CN111044732A - 用于流式细胞仪法cd45抗原检测的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒及其制备方法，包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液。用DMSO将荧光素溶解，并与荧光蛋白以0.5‑10:0.8‑3的比例，在4‑40℃条件下避光孵育1‑18h，得到串联染料；将通过透析去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以1‑10：20‑100的比例，在4‑40℃条件下避光孵育1‑18h，得到活化的串联染料；将抗体与交联剂B以0.5‑8:4‑100的比例，在4‑40℃条件下避光孵育1‑18h，得到活化的抗体，将活化后的串联染料与抗体以0.3‑4:0.5‑5的比例，在4‑40℃条件下避光孵育1‑18h，得到CD45抗原检测的试剂盒。通过荧光标记抗体识别CD45+细胞对全血进行设门，便于后续用于细胞分群的其他CD系列试剂的使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒及其制备方法。
背景技术
人类白细胞分化抗原(cluster of differentiation，简称CD分子)是位于细胞表面的糖蛋白或糖脂分子，通过与组织基质、细胞因子及其它细胞的相互作用发挥机体正常的免疫功能。通过检测细胞表面CD分子的表达，可以研究免疫细胞的发育、某些免疫相关性疾病的发病机理和免疫病理状态，以及探讨采用免疫治疗的可能性。白细胞共同抗原CD45是由一类结构相似、分子量跨度大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义。在临床实践中，通常根据不同的检验需求选择单色CD系列试剂搭配使用，或直接选择多色试剂盒针对特定的项目或疾病进行诊断分析。在用流式细胞仪进行检测时，第一步通常需要设门，目前较为先进以及普遍使用的是CD45/SSC设门方法。利用CD45与SSC双参数图形，可以清晰的区分正常淋巴细胞、单核细胞、粒细胞以及异常幼稚细胞群，使分型的准确性大大提高。随着FCM的发展，流式检测已经开始采用6色～10色的免疫分型方法，在一些疾病的免疫分型和诊断过程中，利用CD45荧光标记试剂进行设门仍然是较好的分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒及其制备方法，通过荧光标记抗体识别CD45+细胞进行设门，便于后续用于细胞分群的其他CD系列试剂的使用。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，包括：
将荧光素与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料；
将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料；
将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体；
将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒。
其中，所述将荧光素与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料，包括：
用二甲基亚砜将荧光素溶解，并与荧光蛋白以摩尔比1:3的比例，在30℃条件下进行避光孵育3.5h，得到含有串联染料的混合溶液，其中，所述荧光素为Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7菁染料中的任意一种或多种组合，所述荧光蛋白为多甲藻黄素-叶绿素蛋白复合物PerCP、别藻蓝素APC和藻红蛋白PE任意一种或多种组合。
其中，将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料，包括：
通过透析去除含有串联染料的所述混合溶液中的未反应的所述荧光素，将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1：50的比例，在室温条件下避光孵育3h，得到活化的串联染料，其中，所述交联剂A包括(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯SMCC、磺基化SMCC、聚乙二醇化SMCC和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP任意一种或多种组合。
其中，所述将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体，包括：
将抗体与交联剂B以摩尔比1:40的比例，在室温条件下避光孵育1h，并通过分子筛纯化方法除去未反应的交联剂小分子，得到活化的抗体，其中，所述抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4任意一种或多种组合，所述交联剂B包括二硫苏糖醇DTT、三(2-羧乙基)膦TECP、2-甲基-6-乙基苯胺2-MEA、2-亚氨基硫烷盐酸盐Traut’s试剂和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯SATA任意一种或多种组合。
其中，将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒，包括：
将活化后的串联染料与抗体在室温条件下避光孵育1.5h，通过分子筛或亲和层析进行纯化，得到CD45抗原检测的试剂盒。
第二方面，本发明提供一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，其中，所述防腐剂为NaN3、DMDMH、Proclin系列、咪唑和吡啶硫酮钠任意一种或多种组合，所述稳定剂为蔗糖、明胶、甘油、牛血清白蛋白BSA、NaCl和EDTA任意一种或多种组合，所述缓冲液为HEPES、MES、MOPS和磷酸盐缓冲液任意一种或多种组合。
本发明的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒及其制备方法，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，将DMSO将荧光素溶解为设定浓度的溶液，并与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料，将通过透析去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料，将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体，将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒，通过荧光标记抗体识别CD45+细胞进行设门，便于后续用于细胞分群的其他CD系列试剂的使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明第一实施例提供的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法的步骤示意图。
