CN108732082A - 细胞分群方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞分群方法，包括以下步骤：使用第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针对同一份待检测样品进行荧光染色得到染色后样品，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分或全部重叠的荧光发射光谱，且所述第一荧光染料和第二荧光染料在其重叠的荧光发射光谱的至少一个区间内的荧光强度的比值大于3:1；将所述染色后样品经流式细胞术检测得到所述区间内的荧光强度结果，根据所述荧光强度结果区分细胞亚群。本发明的细胞分群方法最少只需通过一个荧光通道的荧光强度差异即可区分不同细胞类群，如此可以减少需要的荧光通道数量，使用更少的荧光通道完成细胞分群的工作，降低对仪器设备的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及一种细胞分群方法。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种对单个细胞表面或细胞内化学成分进行定量分析和分选的技术，主要通过采集前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)将细胞大小和细胞内粒度不同的细胞分开，并通过识别细胞表面和细胞内特异的荧光标记，实现对DNA、RNA、细胞因子、细胞表面抗原等的检测。该技术作为一种快速细胞分析技术，不仅应用于免疫学、微生物学等基础医学研究，更广泛应用于肿瘤学、血液学等临床检测。例如流式细胞术可以通过识别细胞表面特异的免疫荧光信号，来实现T淋巴细胞亚群的区分，有助于评价机体的细胞免疫功能。但是，目前通过流式细胞术进行细胞分群时需要较多的荧光通道，因此对仪器的要求也相应较高，提高了应用的门槛和成本。
发明内容
基于此，有必要提供一种需要的荧光通道较少的细胞分群方法。
一种细胞分群方法，包括以下步骤：
使用第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针对同一份待检测样品进行荧光染色得到染色后样品，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分或全部重叠的荧光发射光谱，且所述第一荧光染料和所述第二荧光染料在其重叠的荧光发射光谱的至少一个区间内的荧光强度的比值大于3:1；
将所述染色后样品经流式细胞术检测得到所述区间内的荧光强度结果，根据所述荧光强度结果区分细胞亚群。
本发明的细胞分群方法使用不同的荧光染料与不同的探针(例如抗体等)连接，利用不同类群细胞可结合不同种类探针的特性标记不同类群细胞，同时由于第一荧光染料和第二荧光染料的荧光发射光谱具有重叠区域，均可受激发在所述重叠区域发射荧光；且第一荧光染料和第二荧光染料在重叠的荧光发光光谱的某个区间内(在流式细胞术中又称为荧光通道，其区间的波长范围由流式细胞仪中的滤光片控制)，第一荧光染料和第二荧光染料的荧光强度有明显差异(例如，其比值大于3:1)，因此只需通过该荧光通道的荧光强度差异即可区分出不同细胞类群。如此可以减少需要的荧光通道数量，使用更少的荧光通道完成细胞分群的目的，从而降低了对流式细胞仪器的要求，降低流式细胞术在医疗和科研领域的应用成本和门槛。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料选自以下荧光染料中的两种：荧光蛋白、荧光量子点、香豆素类荧光染料、罗丹明类荧光染料、花菁类荧光染料、方酸类荧光染料、氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料、高聚物荧光染料以及由上述荧光染料中的至少两种荧光染料所构成的串联染料。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料为荧光蛋白类的别藻蓝蛋白，所述第二荧光染料为花菁类荧光染料的Cy5。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料为荧光蛋白类的藻红蛋白，所述第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的RBITC。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料为量子点QD525，所述第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的异硫氰酸荧光素(FITC)。
在其中一个实施例中，所述第一探针和所述第二探针为抗体，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在其中一个实施例中，所述第一探针和所述第二探针为识别人类或其他哺乳动物白细胞分化抗原的单克隆抗体。
附图说明
图1为实施例1的细胞流式散点图；
图2为对比例1的细胞流式散点图；
图3为实施例2的细胞流式散点图；
图4为对比例2的细胞流式散点图；
图5为实施例3的细胞流式散点图；
图6为对比例3的细胞流式散点图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施方式的细胞分群方法，包括以下步骤S1～S2：
S1、使用第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针对同一份待检测样品进行荧光染色得到染色后样品，第一荧光染料和第二荧光染料具有部分或全部重叠的荧光发射光谱，且第一荧光染料和第二荧光染料在其重叠的荧光发射光谱的至少一个区间内的荧光强度的比值大于3:1。
S2、将染色后样品经流式细胞术检测得到上述区间内的荧光强度结果，根据荧光强度结果区分细胞亚群。
