CN110007074A - 用于检测c反应蛋白的试剂盒、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及免疫学检测领域。具体而言，本申请涉及一种用于免疫比浊法检测C反应蛋白的试剂盒，其包含含有电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液的第一试剂组合物，以及含有两种具有不同平均粒径的不溶性载体颗粒群以及保存液的第二试剂组合物。本发明的C反应蛋白检测试剂盒可以用于全血样本C反应蛋白浓度测定，具有灵敏度高、检测上限宽、测试速度快、稳定性好、生产成本低等优点。

Description

用于检测C反应蛋白的试剂盒、其制备方法及用途

技术领域

本申请涉及免疫学检测领域。具体而言，本申请涉及一种全量程C反应蛋白检测试剂盒。

背景技术

人类C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是肝脏在白细胞介素6、肿瘤坏死因子等细胞因子刺激下合成的一种急性期反应蛋白。CRP为五聚体蛋白，由五个相同亚单位非共价联接，相对分子质量为115-140KD。在急性炎症时，血浆CRP浓度可迅速升高达生理浓度的1000倍以上。CRP半寿期约15h，正常人的浓度很低，但在组织损伤、急性感染发生后6-8h开始升高，24-48h达峰值，在炎症反应中变化最为显著。因此，CRP检测成为某些临床疾病早期诊断鉴别及疗效评估的重要指标。

临床常规测定CRP方法为免疫比浊法，测定浓度范围一般为3-200mg/L，存在灵敏度低，无法检测更低浓度水平的CRP，不能作为心脑血管疾病检测。超敏CRP测定试剂灵敏度高，可用于心脑血管疾病的监控，但其测定上限低，不能作为感染性疾病的诊断。此外，用于临床上检测的样本均需先对全血样本进行预先分离，费时费力，难以满足临床快速诊断的需求。为此，以全血为样本的全量程CRP快速检测试剂盒(线性区间不窄于0.5-80mg/L)显得异常迫切及重要。

发明内容

为提升检测灵敏度，目前乳胶比浊试剂主要原材料抗体一般为兔多抗或者鼠单抗，其价格高昂，导致试剂生产成本较高。为此，本申请首次应用廉价易得的羊多抗，通过将不同亲和力的羊多抗与特定粒径范围的不溶性载体颗粒偶联，实现了对CRP的准确检测，在大大降低生产成本的同时，亦能够提高检测灵敏度和检测上限。

此外，现有技术通过使用不同粒径的乳胶微球来提升检测灵敏度，通常对不同粒径的乳胶微球进行单独的抗体包被及封闭，该工艺不仅不涉及多次离心步骤，操作繁琐，且所需离心速度大、离心时间长，因而需要大型高速离心机，而离心速度越大，离心机能离心的体积会急聚变小，严重影响试剂产量。为此，本发明人经过反复摸索，出人意料地发现通过将与抗体孵育后的不同粒径乳胶微球混合在一起离心分离、再共同进行封闭的方法，不仅可将离心次数降至1次，且所需离心速度可降低至8000rmp，使得仪器能离心的体积急剧增加，生产效率大幅提高。

基于上述发现，本发明人开发了新的用于免疫比浊法检测C反应蛋白的试剂盒以及制备抗体包被不溶性载体颗粒的方法。

试剂盒

因此，在第一方面，本发明提供了一种用于免疫比浊法检测C反应蛋白的试剂盒，其包含：

(a)第一试剂组合物，其包含电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；和，

(b)第二试剂组合物，其包含：

两种具有不同平均粒径的不溶性载体颗粒群，其中，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面包被有低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体，平均粒径大的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面包被有高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体；以及，

保存液，其包含稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；

其中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以不低于约1×10^-8M的K_D值结合人CRP，所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以不高于约1×10^-8M的K_D值结合人CRP。

在某些优选的实施方案中，所述K_D值通过表面等离子共振技术(例如Biacore)、生物薄膜干涉技术(BLI)(如ForteBio )或Kinexa测定。

在某些优选的实施方案中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约1×10^-5M-约1×10^-8M的K_D值结合人CRP。在某些优选的实施方案中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约3×10^-7M-约4×10^-7M(例如，约3.7×10^-7M)的K_D值结合人CRP。

在某些优选的实施方案中，所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约1×10^-8M-约1×10^-11M的K_D值结合人CRP。在某些优选的实施方案中，所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约6×10^-9M-约7×10^-9M(例如，约6.3×10^-9M)的K_D值结合人CRP。

