CN104662170A - 通过使用流式细胞术的rna测量快速检测t细胞活化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测至少一种表达于单个细胞中的RNA分子的拷贝的方法及其用途。

Description

通过使用流式细胞术的RNA测量快速检测T细胞活化
相关申请的交叉参考
本申请要求提交于2012年6月27日的美国临时申请61/665,231和提交于2013年3月14日的美国临时申请61/784,802的优先权。这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。
政府利益
本文所公开的发明至少部分是在国立卫生研究院基金编号AI045761、AI106036、MH079197和HL106788的政府资助下完成的。美国政府对本发明有一定的权利。
技术领域
本发明涉及一种快速检测单个细胞中的基因表达的方法。
背景技术
许多病理学病症引起T细胞介导的免疫应答。这些病症包括癌症、自身免疫、移植以及包括如结核病(TB)的感染性疾病。在所有这些病症下，涉及T细胞活化的T细胞受体(TCR)与特异性抗原(Ag)的相互作用是其共同点(common denominator)，而这种相互作用的功能结果是变化的。在任意给定的T细胞中，依据Ag的物理性质、其呈递、TCR库和Ag诱导的活化的强度，TCR信号级联反应可以刺激不同组基因的表达。在细胞活化、增殖和分化中，这些所诱导的基因表达模式的差异最终可有助于克隆扩增的效应细胞之间的功能异质性。在T细胞内稳态过程中产生了细胞-细胞多样性的另一个因素。当Ag被清除时，大多数扩增的效应细胞经细胞凋亡而死亡，而细胞中的一小部分作为长寿记忆细胞存活下来。重新暴露于Ag时所发生的反应受上述所列的因素控制，且还受先前的分化过程的影响。其结果是，对于每个所遇到的Ag，免疫应答产生功能不同的共享相同Ag特异性的T细胞亚群(如效应细胞对(vs.)中央记忆细胞对效应记忆细胞)。在免疫病理学病症的自然史(natural history)的任意给定的时间内，这些不同亚群的相对表现是可变的；它们可以决定或反映疾病的过程。T细胞亚群与体内Ag和病原体负载相关，并且如慢性病毒感染和TB的研究所示例的，这些关键亚群的定量分析有希望用于保护性免疫的诊断和测量。也应在治疗过程中看到T细胞亚群中的叙事式变化(tell-tale change)，这是因为治疗效果与免疫病理学病症的特定演化相关。此类演化状态的标签(signature)(天然的或治疗介导的)逃避了总体测量且仅可在单个T细胞水平被检测到。只有通过单个T细胞对Ag刺激的应答才能完整揭示单个T细胞的性质。
目前，基于血液的临床免疫测定通常可以识别非感染性和感染性病理的存在，但并不能揭示病理的进展。相比之下，外周血中的Ag特异性免疫细胞的单细胞功能性分析能解释多个交叉的与感染和疾病的演化相关的免疫病理状态。这种分析将有助于提高预后能力并促进有效干预。一个引人注目的实例是结核杆菌的感染。使用当前方法，通常是在患病受试者已经传染给与他/她接触的人之后，才被诊断为TB。然而，对无症状感染本身的诊断不能保证医疗干预是正当的。迫切需要从早期活动性疾病(在其是传染的之前)中区分出稳定的潜伏感染(LTBI)的能力。现有的免疫诊断测定无法满足这一需要，这是因为它们不适合区分已知在感染状态之间不同的Ag特异性的功能性T细胞亚群。此外，这些分析不能评估可能反映分枝杆菌Ag阶段特异性表达的应答。
结核分枝杆菌感染的特点是具有这种病原体的无症状感染人群的庞大数量(20亿)。在没有免疫功能降低的情况下，90％-95％的潜伏感染个体不会发展为活动性TB。然而，由于库的大小，结核分枝杆菌感染仍引起940万的新发活动性TB病例及每年170万的死亡病例。如果在感染个体发展至活动性疾病且在其具有症状和传染性之前，能鉴定并治疗感染个体，则感染的传播就会大大降低。在早期活动性疾病阶段检测结核分枝杆菌或杆菌产物是非常困难的，这是由于杆菌数量极低。标准的活动性TB的微生物学诊断检测已经在呼吸道分泌物中存在结核杆菌并因此是感染的的个体。
基于整体测量的方法简单地不适合揭示细胞介导的免疫应答的复杂性且不能揭示与疾病阶段和演化相关的稀有的或瞬时的细胞状态。用于单T细胞分析的最常见的免疫测定形式是酶联免疫斑点法(ELISPOT)和定量流式细胞(FC)分析。在Oxford Immunotech(英国)的商业ELISPOT测试中，首先从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)，洗涤并计数。然后，将预定数量(如250,000)的PBMC和结核分枝杆菌特异性Ag添加到预包被了抗干扰素γ(IFNγ)抗体的板孔中并孵育过夜(16-20小时)。在孔中捕获从活化的T细胞所释放的IFNγ。然后，与缀合到成色酶的第二抗体(Ab)孵育，在此之后，将孔洗涤并添加成色底物。T细胞分泌IFNγ，在释放细胞因子的细胞周围形成了有色环的特征外观，进而产生斑点。最后，通过肉眼或使用读板器对斑点进行计数。ELISPOT是高度敏感的(其检测极限在PBMC中是10/106)。然而，其不能在功能性T细胞亚群中提供所需的区分，这存在如下数个原因。首先，通常其不适合于同时检测数个目标。其次，此形式限制了所分析的细胞的数量(在如上述提及的商业T-SPOT.TB测试中每孔250,000个细胞)。传统的FC具有多参数能力。通过与特异性Ag(如结核分枝杆菌特异性肽或蛋白以及胞外分泌抑制剂如布雷菲德菌素或莫能菌素)孵育6小时或更久刺激全血或PBMC中的细胞。然后将透性化的T细胞用荧光团标记的抗细胞因子Ab(如FITC缀合的抗IFNγ抗体)染色并通过FC进行分析。蛋白与Ab的染色降低了常规FC的多功能性，特别是在胞内蛋白的情况下。此外，分析受方案限制，方案需要通过内源性抗原呈递细胞(APC)延长T细胞的刺激，而这增加了周转时间并降低了临床有效性。