在一般的流式细胞分群方法中，往往采用荧光光谱特性有显著区别的荧光染料与不同的探针连接，然后分别检测得到不同荧光通道的检测结果以区分不同类群的细胞，这种方案需要使用较多的荧光通道，也就相应需要更复杂更昂贵的仪器。本实施方式的细胞分群方法使用不同的荧光染料与不同的探针(例如抗体等)连接，利用不同类群细胞可结合不同种类探针的特性标记不同类群细胞，同时由于第一荧光染料和第二荧光染料的荧光发射光谱具有重叠区域，均可受激发在所述重叠区域发射荧光，且第一荧光染料和第二荧光染料在重叠的荧光发光光谱的某个区间内(在流式细胞术中又称为荧光通道，其区间的波长范围由流式细胞仪中的滤光片控制)，第一荧光染料和第二荧光染料的荧光强度有明显差异(例如，其比值大于3:1)，因此只需通过该荧光通道的荧光强度差异即可区分出不同细胞类群。如此可以减少需要的荧光通道数量，使用更少的荧光通道完成必要的细胞分群，降低了对流式细胞仪器的要求，从而降低流式细胞术在医疗和科研领域的应用成本和门槛。可以理解，荧光染料的数量不限于两种，两种以上皆可，只要其中任意两种荧光染料在上述荧光通道的荧光强度的比值均大于3:1即可，例如同时使用第三荧光染料标记的第三探针对同一份待检测细胞样品进行荧光染色则可利用一个荧光通道区分三个细胞亚群。
在一个实施例中，第一荧光染料和第二荧光染料选自以下荧光染料中的两种：荧光蛋白、荧光量子点、香豆素类荧光染料、罗丹明类荧光染料、花菁类荧光染料、方酸类荧光染料、氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料、高聚物荧光染料以及由上述荧光染料中的至少两种荧光染料所构成的串联染料。
在一个实施例中，第一荧光染料为荧光蛋白类的别藻蓝蛋白(Allophycocyan，APC)，第二荧光染料为花菁类荧光染料的Cy5。别藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离纯化的，能发出强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围，Cy5和APC在流式细胞仪的APC荧光通道都可产生荧光信号，但APC的荧光信号强度是Cy5的5倍以上，因此仅利用APC荧光通道即可进行细胞分群。
在一个实施例中，第一荧光染料为荧光蛋白类的藻红蛋白(R-phycoerythrin，PE)，第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的RBITC。藻红蛋白是从红藻中分离纯化的，在特定波长激发下能发射强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围，RBITC和PE在流式细胞仪的PE荧光通道都可产生荧光信号，但PE的荧光信号强度是RBITC的5倍以上，因此仅利用PE荧光通道即可进行细胞分群。
在一个实施例中，第一荧光染料为量子点QD525，第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的异硫氰酸荧光素(FITC)，QD525的荧光信号强度是FITC的50～100倍。
在一个实施例中，第一探针和第二探针为抗体，抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。进一步地，第一探针和第二探针为识别人类或其他哺乳动物白细胞分化抗原(cluster ofdifferentiation，CD抗原)的单克隆抗体。
可选地，第一探针和第二探针选自以下抗体中的两种：CD45抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD56抗体、CD19抗体、CD16抗体和CD8抗体。
在一个实施例中，荧光染色的具体步骤包括：用PBS缓冲液对待检测细胞样品离心洗涤后制成单细胞悬液，然后加入第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针，混匀后于室温避光孵育得到染色后样品。进一步地，避光孵育的时间为20～40min。可选地，PBS缓冲液的pH为7.0～7.4。可选地，制成单细胞悬液的具体步骤包括：将待检测细胞样品用PBS缓冲液重悬并调整细胞浓度为1×106～1×107个/mL，以使荧光染料标记的探针可与细胞充分接触。
在一个实施例中，荧光染色的具体步骤包括：取40～50微升EDTA-K2抗凝新鲜人血，加入第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针，混匀后于室温避光孵育10～20min，然后加入溶血剂，混匀后于室温避光溶血10～20min。
在一个实施例中，流式细胞术检测的具体步骤包括：将染色后样品置于流式细胞仪的样品台上，利用流式细胞仪进行测试，采集前向散射光、侧向散射光和上述荧光通道的检测数据。
以下为具体实施例。
实施例1
CD4+T淋巴细胞分析：使用RBITC-CD45和PE-CD4试剂染色血样得到染色后样品，将染色后样品经流式细胞术检测得到PE荧光通道的检测数据，如图1的A、B所示。图1-A中P1区域为所有淋巴细胞，图1-B中P2区域为CD4+淋巴细胞。由于RBITC-CD45可结合所有淋巴细胞，PE-CD4仅结合CD4+淋巴细胞，同时RBITC和PE在流式细胞仪的PE荧光通道都产生荧光信号，且PE的荧光信号强度是RBITC的20～30倍，因此仅通过PE荧光通道即可以区分出CD4+细胞和其他淋巴细胞。
对比例1
CD4+T淋巴细胞分析：使用FITC-CD45和PE-CD4试剂染色血样得到染色后样品，染色后样品经流式细胞术检测至少需要得到FITC荧光通道和PE荧光通道的检测数据，如图2的A、B所示，首先通过FITC荧光通道将淋巴细胞从细胞碎片中区分出来(图2-A P1区域为所有淋巴细胞)，然后通过PE荧光通道将CD4+淋巴细胞从淋巴细胞中区分出来(图2-B右上象限为CD4+淋巴细胞)，至少需要使用比实施例1多一个荧光通道才能得到CD4+淋巴细胞占所有淋巴细胞的比例。
实施例2
CD19+T淋巴细胞分析：使用Cy5-CD45和APC-CD19试剂染色血样得到染色后样品，将染色后样品经流式细胞术检测得到APC荧光通道的检测数据，如图3的A、B所示。图3-A中P1区域为所有淋巴细胞，图3-B中P2区域为CD19+淋巴细胞。由于Cy5-CD45可结合所有淋巴细胞，APC-CD19仅结合CD19+淋巴细胞，同时Cy5和APC在流式细胞仪的APC荧光通道都产生荧光信号，且APC的荧光信号强度是Cy5的5～20倍，因此仅通过APC荧光通道即可以区分出CD19+淋巴细胞和其他淋巴细胞。