在某些优选的实施方案中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体的K_D值与所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体的K_D值之比不低于约10：1，例如不低于约20：1，约30：1，约40：1，约50：1，约60：1，约70：1，约80：1，约90：1，或约100：1。在某些优选的实施方案中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体的K_D值与所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体的K_D值之比为约50：1～约70：1(例如，约55：1～约65：1，例如约60：1)。

在某些优选的实施方案中，所述不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒具有基本均一的粒径。在某些实施方案中，所述不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的粒径的CV值小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，或小于1.8％。

在某些优选的实施方案中，所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群的平均粒径为50-150nm，例如83nm。在某些优选的实施方案中，所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的平均粒径为200-450nm，例如240nm。

在某些优选的实施方案中，所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群与所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的质量比为4：1～8：1。

在本发明中，所述不溶性载体颗粒群所包含的不溶性载体颗粒包括已知可用于免疫比浊法(增强比浊法)的任何载体颗粒，例如胶乳颗粒或聚乳酸颗粒。在某些优选的实施方案中，所述不溶性载体颗粒是胶乳颗粒。胶乳颗粒的材质没有特别限定，其非限制性实例包括聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯等。在某些优选的实施方案中，所述不溶性载体颗粒为聚苯乙烯微球。

在某些优选的实施方案中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体是绵羊抗人CRP多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体是山羊抗人CRP多克隆抗体。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂组合物和第二试剂组合物中所包含的表面活性剂为Triton X-100和十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱。在某些优选的实施方案中，所述Triton X-100与十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的质量比为3:1～8:1。在某些示例性实施方案中，所述Triton X-100与十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的质量比为3：1。

在某些优选的实施方案中，所述电解质选自氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化铵、硫酸钠，及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述电解质的含量为0.05％～2％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述电解质的含量为0.1％(w/v)。

在某些优选的实施方案中，所述促凝剂选自聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、硫酸葡聚糖钠、聚乙二醇20000、聚乙烯吡咯烷酮，及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述促凝剂的含量为1％～3％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述促凝剂的含量为1.5％(w/v)。

在某些优选的实施方案中，所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸盐缓冲液，及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述缓冲液的含量为0.01-0.2mol/L。

在某些优选的实施方案中，所述防腐剂选自ProClin系列、苯酚、叠氮化钠、对羟基苯甲酸，及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述防腐剂的含量为0.5-2g/L。在某些示例性实施方案中，所述防腐剂的含量为1g/L。

在某些优选的实施方案中，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘氨酸，及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述稳定剂的含量为0.05％～2％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述稳定剂的含量为0.5％(w/v)。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂组合物与第二试剂组合物的体积比为0.9：1～1.1：1。在某些示例性实施方案中，所述第一试剂组合物与第二试剂组合物的体积比为1：1。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂组合物由以下成分组成：电解质(例如氯化钠)、促凝剂(例如聚乙二醇)、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠)、缓冲液(例如甘氨酸)以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)，其中所述表面活性剂是Triton X-100和十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱。

在某些示例性实施方案中，所述第一试剂组合物由以下成分组成：氯化钠、聚乙二醇(例如，聚乙二醇10000)、Triton X-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、叠氮化钠、甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)。

在某些示例性实施方案中，所述第一试剂组合物由以下成分组成：0.1％(w/v)氯化钠、1.5％(w/v)聚乙二醇10000、0.5％(w/v)TritonX-100、0.15％(w/v)十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、0.1％(w/v)叠氮化钠、1％(w/v)甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂组合物所包含的保存液由以下成分组成：电解质(例如氯化钠)、稳定剂(例如牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠)、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠)、缓冲液(例如甘氨酸)以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)，其中所述表面活性剂是Triton X-100和十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱。

在某些示例性实施方案中，所述第二试剂组合物所包含的保存液由以下成分组成：氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、TritonX-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、叠氮化钠、甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)。