现有的对单个细胞的细胞因子分析的方法缺少快速鉴定存在于外周血小样品中的低频率T细胞群的能力。商业ELISPOT测试不能区分TB和LTBI。此外，在无症状个体(在缺少活动性TB的微生物证据的情况下)中的阳性结果不能为再活化风险提供任何信息。因此，虽然准确地反映了结核分枝杆菌感染的存在，但阳性结果不被视为用于治疗性干预的指示。这削弱了测试的可接受性，特别是在大部分的人群受感染的低资源、高负担的国家(在南非地区，高达80％)。此外，即使在低负担、高资源的国家如美国，LTBI治疗的副作用往往会导致其在被推荐但不能指示再活化风险时被拒绝。显然地，目前的免疫诊断的局限对全球公共卫生具有巨大的影响。
因此，对于快速检测个体细胞中基因表达的方法存在未满足的需求。
发明内容
本发明涉及新的快速检测单个细胞(individual cells)中的各种RNA分子的方法。
因此，本发明的一个方面提供了一种检测至少一种在单个细胞中表达的RNA分子的拷贝(copies)的方法。方法包括：(a)提供包含细胞群(如至少100或至少10,000个细胞)的样品，其表达能通过将其结合配体或刺激分子来起始导致基因表达的信号级联反应的特异性受体；(b)通过将细胞与至少一种化合物孵育，如来源于微生物(如结核分枝杆菌)的结合特异性受体或以其它方式启动信号(signaling)并启动基因表达的肽或肽的混合物，在离体的、立即或培养后的细胞中诱导基因表达；(c)固定细胞并将细胞透性化；(d)用一组荧光标记的寡核苷酸杂交探针标记细胞所表达的至少一种RNA分子的拷贝，并洗涤掉未结合的探针；以及(e)通过流式细胞技术(FC)检测存在表达事件的细胞，表达事件是通过荧光强度门控(gating)分类的一种或多种荧光测量。
上述方法可用于检测单个细胞中的各种RNA分子。特别地，其可用于检测由细胞因子基因如IL-2、TNFα或IFNγ编码的RNA分子。
在本方法中，诱导步骤可包括通过存在于细胞群中的抗原呈递细胞(APC)或通过人工APC(aAPC)来刺激T细胞受体(TCR)信号和下游基因表达。诱导可进行30分钟至6小时。在这些情况下，诱导步骤还可以包括与至少一种单克隆抗体(mAb)的共刺激。单克隆抗体可结合到或添加到aAPC或APC。
在本方法的一个实施方式中，细胞群可以是获得自人类PBMC的T细胞群。在此情况下，至少一种RNA分子可以是被细胞因子基因编码的RNA分子。并且，细胞群中的细胞可以被具有一种或多种的装载肽(peptide-loaded)的与TCR相互作用的MHC分子的APC或aAPC诱导。
在本方法中，化合物或刺激分子可以来自微生物，如来自结核分枝杆菌，的免疫原性肽。在一个实例中，化合物可以包含肽或肽的混合物，如那些与MHC I类或MHC II类分子相关的肽或肽的混合物。这些肽或肽的混合物可以以各种浓度被添加到上述的APC或aAPC上，如在1-20μg/ml之间的浓度。
在上述方法中，诱导步骤可包括用刺激物刺激在包含toll样受体的细胞中的toll样受体信号和下游基因表达，刺激物的实例包括细胞因子、微生物产物或合成的化合物。微生物产物的实例包括脂质、聚糖、糖脂、硫脂、糖蛋白、蛋白质、肽或核酸(如RNA或DNA)。刺激可以进行30分钟至72小时(如30分钟至6小时、6小时至24小时、24小时至72小时)。刺激物可以以1-20μg/ml之间的浓度存在(如1-100ng/ml或100-1000ng/ml)。化合物或刺激物可以是细胞因子，如IFNγ、IL-2、IL-15、TNFα或IFNγ、IL-2、IL-15或TNFα之外的其它细胞因子。在本方法中，可以在同一时间或在不同时间中提供多于一种的化合物或刺激物。
在方法的步骤(d)中，探针组可以包括20-60个探针，其每个均单独地(singly)用相同的荧光部分(moiety)标记。
在另一个实施方式中，可以将不具有表达事件的细胞与(如通过荧光活化细胞分选)所检测到的具有表达事件的细胞相分离。所分离的细胞可以仅包括一个细胞或多于一个细胞(如10、100、1000、10,000或100,000个细胞)。然后可以通过如RT-PCR或细胞中的RNA的转录组分析检测在所分离的细胞中的基因表达。
本发明的一个或多个实施方式的细节阐述于下述的说明中。本发明的其它特征、目的和优点将通过说明书和权利要求书来呈现。
附图说明
图1是对于如实施例2所述的FC读数的荧光强度对前向散射通道A(FSC-A)的图。
图2是来自如实施例7所述的样品的FC检测中的一组四频率图(four frequency plot)。
图3是来自如实施例8所述的样品的FC检测中的一组六频率图。
图4是来自如实施例9所述的样品的FC检测中的一组三频率图。
图5是来自如实施例10所述的样品的FC检测中的一组十二频率图。
图6A和6B：(A)来自如实施例11所述的用mRNA探针组探测的样品的FC检测中的一组二十八频率图，以及(B)来自如实施例11所述的用mAb探测的样品的FC检测中的一组十六频率图。
图7A和7B：(A)如实施例12所述，在另外的区分细胞为细胞因子阳性和细胞因子阴性群的门控之前(左组)和之后(右组)，用针对绿色荧光蛋白的探针探测的样品的FC检测中的一组二频率图，以及(B)如实施例12所述，在另外的区分细胞为细胞因子阳性和细胞因子阴性群的门控之前(左组)和之后(右组)，同时用4个mRNA探针组探测的样品的FC检测中的一组二频率图。
图8A和8B：(A)表格示出了在如实施例12所述的分选的(+/-)细胞群中的两个基因的扩增的阈值循环，以及(B)图示出了来自如实施例12所述扩增中的扩增产物的电泳凝胶。
具体实施方式
本发明公开了一种测量和评估一个或多个基因表达的方法，包括编码蛋白的RNA转录物，如信使RNA(mRNA)和pre-mRNA以及那些不编码的RNA。
如本文所公开，所述方法可以用于评估细胞中的RNA转录物，其基因表达应答各种诱导而改变。诱导可以是天然存在的，或通过针对细胞受体的任何已知的配体而被刺激的，其包括但不限于TCR并原则上涉及任何的受体或配体(如toll受体样或趋化因子受体及其配体)或起始信号级联以及可能导致某些基因的转录合成和表达的化合物，例如至少一种细胞因子基因如IL-2、TNFα或IFNγ。
