法的基础上，通过放大抗体抗原反应以及添加抗干扰剂，增加了免疫复合物的直径，提高了检测敏感性和测定试剂的分析灵敏度及精密度，同时试剂的稳定性、抗干扰能力强，可实现对脂蛋白(a)的准确检测，且未提高试剂研发成本，更易适应现代化临床检验医学的发展。

本发明通过以下技术方案实现：

一种脂蛋白(a)测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1由以下质量浓度的组分组成：

所述试剂2由以下质量浓度的组分组成：

其中所述试剂1与试剂2的体积比为4：1。

优选地，所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、DIPSO缓冲液中的一种。

所述试表面活性剂均为是吐温80、PEG6000、PEG12000、Brij35中的任意一种或多种。

所述试剂中的稳定剂选自蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶中的任意一种或多种。

所述试剂盒中的防腐剂均为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的任意一种或多种。

所述试剂R1中的无机盐选自KCL、CaCl₂、NaCl、BaCl₂、MgCl₂、AlCl₃中的任意一种或多种。

所述试剂R1中的抗干扰剂选抗坏血酸、十二烷基二甲基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、曲拉通X-100中的任意一种或两种的混合物。

优选地，所述试剂中的抗干扰剂由十二烷基二甲基甜菜碱与曲拉通X-100按质量比为3：1复配得到。

优选地，试剂R2中的封闭剂选自为小牛血清白蛋白(BSA)、明胶、酪蛋白、吐温-20中的一种或两种以上的混合物。

优选地，试剂R2中的脂蛋白(a)单抗乳胶颗粒上的所述抗体选自为羊抗人脂蛋白(a)抗体、兔抗人脂蛋白(a)抗体、鼠抗人脂蛋白(a)抗体中的一种。

优选地，所述R2试剂中的脂蛋白(a)单抗乳胶颗粒的粒径为150nm。

本发明还提供一种使用本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

在血清样品中加入如权利要求1所述的试剂1，混匀，孵育3～5min后，加入如权利要求1所述的试剂2，混匀孵育20s后，于600nm波长下检测样品吸光度值A1，5min后，于600nm波长下检测样品吸光度值A2，通过比对脂蛋白(a)标准曲线相对应的浓度，即可获得样品中脂蛋白(a)的含量。

优选地，所述加入试剂1与试剂2的体积比为：4:1。

优选地，所述脂蛋白(a)的含量计算方法为：分别计算校准品的吸光度变化值△A，并绘制校准曲线，校准曲线使用多点非线性拟合；将样本测定的吸光度变化值△A按拟合的公式进行计算，其中△A＝A2-A1，即可得出样本中脂蛋白(a)的浓度。

本发明的有益效果为：本发明试剂盒基于胶乳免疫透射比浊法(PETIA)，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。根据吸光度增加量，即可在波长600nm处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的脂蛋白(a)含量。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。

本发明试剂盒通过在试剂1中添加十二烷基二甲基甜菜碱与曲拉通X-100的混合物，提高了脂蛋白(a)胶乳免疫比浊法试剂的抗干扰能力、分析灵敏度及精密度，且未提高试剂研发成本，更易适应现代化临床检验医学的发展。

本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中脂蛋白(a)的含量，无需复溶配制，开瓶即可直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率。且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1脂蛋白(a)检测试剂盒的制备

试剂1(R1)为：

抗干扰剂：

十二烷基二甲基甜菜碱 15g/L

曲拉通X-100 5g/L

试剂2(R2)为：

人脂蛋白(a)单抗胶乳微球的制备方法如下：

(1)取1mL羧基化的胶乳微球(150nm，10％固含量)用甘氨酸缓冲液稀释至5ml。

(2)加入1.5ml 25g/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.5ml 9.0g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌均匀后37℃孵育20min。

(3)加入3mL磷酸盐缓冲液，室温搅拌均匀。

(4)加入2g羊抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，37℃孵育4小时。

(5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3小时后，4℃保存备用，终止液为含20％BSA的磷酸盐缓冲液。

试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即按照上述配方比例，分别将试剂R1和试剂R2所述的各组分加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

实施例2脂蛋白(a)检测试剂盒的制备

试剂1(R1)为：

试剂2(R2)为：

实施例3脂蛋白(a)检测试剂盒的制备

试剂1(R1)为：

抗干扰剂：

曲拉通X-100 25g/L

月桂酰胺丙基甜菜碱 15g/L

试剂2(R2)为：

对比例1

对比例1与实施例1的唯一区别是，不添加抗干扰剂：十二烷基二甲基甜菜碱和曲拉通X-100。

实施例3检验本发明脂蛋白(a)试剂盒的准确度

采用的测定方法为两点终点法，温度为37℃，反应方向向上，样本：试剂1：试剂2为2:240:60(R1与试剂R2的体积比为4：1)，测定主/副波长为600/none，取240μl试剂1加入2μl样本或校准后37℃稳定孵育250秒，然后加入60μl试剂2继续孵育20秒，记录吸光度值A1，再继续反应300秒后记录吸光度值A2。ΔA＝A2-A1