在某些示例性实施方案中，所述第二试剂组合物所包含的保存液由以下成分组成：1％(w/v)氯化钠、0.5％(w/v)牛血清白蛋白、0.06％(w/v)乙二胺四乙酸二钠、0.03％(w/v)Triton X-100、0.01％(w/v)十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、0.1％(w/v)叠氮化钠、1％(w/v)甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水等)。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置：标准品(例如，含有不同已知量的CRP的系列样品)；阳性对照样品(例如，含有已知量的CRP的样品)；阴性对照样品(例如，不含有CRP的样品)；抗凝剂(例如肝素)；和，采血装置(例如，无热原真空采血管)。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒所包含的如上所述的各组分分开提供。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂组合物所包含的不溶性载体颗粒群与保存液作为同一组分提供。在某些优选的实施方案中，所述不溶性载体颗粒群与所述保存液以混悬形式组合提供。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂组合物与第二试剂组合物分开提供。

检测方法

在第二方面，本发明提供了一种测定样品中CRP的存在或其量的免疫比浊法，其包括以下步骤：

(1)在抗原-抗体复合物形成所允许的条件下，将第二试剂组合物与所述样品接触，其中所述第二试剂组合物如第一方面所定义；

(2)测定步骤(1)的反应体系的浊度变化；

(3)将步骤(2)所获得的浊度变化与表示CRP的已知量与所述浊度变化的关系的标准曲线比较，并获得CRP的含量。

在某些优选的实施方案中，本发明的方法用于非诊断目的。

在某些优选的实施方案中，所述样品是血浆或血清。

在某些优选的实施方案中，所述样品是全血(例如抗凝全血)。在此类实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括将如第一方面所定义的第一试剂组合物与所述样品接触，以溶解红细胞。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)的反应体系中，所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群的含量为0.1％～1％(W/V)(例如，0.2％～0.8％(W/V)，或0.3％～0.8％(W/V)，如0.36％～0.72％(W/V))，所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的含量为0.05％～0.5％(W/V)(例如0.05％～0.2％(W/V)，如0.09％～0.18％(W/V))。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，所述不溶性载体颗粒的表面所包被的抗体能够与CRP发生免疫反应，进而使所述不溶性载体颗粒在反应体系中凝集以发生凝集反应。

在本发明中，测定步骤(1)的反应体系的浊度变化的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以通过光学方法测定步骤(1)的反应开始后一定时间内(例如，0-5分钟，0-2分钟，5-120秒，或5-60秒)在规定波长处的吸光度或散射光的变化量，以其作为浊度变化。

因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后：(a)以适当时间间隔对反应体系在规定波长处的吸光度进行2次测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)；或者，(b)对反应体系在规定波长处的吸光度进行连续测定，以单位时间的吸光度变化率作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后0-120秒内(例如5-120秒，例如5-60秒)对反应体系在规定波长处的吸光度进行2次测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后第10秒和第60秒分别对反应体系在规定波长处的吸光度进行2次测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)。

在某些优选的实施方案中，所述规定波长为800-900nm，例如840-860nm，例如850nm。在某些实例性实施方案中，所述规定波长为850nm。

在某些实例性实施方案中，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后第10秒和第60秒分别对反应体系在850nm处的吸光度进行2次测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用采血装置从受试者获得全血样品；(b)使用抗凝剂(例如肝素)处理采血装置或所述全血样品。

制备方法

在第三方面，本发明提供了一种制备不溶性载体颗粒群的方法，其包括以下步骤：

(1)提供两种具有不同平均粒径的不溶性载体颗粒群；

(2)将平均粒径小的不溶性载体颗粒群与第一抗体孵育，以将所述第一抗体连接于所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面；

(3)将平均粒径大的不溶性载体颗粒群与第二抗体孵育，以将所述第二抗体连接于所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面；

(4)将步骤(3)的产物与步骤(2)的产物混合；

(5)将步骤(4)的产物与封闭剂一起孵育；

其中，步骤(2)和(3)可以以任意顺序进行。

在某些优选的实施方案中，所述不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒具有基本均一的粒径。在某些实施方案中，所述不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的粒径的CV值小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，或小于1.8％。

在某些优选的实施方案中，在步骤(4)之后还包括离心分离。在某些优选的实施方案中，所述离心分离的条件为8000r/min、35min、4℃。在某些优选的实施方案中，在步骤(4)和之后包括一次离心分离。