在一些实施方式中，诱导是由结合特异性受体并借此起始基因表达的化合物或多种化合物产生的刺激，例如与MHC I类或MHC II类分子相关的肽或肽的混合物。化合物或多种化合物可以源自微生物，例如来自结核分枝杆菌的免疫原性肽的刺激分子。基因表达的诱导，例如T细胞受体信号和下游基因的表达，可以由存在于所研究的细胞群中的APC进行。或者，可以由人工APC(aAPC)进行刺激。与MHC I类或II类分子相关的肽或肽的混合物可以被添加到APC或aAPC，优选以1-20μg/ml范围的浓度，以产生与TCR相互作用的肽加载的MHC分子。本发明的方法的某些实施方式包括与除了APC或aAPC的至少一种单克隆抗体共刺激。与aAPC共刺激时，mAb可以结合到aAPC。
本发明的方法允许对在传染性或非传染性疾病的演变和病理学相关进展过程中所发生的细胞群的组成和功能的改变进行快速和灵敏的测量。这些测量可以表征造血细胞起源的和非造血细胞起源的细胞的肿瘤细胞和/或恶性细胞以及参与自身免疫疾病的细胞的特性。
本方法也可以在治疗疾病状态的治疗中用于监测应答。对于感染性疾病，响应抗生素治疗的免疫对照可以通过将在根除病原体(如结核分枝杆菌)的相关进展与对刺激的细胞应答的改变相关联而测定，如功能性T细胞亚群对抗原肽的响应。
本发明的方法通常适用于几乎所有的细胞，哺乳动物(包括但不限于人)和低等真核物种，其表达能够借由与配体/刺激分子结合而起始信号级联反应的特异性受体。方法可以应用于细菌群以及多细胞生物。某些优选的实施方式是本发明的方法对动物细胞(包括但不限于人细胞)的应用。合适的来源提供足够数量的用于罕见事件检测和/或统计分析的细胞。在一些实施方式中，可以少至1000或甚至100个细胞。在许多实施方式中，例如当细胞是T细胞，提供至少10,000个细胞的来源是优选的。更优选地，来源提供至少100,000个细胞或至少一百万个细胞。合适的来源包括血液样品和组织样品，如活检样品。组织样品必须被分离成单个细胞，也就是说，需要分解组织以用于处理。
如上所述，本发明的方法包括快速诱导，其不超过5天，优选更少如4、3、2或1天，或16、12、10、8、6或4小时。优选的诱导时间是30分钟至8小时，优选的是30分钟至6小时，更优选的是30分钟至4小时，甚至更优选的是30分钟至2小时。
本发明的方法包含快速测量免疫和非免疫细胞中一个或多个基因的表达，基于由离子流诱导的活化和功能性结果，包括但不限于那些由离子载体和/或有丝分裂原引起的，或由穿过细胞表面的信号或细胞内受体引起的，包括但不限于模式识别受体，其包括toll样受体和NOD和NOD样受体、G蛋白偶联受体，其包括趋化因子受体、多肽激素受体、细胞因子受体、B细胞受体或TCR。根据本发明的方法被认为促进了对各种感染和非感染性病理学的医学治疗。优选的实施方式包括检测RNA的表达，其包括mRNA和pre-mRNA，所述RNA对应于在个体淋巴细胞中的一种或多种细胞因子，无论是在分离的PBMC、T细胞中还是在全血样品(而不是分离的PBMC)以及如下所示的其它类型的细胞。根据本发明的方法适用于，例如分析产生IL-2、IFNγ和TNFα的CD3+CD4+T细胞(T辅助细胞1或Th1细胞)；产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13的CD3+CD4+T细胞(T辅助细胞2或Th2细胞)；产生IL-2、IFNγ、TNFα、MIP-1α和其它趋化因子的CD3+CD8+T细胞和其它特异化的T细胞亚群，包括但不限于Th17和Treg细胞，或其它淋巴细胞亚群，包括但不限于NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞和树突细胞的亚群，包含各种身体器官或细胞的内皮细胞和上皮细胞的细胞和神经系统的细胞，包括但不限于神经元和神经胶质细胞，和由这些细胞产生的细胞因子、趋化因子和功能性分子(例如，参见表2)的pre-mRNA和mRNA。
根据本发明的某些方法包含细胞的离体刺激或导致活化标记物(markers)的表达和调节细胞功能的特异性分子间相互作用的诱导。可以立即进行刺激或在培养基中培养之后在细胞上进行刺激。刺激可以是天然的，即简单地在培养基中孵育细胞。优选地，可以通过用一种或多种触发特异性受体/配体并诱导信号级联的化合物在培养基中孵育细胞来促进刺激。这些化合物可以是合成的或来自微生物的，其包括但不限于：细菌、病毒和真菌，如脂多糖、脂阿拉伯甘露糖、肽聚糖、细菌来源的分枝菌酸或病毒来源的蛋白质，其包括但不限于Epstein Barr病毒或巨细胞病毒(分别地，例如蛋白质ebvIL-10、cmvIL-10和UL146)或真菌的(如与隐球菌和曲霉菌相关的)木糖甘露聚糖(galactoxylo-)和半乳甘露聚糖(galactomannans)以及可溶性抗原；多肽激素，如来源于血小板的生长因子或VEGF；细胞因子；以及抗原(包括抗原肽)。优选的刺激方法是用人工抗原呈递细胞(aAPC；参见下文)。
根据本发明的方法进一步包含个体细胞的检测，包括特定活化的细胞，其具有生物标记(biomarker)标签，优选多个生物标记标签，即一个或多个RNA，其中RNA尤其包括在完整细胞中的原位的mRNA或pre-mRNA。
根据本发明的优选的方法包括利用多组荧光标记的(labeled)杂交探针并洗去未结合的探针，通过标记在固定的、透性化的细胞中表达的RNA分子(包括mRNA或pre-mRNA分子)检测单个细胞如活化的T细胞中诱导的基因表达，如细胞因子的基因，以及最优选的是多种细胞因子的基因。通过采用为每个RNA靶提供多个荧光标记的多重核酸杂交探针，获得了单分子灵敏度。这些可能是少量的与特定荧光团多重标记的探针，或当探针被杂交到同源mRNA或pre-mRNA时，通过荧光共振能量转移(FRET)来产生荧光的标记的探针。优选的本发明的方法利用大量的如10-100个，更优选的是20-60个，甚至更优选的是30-50个，如约50个更短的寡核苷酸探针，其每个均用单个荧光染料标记并同时结合到靶序列上。每个RNA分子附着许多标记使得细胞具有充足的高于背景的荧光，使其可以通过FC方法来检测。