对比例2
CD19+T淋巴细胞分析：使用FITC-CD45和APC-CD19试剂染色血样得到染色后样品，染色后样品经流式细胞术检测至少需要得到FITC荧光通道和APC荧光通道的检测数据，如图4的A、B所示，首先通过FITC荧光通道将淋巴细胞从细胞碎片中区分出来(图4-A P1区域为所有淋巴细胞)，然后通过APC荧光通道将CD19+细胞从淋巴细胞中区分出来(图4-B右上象限为CD19+淋巴细胞)，至少需要比实施例2多一个荧光通道才能得到CD19+细胞占所有淋巴细胞的比例。
实施例3
CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD16+淋巴细胞联合分析：使用CY5-CD45、APC-CD4、PE-CD16和APC-CY7-CD8试剂染色血样得到染色后样品，将染色后样品经流式细胞术检测得到APC、PE和APC-A750荧光通道的检测数据。如图5的A所示，LYM2区域为所有淋巴细胞，且CD4+淋巴细胞和其他淋巴细胞区分明显。由于Cy5-CD45可结合所有淋巴细胞，APC-CD4仅结合CD4+淋巴细胞，同时Cy5和APC在流式细胞仪的APC荧光通道都产生荧光信号，且APC的荧光信号强度是Cy5的5～20倍，因此仅通过APC荧光通道即可以区分出CD4+淋巴细胞和其他淋巴细胞。如图5的B所示，APC-CY7-CD8仅结合CD8+淋巴细胞，因此图5B可以区分出CD4+淋巴细胞(右下象限)和CD8+淋巴细胞(左上象限)。如图5的C所示，PE-CD16仅结合CD16+淋巴细胞，因此图5C可以区分出CD16+淋巴细胞(右下象限)和CD8+淋巴细胞(左上象限)。如此，仅通过APC、PE和APC-A750三个荧光通道可完成CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD16+淋巴细胞分群。
对比例3
CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD16+淋巴细胞联合分析：使用PerCP-CD45(PerCP为荧光蛋白类荧光染料)、APC-CD4、PE-CD16和APC-CY7-CD8试剂染色血样得到染色后样品，将染色后样品经流式细胞术检测得到PerCP、APC、PE和APC-A750荧光通道的检测数据。如图6的A所示，PerCP-CD45可结合所有淋巴细胞，通过PerCP-CD45信号和侧向散射光(SSC)信号可区分出淋巴细胞(图6-A LYM区域为所有淋巴细胞)。如图6的B所示，APC-CD4仅结合CD4+淋巴细胞，APC-CY7-CD8仅结合CD8+淋巴细胞，因此图6-B可以区分出CD4+淋巴细胞(右下象限)和CD8+淋巴细胞(左上象限)。如图6的C所示，PE-CD16仅结合CD16+淋巴细胞，因此图6-C可以区分出CD16+淋巴细胞(右下象限)和CD8+淋巴细胞(左上象限)。如此，需要通过PerCP、APC、PE和APC-A750四个荧光通道完成CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD16+淋巴细胞分群，比实施例3多用一个荧光通道。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种细胞分群方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用第一荧光染料标记的第一探针和第二荧光染料标记的第二探针对同一份待检测样品进行荧光染色得到染色后样品，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分或全部重叠的荧光发射光谱，且所述第一荧光染料和所述第二荧光染料在其重叠的荧光发射光谱的至少一个区间内的荧光强度的比值大于3:1；
将所述染色后样品经流式细胞术检测得到所述区间内的荧光强度结果，根据所述荧光强度结果区分细胞亚群。
2.根据权利要求1所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料选自以下荧光染料中的两种：荧光蛋白、荧光量子点、香豆素类荧光染料、罗丹明类荧光染料、花菁类荧光染料、方酸类荧光染料、氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料、高聚物荧光染料以及由上述荧光染料中的至少两种荧光染料所构成的串联染料。
3.根据权利要求1所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一荧光染料为荧光蛋白类的别藻蓝蛋白，所述第二荧光染料为花菁类荧光染料的Cy5。
4.根据权利要求1所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一荧光染料为荧光蛋白类的藻红蛋白，所述第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的RBITC。
5.根据权利要求1所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一荧光染料为量子点QD525，所述第二荧光染料为罗丹明类荧光染料的异硫氰酸荧光素。
6.根据权利要求1～5任一项所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针为抗体，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的细胞分群方法，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针为识别人类或其他哺乳动物白细胞分化抗原的单克隆抗体。
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