在某些优选的实施方案中，在步骤(5)之后还包括将步骤(5)的产物加入保存液的步骤。在某些优选的实施方案中，所述保存液如第一方面任一项中所定义。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述第一抗体是如第一方面中所定义的低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，通过共价偶联或物理吸附将所述第一抗体连接于不溶性载体颗粒的表面。因此，在一些优选的实施方案中，步骤(2)中所述的不溶性载体颗粒的表面带有官能团(例如羧基、氨基、羟基、酰肼或巯基)修饰。在另一些优选的实施方案中，步骤(2)中所述的不溶性载体颗粒是物理吸附微球。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，通过氨基和羧基之间的偶联反应将所述第一抗体连接于不溶性载体颗粒的表面。在此类实施方案中，步骤(2)中所述的不溶性载体颗粒的表面带有羧基修饰。因此，在某些实例性实施方案中，在步骤(2)中，在EDC或其盐(例如EDCI)存在的条件下，将所述第一抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些实例性实施方案中，在步骤(2)中，在EDC或其盐(例如EDCI)和NHS存在的条件下，将所述第一抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些实例性实施方案中，在步骤(2)中，在含有EDC或其盐(例如EDCI)的缓冲液中，将所述第一抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些优选的实施方案中，所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液，及其任意组合。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，所述第二抗体是如第一方面中所定义的高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过共价偶联或物理吸附将所述第二抗体连接于不溶性载体颗粒的表面。因此，在一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的不溶性载体颗粒的表面带有官能团(例如羧基、氨基、羟基、酰肼或巯基)修饰。在另一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的不溶性载体颗粒是物理吸附微球。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过氨基和羧基之间的偶联反应将所述第二抗体连接于不溶性载体颗粒的表面。在此类实施方案中，步骤(3)中所述的不溶性载体颗粒的表面带有羧基修饰。因此，在某些实例性实施方案中，在步骤(3)中，在EDC或其盐(例如EDCI)存在的条件下，将所述第二抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些实例性实施方案中，在步骤(3)中，在EDC或其盐(例如EDCI)和NHS存在的条件下，将所述第二抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些实例性实施方案中，在步骤(3)中，在含有EDC或其盐(例如EDCI)的缓冲液中，将所述第二抗体与不溶性载体颗粒接触。在某些优选的实施方案中，所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液，及其任意组合。

在某些优选的实施方案中，在步骤(5)中，所述封闭剂是牛血清白蛋白。在某些优选的实施方案中，所述封闭剂的含量为5％～20％(w/v)。

在某些优选的实施方案中，在步骤(4)中，将步骤(3)的产物与步骤(2)的产物混合并孵育。在某些示例性实施方案中，在步骤(4)中，将步骤(3)的产物与步骤(2)的产物混合并孵育0.5h。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(3)之后，不包括洗涤步骤。

医药用途

在第四方面，本发明还涉及如第一方面所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断感染性疾病和/或心血管疾病的试剂中的用途。

在某些优选的实施方案中，所述感染性疾病是细菌感染、炎症或组织损伤。在某些优选的实施方案中，所述心血管疾病选自冠心病、急性心肌梗死、心衰或房颤。

缩写及术语定义

在本文中使用以下缩写：

EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)

EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)

NHS N-羟基琥珀酰亚胺

MES 2-(N-吗啉)乙磺酸

MOPSO 3-(N-吗啉基)2-羟基丙磺酸

Tris 三羟甲基氨基甲烷

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“免疫比浊法”是指，根据由抗原-抗体反应所导致的反应体系的浊度(例如，吸光度或散射光等光学性质)的变化，从而检测或定量被检样品中的抗原或抗体的方法，属于免疫学检测方法中的一种。通常而言，为了提高检测的灵敏度，将能够特异性结合被检样品中的目标抗原或目标抗体的抗体或抗原固定在不溶性载体颗粒(例如，胶乳颗粒)上，以形成致敏颗粒；由于抗原-抗体反应该致敏颗粒凝集，根据由此引起的光学性质变化对被检物质进行检测或定量，该方法也称为颗粒增强免疫比浊法(Particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)；特别地，在使用胶乳颗粒作为不溶性固体颗粒时，该方法也称为胶乳增强免疫比浊法(Latex-enhanced turbidimetricimmunoassay,LIA)。在本发明中，表述“免疫比浊法”意指，使用不溶性载体颗粒的免疫比浊法。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用K_D值描述。K_D值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。K_D值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。K_D值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“封闭剂”是指，能够减少非特异性相互作用如非特异性抗体结合的任何物质。这类物质是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于明胶，牛血清白蛋白，卵清蛋白，酪蛋白，和脱脂牛奶等。

如本文中所使用的，术语“促凝剂”是指，能够加速抗原-抗体复合物形成的物质。这类物质是本领域技术人员公知的，其实例包括但不限于水溶性高分子，例如聚乙二醇、聚乙烯醇、右旋糖酐、硫酸软骨素钠等。