此外，根据本发明的方法包括通过FC对表达单个靶RNA或多个靶RNA的单个细胞进行检测和分析。本发明的某些优选的方法包括使用定量的FC以检测包括在所需的细胞中通过APC或aAPC刺激所诱导的细胞因子基因的RNA表达产物的细胞。
FC包括用于流体动力学聚焦的流控系统来创建细胞的单个文件。然后可以测量细胞的一个或多个波长的荧光发射。FC是临床病理学实验室中的常规技术。例如，利用FC的免疫表型是各种血液肿瘤(haematologic neoplasms)的诊断和分期中的重要工具。必要的FC步骤是：用一种或多种荧光部分如荧光团标记细胞，将标记的细胞引入流式细胞仪，用激发光源如激光照射每个细胞，其中激光发射激发荧光部分的波长，并使用区分所使用的各个荧光部分的特定的发射波长的滤光镜和反光镜检测所发射的荧光，以基于激发和发射获取揭示与各个细胞相关的每个荧光部分的存在以及优选的量的数据。
如本文所公开，FC可通过利用多个单标记的荧光杂交探针来用于检测表达RNA的细胞。最优选的实施方式是检测表达自分离的PBMC的T细胞部分中的细胞因子基因的RNA(mRNA或pre-mRNA)，所述PBMC被内源性APC或更优选的aAPC通过结核分枝杆菌Ag的呈递而刺激。可以通过使用特异于各个种类的RNA并用不同的荧光部分(如不同的荧光团)标记检测的各个种类的RNA的探针来检测多个细胞因子的RNA。
在本发明的方法中，对细胞群(从少至10,000个细胞至超过一百万个细胞)进行FC。获得一个或多个事件的数据。事件是对一个细胞的一组测量。各个事件的数据被分类成用户定义的窗口，例如荧光团A的信号或在强度水平X和强度水平Y之间的荧光团A的信号。FC读数的分类是一个被称为门控(gating)的过程，并且因此事件是门控的或选择的，其通常高于某个阈值或受某些阈值所限制。然后，结果可以在某一窗口以细胞的绝对数量的方式呈现，或优选地，在一个或多个窗口以细胞的部分的方式呈现，即频率。例如，在分析疾病状态时，结果可能是10％的细胞对于mRNA A和mRNA B呈阳性，7％的细胞对于mRNA B和mRNA C呈阳性，并且2％的细胞对于所有三个mRNA A、mRNA B和mRNA C呈阳性。如果对10,000个细胞进行分析，最低可能性的阳性结果是某一事件在10,000个细胞中仅发生一次。如果，在另一个方面中，对一百万个细胞进行分析，最低可能性的阳性结果是某一事件在一百万个细胞中仅发生一次。
FC结果的分析可包括方差分析(ANOVA)，其是用于分析差别的统计模型的集合，通常通过将总差别分割成归因于真随机误差的部分和归因于平均值之间的差别的部分来测试各组的平均值或变量之间的显著差异。
本发明还公开了用于实施上述方法的试剂盒。根据本发明的试剂盒包括至少一种刺激化合物，如刺激作为所测试的疾病状态的应答特征的一种或多种细胞因子的表达的蛋白或肽，或装载这样的肽并且带有如下所述的共刺激分子的aAPC，以及一组或多组寡核苷酸探针，所述探针均特异性杂交到存在于mRNA或pre-mRNA的单个序列，优选地，其中每个组包括20-60个各自含有16-20个碱基的寡核苷酸，并且每个寡核苷酸用单个荧光团标记。试剂盒可以另外地包含mRNA特异性探针之外的物质，如识别细胞蛋白的荧光团-共轭Ab或标记有结合目标靶的荧光团的化学探针，用于将所分析的细胞固定并透性化的试剂，用于将所包括的探针与细胞的杂交的试剂，以及用于杂交后处理的试剂，如洗涤以去除多余的未杂交的探针或其它未结合的标记的探针的试剂。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括利用存在于细胞群中的APC或利用合成的珠子(其在本文中被称为aAPC)刺激TCR信号和下游基因的表达。合成的珠子充当一种机械支撑，即一个平台，可通过化学、电荷或任何其它类型的结合将蛋白(MHC和/或共刺激受体以及配体)附着其上。因此，例如，可以使用任何具有或不具有(如果必要)化学修饰或衍生化的塑料表面作为aAPC的机械支撑或平台。
APC与所添加的肽(或蛋白)相互作用(或反应)，使得它们与MHC分子相关联(或由MHC分子内源性加工和呈递)，然后可以刺激TCR。aAPC与结合MHC分子的所添加的肽相互作用，然后这些负载肽的aAPC能刺激TCR。因此，aAPC携带一种或多种类型的与TCR相互作用的装载肽的MHC分子，具有或不具有与表达在T细胞上的共刺激受体(如CD28和/或CD49d)相互作用的一种或多种抗体或其它类型的配体。在某些优选的实施方式中，刺激肽是结核分枝杆菌源性免疫原。刺激TCR的步骤包括将表达TCR的细胞与包含装载合适的肽的MHC I类或II类分子的APC或aAPC孵育，并且在一些实施方式中，装载共刺激蛋白或功能等同物如抗体、肽、在增强信号的共刺激受体上结合它们的靶的各种携带碳水化合物和脂的分子，从而导致T细胞的活化。
功能不同的T细胞亚群通常以接近当前检测极限的频率(通常是0.01-0.1％)表达。因此，它们的检测需要强力的TCR刺激和高灵敏度的检测方法，使得即使是稀少的T细胞亚群也可直接检测或扩展到高于特定测定法的检测极限的数字。本发明的方法包括利用存在于细胞群中的APC或通过aAPC来诱导有效的TCR刺激，aAPC是基于合成珠的平台，其包含(ⅰ)装载有合适肽的MHC I类或II类分子，且在某些优选的实施方式中，(ⅱ)共刺激蛋白(抗-CD28和/或抗-CD49d单克隆抗体)，其提供了额外的信号(Oelke等人，2003,Nature Medicine 9(5):619-24)。实际上，任何的MHC等位基因均可附着到珠平台并且任何共刺激信号也可以珠附着的特异性单克隆抗体(mAb)或共受体的配体形式提供，无论是天然存在的或是化学确定的。除了它们的优异的刺激性质，aAPC是非常稳定的：有或没有结合的合成肽的最终的细胞尺寸的aAPC在冻干形式下具有长的保质期且易于运输。