检测样本：40例脂蛋白(a)浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本(靶值为605mg/L)

对照试剂盒：东软威特曼(南京)生物科技有限公司生产的脂蛋白(a)检测试剂盒，采用胶乳免疫比浊法检测，该试剂盒也包括试剂R1和R2，以下简称为对照试剂。

分别使用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1及对照试剂(胶乳免疫比浊法)同时对上述检测样本进行测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10％以内视为无干扰，偏差范围超过±10％视为干扰。结果如表1、2所示：

表2脂蛋白(a)血清样本(靶值为605mg/L)检测结果(单位：mg/L)

结果显示，根据对比例1、实施例1、实施例2、实施例3对照试剂检测结果计算出的相对偏差分别为7.59％、-0.02％、1.19％、0.96％、-0.17％，表明本发明所述方法检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，与未添加抗干扰剂的对比例1相比，添加抗干扰剂的实施例1、实施例2、实施例3具有较高准确度(符合度)，且实施例1为最优的选择，说明添加了抗干扰剂的检测试剂能排除干扰因素。

实施例4检验本发明试剂的灵敏度检测

试验仪器：日立7170全自动生化分析仪

检测样本：1份纯化水、1份浓度为180mg/L的脂蛋白(a)低值样本

用实施例1、实施例2、实施例3的试剂和对照试剂用各自最适用的检测方法同时定标，同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和180mg/L样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。检测结果见表3：

表3实施例1试剂与对照试剂灵敏度分析结果(单位：mg/L)

结果显示，本发明实施例1的灵敏度为3.19mg/L，对照试剂的灵敏度为5.19mg/L，说明表明本发明的检测试剂具有较高的灵敏度，相对于现有技术中的对照试剂，本发明的检测试剂的灵敏度提高了3.19％，灵敏计算公式如下：

灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2×SD)×样本浓度/样本吸光度差值平均值。

实施例4检验本发明试剂及方法的精密度分析

试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；

检测样本：1份临床血清样本(低值样本，180mg/L)、1份脂蛋白(a)血清样本(高值样本，400mg/L)；

用实施例1的试剂对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。

表4实施例1精密度分析结果(单位：mg/L)

结果显示，本发明试剂的精密度：低值样品的CV为0.40、高值样品的CV为0.25，均小于等于10％，而对照试剂低值样品的CV为0.90、高值样品的CV为0.59，表明本发明检测试剂具有更高的精密度。

实施例5检验本发明试剂的线性相关性：

试验仪器：日立7170全自动生化分析仪

检测样本：高浓度脂蛋白(a)血清样本(1200mg/L)

将高浓度脂蛋白(a)血清样本(1200mg/L)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度，分别为0mg/L、240mg/L、480mg/L、720mg/L、960mg/L、1200mg/L，采用实施例1的检测试剂对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R值，实施例4的检测结果见表5。

表5实施例1线性分析结果(单位：mg/L)

结果显示，根据实施例1检测结果得到的回归方程为y＝0.9851x-6.3133，相关系数R²＝0.9998，表明本发明试剂在0mg/L～1200mg/L范围内具有良好的线性相关性。

实施例6检验本发明试剂抗干扰性能

把同一份人血清样品中分为多份，分别各加入三个浓度梯度的血红蛋白、胆红素、甘油三酯、维生素C等干扰物质，分别使用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1同时对上述检测样本进行测定，并计算相对偏差值。相对偏差(％)＝(添加干扰物质样本的测定均值-对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％

表6实施例1、实施例2、实施例3、对比例1抗干扰检测结果(单位：mg/L)

实验结果显示，实施例1对于三个浓度梯度的血红蛋白、胆红素、甘油三酯、维生素C等干扰物质的抗干扰性都在±3％内，具有优秀的抗干扰效果。

与未添加抗干扰剂的对比例1相比，添加抗干扰剂的实施例1、实施例2、实施例3均具有较高准确度(符合度)。说明抗干扰剂的添加可以明显提高试剂抗干扰能力，其中添加了十二烷基二甲基甜菜碱与曲拉通X-100作为干扰剂的实施例1抗干扰能力最强。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种脂蛋白(a)测定试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2，所述试剂1由以下质量浓度的组分组成：

所述试剂2由以下质量浓度的组分组成：

其中所述试剂1与试剂2的体积比为4：1；

所述试剂中的抗干扰剂由十二烷基二甲基甜菜碱与曲拉通X-100按3:1的质量比复配得到。