如本文中所使用的，术语“助悬剂”是指，能够增加分散介质的黏度，以降低微粒的沉降速度的物质。在本发明中，所述助悬剂优选为低分子助悬剂，例如丙三醇、乙二醇、甘露醇等。

如本文中所使用的，术语“稳定剂”是指，能够控制或抑制不溶性载体颗粒(例如，胶乳颗粒)自凝的物质，这类物质是本领域技术人员公知的，其实例包括但不限于氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶等。

如本文中所使用的，术语“缓冲液”是指，能够通过其酸碱配对组分的作用防止pH显著变化的溶液。这类物质是本领域技术人员公知的，可参见例如Buffers.A Guide forthe Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,ed.Calbiochem Corporation(1975)。缓冲液的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、铵盐等。

如本文中所使用的，术语“抗凝剂”是指，能够阻止血液凝固的物质。这类物质是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于肝素、EDTA、草酸盐(例如，草酸钠、草酸钾或草酸铵)、枸橘酸钠等。

如本文中所使用的，术语“阳性对照样品”是指，含有已知量的C反应蛋白的样品。在某些实施方式中，待测样品中C反应蛋白的量可以通过将待测样品的检测结果与所述阳性对照样品的检测结果进行比较来计算，这类方法是本领域熟知的，例如通过检测不同浓度的阳性对照样品而构建标准曲线来进行。

在本文中，术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成可接受的误差范围内的值或组成，这将部分地取决于值或组成如何测量或确定，即测量系统的限制。例如，当“约”用于描述可测量的值(例如，物质的浓度、质量比等)时，意味着包含给定值的±5％、或±1％的范围。在某些示例性实施方案中，术语“约”是指给定值的正负5％。

发明的有益效果

现有技术中的CRP全量程检测试剂盒几乎都需要应用兔多抗或者鼠单克隆抗体以提升试剂灵敏度。然而，兔多抗与单克隆抗体的价格昂贵，极大提高了检测试剂盒的生产成本，阻碍其广泛应用。相比之下，根据本发明的CRP检测试剂盒应用廉价易得的羊多抗，通过将不同亲和力的羊多抗与特定粒径范围的不溶性载体颗粒偶联，实现了对CRP的准确检测，在大大降低生产成本的同时，亦能够提高检测灵敏度和检测上限。

此外，由于溶血剂可能造成CRP抗体偶联的乳胶微球试剂(R2)中胶乳微球表面水化层改变，导致乳胶微球絮集沉淀，一般溶血剂不加入R2试剂中。本发明人经过大量的实验研究，出人意料地发现在R2试剂中加入特定表面活性剂的组合，能够提高检测范围及试剂的长期稳定性。

现有技术在制备包含不同粒径的乳胶微球的乳胶试剂时通常对不同粒径的乳胶微球进行单独的抗体包被及封闭，该工艺不仅不涉及多次离心步骤，操作繁琐，且所需离心速度大(小粒径微球单独离心约25000rmp，大粒径微球单独离心约10000rmp)、离心时间长(约1h)；因此该工艺需要大型高速离心机，而离心速度越大，离心机能离心的体积会急剧减小，严重影响试剂产量。本发明人经过反复摸索，出人意料地发现通过将与抗体孵育后的不同粒径乳胶微球混合在一起离心分离、再共同进行封闭的方法，不仅可将离心次数降至1次，且所需离心速度可降低至8000rmp，离心时间缩短至约40min，使得仪器能离心的体积急剧增加，生产效率大幅提高。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1：R2试剂与对比试剂的CRP校准曲线。

图2：表面活性剂对CRP校准曲线的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

制备例1：全量程C反应蛋白检测试剂盒的制备

1、双粒径乳胶试剂的制备：

取2mL平均直径83nm羧基化的聚丙乙烯乳胶(JSR Life Sciences公司)于烧杯，加入3mL 0.1M pH6.0MES缓冲液，然后加入碳二亚胺盐酸盐(阿拉丁试剂有限公司)20mg/mL0.5mL，37℃搅拌20min，加入0.3mL 54mg/mL绵羊抗人C反应蛋白抗体(罗氏诊断，货号11888714103，其K_D值为3.7×10^-7M)，在37℃搅拌1.5h，得A液。取0.25mL平均直径为240nm的羧基化的聚苯乙烯乳胶颗粒(JSR LifeSciences)，加入3mL 0.1M pH6.0MES缓冲液，然后加入碳二亚胺盐酸盐20mg/mL 150uL,37℃搅拌20min，加入0.1mL 50mg/mL山羊抗人C反应蛋白抗体(桂林英美特生物技术有限公司，货号161121，其K_D值为6.3×10^-9M)反应1.5h，得B液。将B液加入A液中，继续反应0.5h后，8000r/min、4℃离心分离35min，去上清，加入5mL15％牛血清白蛋白溶液超声重悬，37℃搅拌2h，再加入适量R2试剂保存液超声得R2试剂。