在本发明的方法中，刺激程序通常包括：从受试者中获得所需的细胞，在培养基中孵育细胞，并添加化合物以在不同时间中刺激所培养的细胞，如30分钟、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h或更长时间(如1、2、3、4或5天)。可通过实体组织的活检或从目标位点的液体中细胞的抽吸(如通过支气管肺泡灌洗)获得细胞，或细胞的来源可以是外周血。在通过裂解这些细胞以将其从不需要的细胞中分离并从裂解的细胞的残留物中分离完整的所需的细胞，或基于特异性的细胞特性从不需要的细胞中分离所需的细胞之后，可培养所需的细胞。例如，可以在裂解红血细胞(RBC)之后，或在基于细胞密度通过Ficoll的沉降并在于培养基中孵育之前去除Ficoll的回收之后培养来源于血液的PBMC。可通过添加足以产生被检测的应答的量的如上所述的刺激化合物(如细菌、真菌或病毒性产物或宿主蛋白或肽)并孵育足以产生应答的时间来实现刺激。应答可以是由培养的经刺激的细胞的pre-mRNA或mRNA的合成。应答可被解释为所需的细胞对于所给定的刺激的应答的标签(signature)特征。
为了获得结核分枝杆菌感染的标签，例如，基于HLA-A*0201的aAPC可装载HLA-A*0201表位(肽)，已知该表位结合来源自已知的Ag如Rvl886c、Rv3874和Rv3875的人HLA-A-0201MHC I类蛋白，并且装载Ag的、基于A2的aAPC可以在标准培养条件下与PBMC以1：1比例进行混合以检测CD8+T效应物。基于HLA-DRB1*04的aAPC可以类似地进行装载并用于检测CD4+T效应物。
为了检测包含一种或多种特异性RNA的拷贝的细胞，对于各个RNA，可以利用一组多荧光标记的寡核苷酸杂交探针。寡核苷酸探针可以是DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。它们可包括非天然核苷酸、核苷酸类似物和非天然核苷酸间连接。每个探针可被多个荧光部分标记，如多个拷贝的荧光团、量子点或其它荧光部分。例如，WO/1997/014816描述了利用单步骤原位杂交来检测β-和γ-肌动蛋白的mRNA，该检测利用5个探针/靶，探针是约50个核苷酸长的单链DNA，其每10个核苷酸标记有一个荧光团(荧光素或Cy3)，即每个探针有5个荧光团。本发明的优选方法利用大量的，如10-100，更优选20-60，甚至更优选30-50，例如约50个更短的寡核苷酸探针，其各个均标记有单个荧光染料并同时结合靶序列。许多标记附着到各个RNA分子上，使细胞呈现出高于背景的充足的荧光，使得可通过FC方法来检测。在大多数的实施方式中，每个探针组将具有单个荧光部分，并且各个荧光部分将与存在的其它荧光部分可检测地相区分。然而，如果检测各个细胞是否表达第一RNA或第二RNA，则两个探针组可被相同的荧光部分标记。
利用FC的本发明的方法的背景荧光存在与利用作为细胞中亮点的单个RNA的显微可视化的显微smFISH法不同的问题。本发明的方法可以使用背景削减(reduction)技术。一种这样的技术是在相邻排列于靶RNA上的探针间采用FRET。对例如第一探针和第二探针而论，其中临近于(在合适的FRET距离内，如已知)第二探针3'末端的第一探针的5'末端相邻地排列，可以添加FRET供体至第一探针的5'末端并添加FRET受体至第二探针的3'末端。当具有此组合时，细胞在供体荧光团如荧光素的吸收波长处激发，但信号在受体荧光团如德克萨斯红的发射波长处被检测到。由于德克萨斯红荧光团没有被直接地激发，未杂交的探针或错杂交的探针不发荧光。另一种技术是在双链DNA染料和探针组的荧光团之间采用FRET，如在用Resonsense探针探测时所进行的。在这种情况下，包含dsDNA染料如SYBR Green(SYBR Green具有与荧光素非常类似的吸收和发射波长)，并且探针组被接受来自SYBR Green(如TMR)的发射的荧光团所标记。当具有此组合时，可以在SYBR Green的吸收波长处激发细胞，但在荧光团的发射波长处检测发射。由于荧光团没有被直接激发，未杂交的探针不发荧光。
虽然RNA的所有区域都可以作为探针的靶，但在这样的探针的选择上，应考虑几个因素。优选地，靶区域在细胞中不应自基因组的其它区域表达，或更优选地，靶区域不应存在于基因组中的其它位置上。这可以通过在列出了所表达的基因以及所研究的生物体的整个基因组序列的数据库中检查所需靶的序列来保证。潜在的生成背景的序列的这种“过滤”可以利用公开可用的计算机程序如“重复掩蔽(repeat masker)”进行。探针可以选自靶的直接相邻区域或在相邻探针之间有一些空间。探针的长度可依据杂交的严谨性而改变。
如下所示，实施例1证明了在单个细胞中诱导和探测基因表达的显著的特征标签。
更具体地，进行分析以测试用受辐射的结核分枝杆菌刺激的分化的THP-1细胞。刺激24小时之后用4％多聚甲醛孵育细胞20分钟以固定细胞，然后用探针杂交2个mRNA靶。一个是TNFα，其是分析活化的T细胞和巨噬细胞的关键靶。另一个是ACSL1(脂质代谢基因，GenBank登录号#BC050073.1)，其也有望通过刺激来诱导。特异于TNFa的探针组(Ensembl序列号ENST00000376122)包含48个探针，其每个约20个核苷酸长并末端标记有四甲基罗丹明荧光团。特异于ACSL1的探针组包含48个探针，其每个约20个核苷酸长并标记有光学可区分的荧光团，即AlexaFluor596。
对于实施例1，使用如Raj等人，2010,Methods in Enzymology 472:365-386和Raj等人，2008Nature Methods 5:877-879中所述的已知的显微技术，即smFISH，来检测所表达的RNA产物。这种技术包括检测作为探针组与单个RNA分子杂交的指示的荧光斑点。在实施例1中，检测了对应于两种mRNA的斑点。将相同组细胞的每个通道的TNFa和ACSL1的图像合并为3-D堆叠(stack)。解释包含使用计算机程序的图像处理以鉴定衍射限制的斑点，其对应于mRNA的单个分子，将其叠加在细胞的DIC图像上，并如文献所述获得mRNA分子的数量的逐个细胞的计数(cell-by-cell count)。观察到各个基因的转录物的数量的大的细胞间的差异，其与之前观察到的哺乳动物细胞中的mRNA合成是高度随机的相一致。基于在50个连续分析的细胞中所计数的斑点的总数，在经刺激的和未刺激的细胞中的TNFa的平均斑点数的结果表明，单个细胞测量远比整体测量获得更多的信息。