图2是本发明第二实施例提供的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法的步骤示意图。
图3是本发明第一实施例提供的Cy5.5标记PerCP及对照Cy5.5和PerCP的吸收光谱图。
图4是本发明第一实施例提供的PerCP-Cy5.5标记CD45单克隆抗体产物的流式检测图。
图5是本发明第二实施例提供的Cy7标记APC(别藻蓝素)及对照Cy7和APC的吸收光谱图。
图6是本发明第二实施例提供的APC-Cy7标记CD45单克隆抗体产物的流式检测图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1，本发明第一实施例提供一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，包括：
S101、将Cy5.5与PerCP荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料。
具体的，用二甲基亚砜(DMSO)将Cy5.5溶解为设定浓度的溶液，并与PerCP荧光蛋白以摩尔比1:3的比例，在30℃条件下进行避光孵育3.5h，得到含有串联染料的混合溶液，在紫外-可见分光光度计上，通过吸收光谱判断交联是否成功以及计算荧光素与荧光蛋白之间的交联比。如图3所示，扫描波长区间230-700nm，对照Cy5.5在674nm波长处有最大吸收峰(虚线b)，PerCP在439、480、675nm波长处均有吸收(439、480nm处的峰强，675nm处的吸收峰较弱，虚线a)。交联后的PerCP-Cy5.5串联染料在439和480nm处的峰吸光度与对照PerCP的无差别—因Cy5.5在该波峰位置无特征吸收；而串联染料在675nm波长处的吸光度明显高于对照PerCP，且吸收峰位置基本一致(实线c)。通过吸收光谱检测，可以判定Cy5.5与PerCP蛋白交联成功，同时交联反应没有影响PerCP蛋白的活性。通过280、480和675nm处的吸光度计算出Cy5.5与PerCP的交联比(F/P值)为0.806。
S102、将去除了未反应Cy5.5后的所述串联染料与磺基化SMCC以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料。
具体的，通过透析去除所述混合溶液中的未反应的所述Cy5.5，将去除了未反应Cy5.5后的所述串联染料与磺基化SMCC以摩尔比1：50的比例，在室温条件下避光孵育1.5h，得到活化的串联染料PerCP-Cy5.5。
S103、将CD45单克隆抗体与交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体。
具体的，将CD45单克隆抗体与交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐以摩尔比1:40的比例，在室温条件下避光孵育1h，并通过分子筛纯化方法除去未反应的交联剂小分子，得到活化的抗体，
S104、将活化后的串联染料与CD45单克隆抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒。
具体的，将活化后的串联染料与CD45单克隆抗体在室温条件下避光孵育1.5h，通过分子筛或亲和层析进行纯化，得到串联染料PerCP-Cy5.5标记的CD45荧光抗体试剂(CD45-PerCP-Cy5.5)。
PerCP-Cy5.5标记CD45单克隆抗体的流式检测步骤为：经制备得到的所述CD45-PerCP-Cy5.5荧光抗体，通过抗体滴定得到最佳的抗体反应浓度与反应上样量。根据滴定实验，取一定体积CD45试剂加入至流式管底部，吸取100uL混匀的EDTA-K2抗凝全血，加入管底。通过涡旋轻缓混匀后，在室温避光条件下孵育15-25min。在流式管内加入900uL流式细胞仪用溶血剂，混匀后，室温避光孵育15min后，在流式细胞仪上进行检测。从SSC/CD45散点图结果的来看，检测到的细胞群能很好的区分开来，能清晰的观察到粒细胞、单核细胞和淋巴细胞分群，见附图4。
请参阅图2，本发明第二实施例提供一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，包括：
S201、将Cy7与APC荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料。
具体的，用二甲基亚砜将Cy7溶解为设定浓度的溶液，并与APC荧光蛋白以摩尔比1:3的比例，在30℃条件下进行避光孵育3.5h，得到含有串联染料的混合溶液，在紫外-可见分光光度计上，通过吸收光谱判断交联是否成功以及计算荧光素与荧光蛋白之间的交联比。如图5所示，扫描波长区间230-850nm，对照Cy7在746nm波长处有最大吸收峰(虚线b)，APC在651nm波长处有吸收(虚线a)。交联后的APC-Cy7串联染料在652和754nm波长处均有吸收(实线c)，且754nm处的吸收明显强于对照APC，峰位置基本与对照Cy7的一致。因此通过吸收光谱检测，可以判定Cy7与APC蛋白交联成功。
S202、将去除了未反应Cy7后的所述串联染料与磺基化SMCC以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料。
具体的，通过透析去除所述混合溶液中未反应的所述Cy7，将去除了未反应Cy7后的所述串联染料与磺基化SMCC以摩尔比1：50的比例，在室温条件下避光孵育2h，得到活化的串联染料APC-Cy7。
S203、将CD45单克隆抗体与交联剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯SATA以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体。
具体的，将CD45单克隆抗体与交联剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯SATA以摩尔比1:40的比例，在室温条件下避光孵育1h，并通过分子筛纯化方法除去未反应的交联剂小分子，得到活化的抗体。
S204、将活化后的串联染料与CD45单克隆抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒。
具体的，将活化后的串联染料与CD45单克隆抗体在室温条件下避光孵育2h，通过分子筛或亲和层析进行纯化，得到串联染料APC-Cy7标记的CD45荧光抗体试剂(CD45-APC-Cy7)。
APC-Cy7标记CD45单克隆抗体的流式检测步骤为：得到的CD45-APC-Cy7荧光抗体，通过抗体滴定得到最佳的抗体反应浓度与反应上样量。根据滴定实验，取一定体积CD45试剂加入至流式管底部，吸取100uL混匀的EDTA-K2抗凝全血，加入管底。通过涡旋轻缓混匀后，在室温避光条件下孵育15-25min。在流式管内加入900uL流式细胞仪用溶血剂，混匀后，室温避光孵育15min后，在流式细胞仪上进行检测。从SSC/CD45散点图结果的来看，检测到的细胞群能很好的区分开来，能清晰的观察到CD45+淋巴细胞分群，见附图6。
第二方面，本发明提供一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，其中，所述防腐剂为NaN3、DMDMH、Proclin系列、咪唑和吡啶硫酮钠任意一种或多种组合，所述稳定剂为蔗糖、明胶、甘油、牛血清白蛋白BSA、NaCl和EDTA任意一种或多种组合，所述缓冲液为HEPES、MES、MOPS和磷酸盐缓冲液任意一种或多种组合。