2、R1试剂及R2试剂保存液的制备：

R1试剂：称取NaCl 1g、PEG10000 15g、Triton X-100 5g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱(上海诺颂实业有限公司)1.5g、叠氮化钠1g、甘氨酸10g，加纯化水定容1L。

R2试剂保存液：称取NaCl 10g、牛血清白蛋白5g、乙二胺四乙酸二钠0.6g、TritonX-100 0.3g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱0.1g、叠氮化钠1g、甘氨酸10g，加纯化水定容1L。

实施例1：全量程C反应蛋白检测试剂盒的检测方法

在反应杯上分别加入200uL R1试剂与8uL不同浓度CRP校准品(0mg/L、5mg/L、25mg/L、70mg/L、150mg/L、200mg/L)，混匀，37℃孵育，再加入200uL R2试剂，混匀，分别于第10秒、60秒时使用分析仪(桂林优利特医疗电子有限公司，BH-5360CRP)测定反应体系在850nm波长下的吸光度，计算两者差值。将CRP浓度为横坐标，对应吸光度差值(即，反应度)作为纵坐标，制作CRP校准曲线。

同法测定待测样品(例如血样)，通过校准曲线计算出样本中C反应蛋白的含量。

实施例2：R2试剂对检测灵敏度和线性范围的影响

参照制备例1所述的方法，将低亲和力的绵羊抗人C反应蛋白抗体偶联平均直径为240nm的乳胶颗粒，将高亲和力的山羊抗人C反应蛋白抗体偶联平均直径83nm羧基化的聚丙乙烯乳胶，其余条件相同，以获得R2试剂的对比试剂。

随后考察R2试剂及对比试剂对检测灵敏度及线性范围的影响。根据实施例1所述的方法分别绘制使用R2试剂及对比试剂的CRP校准曲线，结果如图1及表1所示。结果显示，使用R2试剂的检测试剂盒在低浓度CRP(5mg/L)下反应度明显高于使用对比试剂的检测试剂盒，表明R2试剂相比于对比试剂能够明显提高灵敏度；与此同时，使用R2试剂的检测试剂盒的线性范围也明显宽于对比试剂。以上结果表明，将低亲和力的绵羊抗人C反应蛋白抗体偶联粒径小的乳胶微球，高亲和力的山羊抗人C反应蛋白抗体偶联粒径大的乳胶微球，有利于提高试剂的线性范围及灵敏度。

表1：R2试剂对检测灵敏度和线性范围的影响

	5mg/L的反应度	线性范围(mg/L)	相关系数(R<sup>2</sup>)
				R2试剂	255	0.05-350	0.998
对比试剂	105	2.5-280	0.998

实施例3：表面活性剂对检测试剂盒性能的影响

在本实施例中，比较R2试剂(R2试剂保存液)中添加不同表面活性剂对检测试剂盒的影响。按照制备例1的方法制备R2试剂，在R2试剂保存液中按照以下方案加入不同的表面活性剂：方案一：0.03％的Triton X-100及0.01％的十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱；方案二：不含表面活性剂；方案三：0.03％十四烷基三甲基氯化氨及0.01％的甜菜碱。检测试剂盒中的其他组分与制备例1相同。根据实施例1所述的方法分别使用上述三种R2试剂的试剂盒检测不同浓度的CRP标准品，以绘制校准曲线，对其灵敏度、线性范围、准确度等指标进行测试。结果如表2及图2所示，低浓度CRP下反应度越高，试剂灵敏度越高，当以方案一为R2试剂时试剂盒的灵敏度、线性范围均显著优于以方案二或方案三作为R2试剂的试剂盒。这一结果表明，R2试剂保存液中加入方案一的表面活性剂可显著提高试剂灵敏度、线性范围。