可以通过常规的FC技术进行本发明的方法的FC数据采集。可以在前向散射信道(FSC)和侧向散射信道(SSC)中检测光。数据可以用密度图和等值线图之一或两者来表示。为了可视化目标细胞并同时排除不想要的颗粒如碎片的结果，使用了FC门控。以常规方式测定门和窗或区域，使得阳性事件呈现于窗口中。为了辅助门控从假阳性中区分出真阳性事件，使用阴性对照(即探测细胞无法表达的物质)是有帮助的。原则上，这类似于蛋白的FC，其中利用了同种型阴性对照和/或未染色的细胞。
FC检测揭示了样品中阳性事件的数量，例如在10,000个细胞中的1个阳性事件(1/10,000)、在100,000个细胞中的3个阳性事件(3/100000)或在一百万个细胞中的2个阳性事件(2/106)。事件的频率可以会导致关于生物学状态如疾病状态的结论。或者，组合可如下所示；例如，样品中10％的细胞对第一细胞因子(细胞因子A)呈阳性并对第二细胞因子(细胞因子B)也呈阳性。作为另一个实例，可以通过以下组合表征疾病状态：10％或更多的细胞对细胞因子A和B呈阳性；7％或更多的细胞对细胞因子B和第三细胞因子(细胞因子C)呈阳性；以及2％或更多的细胞对所有三种细胞因子呈阳性。
如本文所公开，证明了FC可用作本发明方法的读出。设计如下述实施例2所述的实验来测试是否可以通过FC来检测单个细胞中由杂交至RNA靶的探针组所产生的信号。这一实施例描述了在自慢病毒构建体表达HIV GAG mRNA的细胞培养物中检测该mRNA的步骤。更具体地，用三种质粒转染293T细胞，其共同使得重组慢病毒构建体表达并与特异于GAG mRNA的探针杂交。FC结果示于图1，左边是荧光强度与前向散射信道A(FSC-A)的曲线图，其获得自未转染的细胞，右边是转染了来自慢病毒包装系统中的三种质粒的细胞。两组细胞都与GAG mRNA的探针组杂交。转染细胞群所产生的信号强度比离群未转染的细胞的信号高1-2个数量级(即高于所设阈值的那些)。作为对照，基于图像的smFISH结果分析表明了约25％的细胞表达了构建体。对相同群的FC分析发现，相同部分的细胞是发荧光的。这些结果证实，通过FC很容易地检测到mRNA的表达。此外，数据为从未刺激群的离散值中区分出低频率的强刺激(明亮的荧光)的T细胞提供了指导。受试者工作特征曲线(ROC)分析可以定义一个最佳阈值。ROC分析对于那些精通测试开发领域的人而言是公知的。参见，例如Zweig等人，1993,Clinical Chemistry 39(8):561-577和Pepe,2003,The statistical evaluation of medical tests for classification andprediction.New York,NY:Oxford。
检测T细胞活化的转录标签中的挑战是双重的-仅细胞的一个小亚群被诱导且所诱导的细胞每个细胞仅表达mRNA的数个拷贝。在如实施例7所述的实验中，发明人能够利用本发明的方法来证明既灵敏检测低频应答又同时检测数种mRNA靶。探测固定细胞和FC的分析(包括刺激)能够以3.46％的频率检测表达IL-2/IFNγ对的细胞(图2，右图)，而分别以3.35％和6.37％的频率检测表达IL-2/TNFα和IFNγ/TNFα细胞因子对的细胞。单细胞因子和双细胞因子群的比较，如IFNγ(4.76-5.40‰)对IL-2/IFNγ(3.46％>)，表明并非所有的IFNγ生产者能产生IL-2。相比之下，大多数的IFNγ生产者(5.40％)似乎也表达TNFα，如通过产生IFNγ/TNFα的群的大小(6.37％)所示。这个结果预期是针对被组合的TCR触发和凝集素介导的刺激(抗-CD3mAb和植物凝集素)非特异性活化的T细胞群。因此，根据本发明的分析所给出的结果与已知的T细胞生物学相一致。
如实施例8所示，根据本发明的方法应用于检测离体刺激的结核分枝杆菌特异性细胞。将PBMC与5μg/ml的ESAT6-和CFP10-衍生肽(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec,英国)的混合物孵育5小时。如图3所示，在此刺激之后，在Ag特异性T细胞中，表达细胞因子mRNA的细胞增加～2倍。因此，即使缺少由抗-CD28mAb提供的共刺激，分析依然检测到了存在于此LTBI供体中的低频率的循环的结核分枝杆菌特异性T细胞。这一结果证明了根据本发明的分析的实用性。
相比于实施例8，实施例9描述了根据本发明的具有增加的信号的方法。使用利用mAb的TCR的CD28共受体的约束(engagement)以递送Ag特异性T细胞的强刺激(superior stimulation)。如实施例8所示，将PBMC与5μg/ml的ESAT6-和CFP10-衍生肽(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec,英国)的混合物孵育5小时，但此次具有或不具有抗-CD28mAb 53D10。
将固定并洗涤的细胞与特异于绿色荧光蛋白(GFP，阴性对照)或IFNγ的Cy5标记的DNA探针孵育，然后通过FC进行分析。细胞因子生产者的频率示于图4中。在存在抗-CD28mAb的情况下，在LTBI供体的Ag特异性T细胞中，IFNγmRNA的表达发生了多于2倍的增加。用对照GFP和HIV-1GAG探针的非特异性杂交不受CD28共刺激的影响。实施例9说明了放大信号的不同策略，即通过提供共刺激信号到由同源的Ag特异性结合的TCR上。此外，由于由抗-CD28mAb介导的共刺激不影响对照探针(GFP和HIV-1GAG)的非特异性结合，共刺激可用于增加特异性信号的强度，以超过背景噪音。
数种策略特别有助于根据本发明的分析的优化。其包括：