在本实施方式中，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，其中，所述防腐剂为NaN3、DMDMH、Proclin系列、咪唑和吡啶硫酮钠任意一种或多种组合，所述稳定剂为蔗糖、明胶、甘油、牛血清白蛋白BSA、NaCl和EDTA任意一种或多种组合，所述缓冲液为HEPES、MES、MOPS和磷酸盐缓冲液任意一种或多种组合，所述CD45单克隆抗体来源可为小鼠、兔、羊的单克隆任意一种，所述CD45抗体亚类为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4任意一种或多种组合，所述荧光素为Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7菁染料中的任意一种或多种组合，所述荧光蛋白为多甲藻黄素-叶绿素蛋白复合物PerCP、别藻蓝素APC和藻红蛋白PE任意一种或多种组合，所述交联剂A为(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯SMCC、磺基化SMCC、聚乙二醇化SMCC和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP任意一种或多种组合，所述交联剂B为二硫苏糖醇DTT、三(2-羧乙基)膦TECP、2-甲基-6-乙基苯胺2-MEA，2-亚氨基硫烷盐酸盐Traut’s试剂和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯SATA任意一种或多种组合。
本发明的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒及其制备方法，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，将DMSO将荧光素溶解为设定浓度的溶液，并与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料，将通过透析去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料，将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体，将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒，通过荧光标记抗体识别CD45+细胞进行设门，便于后续用于细胞分群的其他CD系列试剂的使用。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
将荧光素与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料；
将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料；
将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体；
将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒。
2.如权利要求1所述的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述将荧光素与荧光蛋白以摩尔比0.5-10:0.8-3的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到串联染料，包括：
用二甲基亚砜将荧光素溶解，并与荧光蛋白以摩尔比1:3的比例，在30℃条件下进行避光孵育3.5h，得到含有串联染料的混合溶液，其中，所述荧光素为Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7菁染料中的任意一种或多种组合，所述荧光蛋白为多甲藻黄素-叶绿素蛋白复合物PerCP、别藻蓝素APC和藻红蛋白PE任意一种或多种组合。
3.如权利要求2所述的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1-10：20-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的串联染料，包括：
通过透析去除含有串联染料的所述混合溶液中的未反应的所述荧光素，并将去除了未反应荧光素后的所述串联染料与交联剂A以摩尔比1：50的比例，在室温条件下避光孵育3h，得到活化的串联染料，其中，所述交联剂A包括(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯SMCC、磺基化SMCC、聚乙二醇化SMCC和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP任意一种或多种组合。
4.如权利要求3所述的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述将抗体与交联剂B以摩尔比0.5-8:4-100的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到活化的抗体，包括：
将抗体与交联剂B以摩尔比1:40的比例，在室温条件下避光孵育1h，并通过分子筛纯化方法除去未反应的交联剂小分子，得到活化的抗体，其中，所述抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4任意一种或多种组合，所述交联剂B包括二硫苏糖醇DTT、三(2-羧乙基)膦TECP、2-甲基-6-乙基苯胺2-MEA，2-亚氨基硫烷盐酸盐Traut’s试剂和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯SATA任意一种或多种组合。
5.如权利要求4所述的一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，将活化后的串联染料与抗体以摩尔比0.3-4:0.5-5的比例，在4-40℃条件下避光孵育1-18h，得到CD45抗原检测的试剂盒，包括：
将活化后的串联染料与抗体在室温条件下避光孵育1.5h，通过分子筛或亲和层析进行纯化，得到CD45抗原检测的试剂盒。
6.一种用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒，其特征在于，所述用于流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒包括抗体、荧光素、荧光蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂A、交联剂B和缓冲液，其中，所述防腐剂为NaN3、DMDMH、Proclin系列、咪唑和吡啶硫酮钠任意一种或多种组合，所述稳定剂为蔗糖、明胶、甘油、牛血清白蛋白BSA、NaCl和EDTA任意一种或多种组合，所述缓冲液为HEPES、MES、MOPS和磷酸盐缓冲液任意一种或多种组合。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200421 |