表2：表面活性剂对试剂盒灵敏度及线性范围影响

	方案1	方案2	方案3
				线性范围	0.05-350mg/L	1-320mg/L	0.1-320mg/L
5mg/L CRP的反应度	252	163	195

进一步，将上述三种R2试剂放于37℃条件下储存指定时间，而后分别检测试剂空白吸光度、试剂外观和CRP国际标准物质测值相对偏差。试剂空白吸光度使用分光光度计测定(岛津紫外分光光度计，型号UV-2600)。CRP国际标准物质测值相对偏差检测方法如下：使用不同R2试剂的试剂盒测试C-反应蛋白标准物质(ERM-DA474/IFCC)3次，测试结果平均值记为(M)，并通过下式计算相对偏差：B＝(M－T)/T×100％，式中：B为相对偏差，M为测试平均值，T为标准物质标示值。

结果如表3所示，R2试剂保存液中加入方案一的表面活性剂有利于其长期稳定性。

表3：表面活性剂对试剂盒长期稳定性影响

实施例4：C反应蛋白检测试剂盒相关性能评估

1、灵敏度检测

取新鲜的健康人全血(不含CRP)，根据实施例1所述的方法、使用制备例1的试剂盒对其重复检测10次，计算灵敏度，灵敏度＝平均值+2.6标准偏差。结果如下表所示，该试剂盒的灵敏度为0.03mg/L。

表4：灵敏度检测结果

2、线性范围

将高值全血样本(血清CRP浓度350mg/L)和低值全血样本(血清CRP浓度0.05mg/L)按照1:0、0.8:0.2、0.6:0.4、0.4:0.6、0.2:0.8、0:1的比例混合成六个浓度，根据实施例1所述的方法、使用制备例1的试剂盒对每个浓度样本重复测定3次。将理论浓度以测定值进行相关性分析。结果如下表所示，理论浓度与测定值偏差满足要求，相关性为R²＝0.998，检测范围为0.05-350mg/L。

表5：线性范围检测结果

理论浓度(mg/L)	测定均值(mg/L)	偏差(mg/L)
			0.05	0.14	0.09
70.04	64.55	-5.49
			140.03	136.43	-4.43
210.02	205.07	-4.95
			280.01	293.21	13.2
350	356.40	6.40

3、干扰实验

在一份浓度为40mg/L的CRP校准品中分别加入不同含量的干扰物后，再使用制备例1的试剂盒、实施例1所述的方法对该样本进行检测，得到测定值。以测定浓度与理论浓度相对偏差小于±10％为界限，判断添加物对CRP检测试剂的干扰性。结果如下表所示，相对偏差均小于10％，高浓度的干扰物对该反应体系基本无影响，表明制备例1的试剂盒具有较好的抗干扰性。

表6：试剂盒干扰试验测定结果

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (12)

1.一种用于免疫比浊法检测C反应蛋白的试剂盒，其包含：

(a)第一试剂组合物，其包含电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；和，

(b)第二试剂组合物，其包含：

两种具有不同平均粒径的不溶性载体颗粒群，其中，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面包被有低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体，平均粒径大的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面包被有高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体；以及，

保存液，其包含稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；

其中，所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以不低于约1×10^-8M的K_D值结合人CRP，所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以不高于约1×10^-8M的K_D值结合人CRP。

2.权利要求1所述的试剂盒，其具备以下特征中的一项或多项：

(1)所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群的平均粒径为50-150nm；

(2)所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的平均粒径为200-450nm；

(3)所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群与所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的质量比为4：1～8：1；

(4)所述不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒为聚苯乙烯微球；

(5)所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约1×10^-5M-约1×10^-8M的K_D值结合人CRP；

(6)所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体以约1×10^-8M-约1×10^-11M的K_D值结合人CRP；

(7)所述低亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体是绵羊抗人CRP多克隆抗体；

(8)所述高亲和力的羊抗人CRP多克隆抗体是山羊抗人CRP多克隆抗体。

3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第一试剂组合物和第二试剂组合物中所包含的表面活性剂为Triton X-100和十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱；

优选地，所述Triton X-100与十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的质量比为3:1～8:1；

优选地，所述Triton X-100与十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的质量比为3：1。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其具备以下特征中的一项或多项：

(1)所述电解质选自氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化铵、硫酸钠，及其任意组合；

(2)所述促凝剂选自聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、硫酸葡聚糖钠、聚乙二醇20000、聚乙烯吡咯烷酮，及其任意组合；