i)信号检测动力学。如在实施例8中，用给定来源的细胞(例如，从LTBI+和LTBI-供体的血液样品中获得的Ficoll分离的PBMC)来测定各个RNA靶(例如，细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα的mRNA)的mRNA分析物表达的动力学，所述给定来源的细胞用一个合适的诱导剂或多个诱导剂(例如，5μg/ml的Ag的混合物(如ESAT6-和CFP10-衍生肽(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec,UK)))。然后在不同时间(例如30min、2、4、8、12和16h)分别在Ag刺激的PBMC中分析各个细胞因子的表达。特别地，对于细胞因子，用抗-CD3mAb和植物凝集素(PHA)非特异性刺激的PBMC作为刺激的阳性对照。在分析特异性PBMC应答的试验中，用于测量非特异性应答的优选方法利用并比较了来自群体的PBMC，所述群体包含已知未受到和受到测量特异性应答的条件影响的个体。
ⅱ)剂量反应。可以通过在最佳信号检测时间点改变ESAT6和CFP10肽混合物的浓度(1至20μg/ml)来类似地测定对Ag刺激的剂量反应(例如，对三个细胞因子之一)。此外，可以通过独立地或组合地测试各种浓度来优化来自任何供体的PBMC的非特异性刺激(抗-CD3+PHA)，以提供对特定分析的标准阳性对照。在分析特异性PBMC应答的试验中，测定非特异性应答的优选方法利用并比较了来自群体的PBMC，所述群体包含已知未受到和受到测量特异性应答的条件影响的个体。
iii)信噪比放大。可以设计具有更多或更高强度的荧光团的探针组。这一目的也可通过数种改良策略来实现。此外，可以如前所述，修改探针标记的方法。杂交严谨性可凭经验来优化以提高信号/噪声比。
如与实施例9有关部分中所述，一个放大信号的不同策略是通过提供共刺激信号到由同源Ag特异性结合的TCR上。可以利用本文所述的分析，按如上所述的关于动力学和剂量应答优化的方法来优化共刺激的条件，以达到多种RNA的稳健检测(如三种细胞因子)。
iv)阈值的确定。RNA检测阈值的初始评价可用于使优化的分析标准化，虽然特定分析的临床可接受阈值可在随后的商业分析发展中确定。在研究阶段，可以在获得自供体并离体刺激的Ag特异性T细胞中评估RNA检测(细胞因子表达)的阈值。可以通过从于最佳时间和Ag剂量获得自Ag刺激的PBMC的值减去来自未刺激的PBMC的信号来计算Ag特异性应答。对于各个细胞因子的读出，评估ROC(受试者工作特征)曲线以显示在各个取舍点(cut point)的灵敏度和特异性之间的权衡(包括供体的平均值加上两个标准偏差)，并选择最优的阈值以鉴定Ag特异性应答。
v)血容量和处理时间的减少。目前，分析对应于平均0.8ml的血液的2xl06个细胞/参数(例如，各个细胞因子)。通过引入全血的红血细胞裂解来替代PBMC制备中的Ficol分离，及进一步的血液处理修饰如真空驱动的沉淀(96孔格式)来替代离心，可以减少样品体积并缩短测量时间。初步实验表明，杂交时间可以被降低到2小时(hr)而没有显著的信号损失。
可以用常规方法进行分析开发。例如，如实施例4中，来自三个供体组(活动性TB、LTBI和非感染的对照)的PBMC可以用装载有ESAT6和CFP10肽的基于HLA-A2和HLA-DR4的aAPC进行刺激。每个分析通过使用用于分析的4色FC，可以测试一组4个标记物对刺激的应答(基于表达性质一起分析)，标记物选自但不限于表1中所示的基因。这使得各个供体都能评估所有的靶。在最初测试中所选择的标记物可以与各个组中以相似水平表达的基因一块选入组中组合地进行重新测试。可以如实施例4所述进行统计分析。当需要时，也可以测量由常规APC刺激所诱导的靶的表达，以确定aAPC改善单个细胞中多种分析物的检测灵敏度的能力。此外，还可以通过荧光显微镜测试分析。可以如实施例5中所述进行统计分析。
实施例10所述的实验证实，用于检测T细胞中细胞因子mRNA表达的相同的方法(其被称为“FISH-Flow”)可成功地用于其它类型的细胞中，包括但不限于原代巨噬细胞。此外，实验证实，可以在不同的时间通过监控单个基因的表达在原代巨噬细胞中区分对不同刺激的应答。
示于图5中的结果表明，通过GFP阴性对照评估的背景表达维持恒定并可忽略不计(约是门控细胞的0.1-0.2％)。用脂多糖(LPS)和IFNγ的混合物或N-棕榈酰-S-[2,3-双(棕榈酰)-丙基]-(R)-半胱氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸(Pam3CSK4)的处理容易地诱导这些培养的巨噬细胞中的TNFα的表达至所有阳性细胞的6-42％的水平。TNFα转录物的稳健表达在活化的巨噬细胞中是预期的，并与IFNγmRNA的温和(低于2％)表达形成对照，其不受刺激的选择和/或刺激的长短影响，并从而可能在这些细胞中反映不同寻常的高背景而不是真实的表达谱。由LPS和IFNγ诱导的TNFαmRNA表达的动力学似乎与由Pam3CSK所诱导的不同，其中前者的刺激导致了mRNA水平的持续的长期升高。与此相比，同一mRNA用Pam3CSK4进行的刺激显著地缺少持久性。
实施例11证明了在受刺激的人T细胞中对细胞因子、趋化因子和趋化因子受体(其均是T细胞活化的标记物)的基因表达的时间分布(temporal profiles)的鉴定，将其与使用特异于所示的mRNA的FISH探针或使用识别它们的蛋白产物的mAb(图6B)所获得的流式细胞术结果(图6A)相比较。通过FISH-Flow获得的细胞因子生产者的频率(图6A)表明，在非刺激的细胞中IL-2、IFNγ、TNFα、CCL3、CCR7和cFos mRNA的表达可忽略不计(对照GFP、IL-2、IFNγ和CCR7)或非常低(TNFα、CCL3和cFos)，其发生在<1％的门控细胞中。出乎意料的是，这些mRNA的诱导表达似乎在刺激后2小时达到峰值，然后在1天和3天的时间点下降。这与利用常规mAb免疫染色和流式细胞术用相同的细胞所获得的平行数据(在存在1μg/ml的布雷菲德菌素A的情况下)形成对比。此处，非刺激的细胞清晰地显示出与阴性对照-同种型匹配的(Iso)mAb相比，至少一些标记物如IL-2、IFNγ和TNFα所检测的蛋白表达的基础水平(1-3％)。此外，所有的靶在2小时时诱导并在所检查的3天的时间段内保持升高。因此，用结合细胞因子的mAb时，没有检测到明显的时间分布。实施例11证实了动力学中的差异，其提供了优越的分布区分(FISH-Flow对比常规mAb染色和流式细胞术)，并且表明前一种方法为活化的检测提供了大大改善的灵敏度。