(3)所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸盐缓冲液，及其任意组合；

(4)所述防腐剂选自ProClin系列、苯酚、叠氮化钠、对羟基苯甲酸，及其任意组合；

(5)所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘氨酸，及其任意组合。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中：

所述第一试剂组合物由以下成分组成：氯化钠、聚乙二醇10000、Triton X-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、叠氮化钠、甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水)；和/或，

所述第二试剂组合物所包含的保存液由以下成分组成：氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、Triton X-100、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱、叠氮化钠、甘氨酸以及余量的水(例如，纯化水、去离子水、蒸馏水)。

6.权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置：标准品(例如，含有不同已知量的CRP的系列样品)；阳性对照样品(例如，含有已知量的CRP的样品)；阴性对照样品(例如，不含有CRP的样品)；抗凝剂(例如肝素)；和，采血装置(例如，无热原真空采血管)。

7.一测定样品中CRP的存在或其量的免疫比浊法，其包括以下步骤：

(1)在抗原-抗体复合物形成所允许的条件下，将第二试剂组合物与所述样品接触，其中所述第二试剂组合物如权利要求1-6任一项中所定义；

(2)测定步骤(1)的反应体系的浊度变化；

(3)将步骤(2)所获得的浊度变化与表示CRP的已知量与所述浊度变化的关系的标准曲线比较，并获得CRP的含量；

优选地，所述方法用于非诊断目的。

8.权利要求7所述的方法，其中，所述样品是血浆或血清。

9.权利要求7所述的方法，其中，所述样品是全血(例如抗凝全血)；

优选地，在步骤(1)之前，所述方法还包括：将权利要求1-6任一项中所定义的第一试剂组合物与所述样品接触，以溶解红细胞。

10.权利要求7-9任一项所述的方法，其中，在步骤(2)中，通过光学方法测定步骤(1)的反应开始后一定时间内(例如，0-5分钟，0-2分钟，5-120秒，或5-60秒)在规定波长处的吸光度或散射光的变化量，以其作为所述步骤(1)的反应体系的浊度变化；

优选地，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后0-120秒内(例如5-120秒，例如5-60秒)对反应体系在规定波长处的吸光度进行2次测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)；

优选地，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后第10秒和第60秒分别对反应体系在规定波长处的吸光度进行测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)；

优选地，所述规定波长为800-900nm，例如840-860nm，例如850nm；优选地，所述规定波长为850nm；

优选地，在步骤(2)中，在步骤(1)的反应开始后第10秒和第60秒分别对反应体系在850nm处的吸光度进行测定，以其差值作为吸光度的变化量(也即，浊度变化)。

11.一种制备抗体包被的不溶性载体颗粒群的方法，其包括以下步骤：

(1)提供两种具有不同平均粒径的不溶性载体颗粒群；

(2)将平均粒径小的不溶性载体颗粒群与第一抗体孵育，以将所述第一抗体连接于所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面；

(3)将平均粒径大的不溶性载体颗粒群与第二抗体孵育，以将所述第二抗体连接于所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群中所包含的不溶性载体颗粒的表面；

(4)将步骤(3)的产物与步骤(2)的产物混合；

(5)将步骤(4)的产物与封闭剂一起孵育；

其中，步骤(2)和(3)可以以任意顺序进行；

优选地，所述不溶性载体颗粒是聚苯乙烯微球；

优选地，所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群的平均粒径为50-150nm；

优选地，所述平均粒径大的不溶性载体颗粒群的平均粒径为200-450nm；

优选地，在步骤(4)之后还包括离心分离；优选地，所述离心分离的条件为8000r/min、35min、4℃；

优选地，在步骤(5)之后还包括将步骤(5)的产物加入保存液的步骤，所述保存液如权利要求1-6任一项中所定义；

优选地，在步骤(2)中，通过共价偶联或物理吸附将所述第一抗体连接于不溶性载体颗粒的表面；

优选地，在步骤(3)中，通过共价偶联或物理吸附将所述第二抗体连接于不溶性载体颗粒的表面；

优选地，在步骤(5)中，所述封闭剂是牛血清白蛋白。

12.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断感染性疾病和/或心血管疾病的试剂中的用途；

优选地，所述感染性疾病是细菌感染、炎症或组织损伤；

优选地，所述心血管疾病选自冠心病、急性心肌梗死、心衰或房颤。