为了完全定义任何细胞类型的功能标签(即，执行特异化生物功能的能力)，知晓活化细胞与未活化(未应答)细胞中的所有其它mRNA的表达可能是重要的。实施例12中所报道的研究证实，FISH-Flow能标记在应答刺激时表达一个或多个靶的细胞，且此类应答物可以分离自整个细胞群，以用于探究它们的基因表达谱的目的。
经刺激的人T细胞与互补于特异于GFP的RNA的Cy5标记的DNA探针孵育并通过FC进行分析，作为对照，或与数个与IL-2、IFNγ、TNFα和CCL3mRNA反应的FISH探针组(表3)的混合物孵育，所有探针用Cy5单独标记。用GFP探针获得的结果示于图7A中。用探针混合物获得的结果示于图7B中。对淋巴细胞群进行门控之后(各图中的左侧)，保守的额外的门控用于将所分析的淋巴细胞分成两个不同的群体(各图中的右侧)，其从非表达细胞(IFN-)中区分出表达IFNγ的细胞(IFN+)。GFP探测的细胞的门控设置(图7A)定义了两个群体，在所有所分析的淋巴细胞中，0.1％的IFN+群体和71.2％的IFN-群体。用相同的门控，IL-2：IFNγ：TNFα：CCL3探测的细胞(图7B)是10.2％的IFN+和33.7％的IFN-。后面的FISH探测的细胞(图7B)通过荧光活化的细胞分选(FACS)被分成阳性和阴性群体，以在分离的活化的且非应答的细胞上进行基因表达分析。对分选的细胞群进行分析，以证明不同的基因表达谱与其与特异性FISH探针的反应性相一致。选择由两个基因IFNγ和“持家基因”GAPDH(对照)编码的mRNA的表达以例证本发明的此方面的实施方式。用特异于两个基因之一的引物对分选的细胞群进行RT-PCR。通过在扩增反应混合物中包含SYBR Green染料来对扩增产物进行定量测量。示于图8A中的结果证实，IFNγ特异性引物在用IL-2、IFNγ、TNFα和CCL3的探针鉴定的IFN+细胞中比在用这些探针最低限度标记的IFN-细胞中检测出更大丰度的靶。不随活化状态而改变的对照GAPDH信号的扩增预期在活化和非应答的细胞中是相似的。在活化细胞中用GAPDH特异性引物观察到的略微降低的扩增反映了这样的事实，即这一分选的群体明显较小，因此会提供较少的mRNA。
这些结果(通过尺寸分析证实，图8B)证实，可以在使用本发明的FISH-flow平台所鉴定的所需的细胞亚群中，通过应用本领域技术人员所熟知的用于分选并获得细胞亚群的方法和用于测量基因表达的方法如RT-PCR或转录组分析来进一步分析基因表达。能被鉴定和被研究的亚群可以包含一个细胞或多于一个细胞，包括但不限于10、100、1000、10,000、100,000或更多个细胞。
实施例
实施例1：诱导和探针组的示范
本实施例证明了用细胞的人工刺激产生RNA的用途(在本实施例为mRNA)以及用单独标记的荧光探针组杂交表达的RNA的用途。
对于此实施例，使用smFISH技术以将对应于结合到探针上的单个mRNA分子的斑点可视化。参见Raj等人，2010,Methods in Enzymology 472:365-386；和Raj等人，2008,Nature Methods 5:877-879。这些参考文献中描述了探针杂交条件和细胞洗涤条件。过程以一个重要的方式开始(depart)。为了在洗涤步骤中避免细胞的损失，在洗涤溶液中包含0.5％的胎牛血清。为TNFαmRNA(是分析活化的T细胞和巨噬细胞的关键靶)选择一组核酸探针(此处是DNA探针)，并测试受照射的结核分枝杆菌刺激的分化的THP-1细胞。还包括的是第二组DNA探针，其标记有不同颜色的荧光团并设计成结合ACSL1mRNA(一种脂质代谢基因)。后一基因还预期被刺激所诱导。特异于人TNFα的探针组包括48个探针，每个约20个核苷酸长且末端标记有四甲基罗丹明荧光团。特异于人ACSL1基因的探针组包括48个探针，每个约20个核苷酸长并标记有光学可区分的荧光团，即alexafluor 594。探针的序列列于本说明书结尾的序列表中(表3)。虽然各组中所列的探针适合于检测靶mRNA，也可使用如Raj等人，2010,Methods in Enzymology 472:365-386；和Raj等人,2008,Nature Methods 5:877-879中所述的选自靶RNA的不同区域的可替换的探针。如上所讨论，检测对应于细胞中两种mRNA的斑点。刺激后，TNFαRNA分子的数量平均从0.24％(每未诱导的细胞)增加至14(每细胞)。
实施例2.使用FC来检测表达基因的细胞。
在此实验中，进行分析以在表达慢病毒构建体的细胞培养物中检测HIV GAGmRNA。
简言之，用三种质粒转染293T细胞，其共同允许表达重组慢病毒构建体，并用特异于HIV mRNA(GenBank登录号#AY835771.1)的GAG区域的探针进行杂交。探针的序列列于本说明书的结尾(表3)。根据Raj等人，2010,Methods in Enzymology 472:365-386和Raj等人，2008,Nature Methods 5:877-879(以其整体并入本文作为参考)中所述的步骤，杂交探针并将细胞洗涤。再一次地，为了避免在洗涤步骤中的细胞损失，在洗涤溶液中包含0.5％的胎牛血清。然后，进行FC以检测表达构建体的细胞。基于未转染的细胞的荧光建立门控。在转染的细胞中，如由信号所示的，约25％的表达构建体的细胞比通过门控设置的水平具有更大的强度。FC结果示于图1中，其显示了荧光强度(“a.u.”)与前向散射(“FSC-A”)的两个图。在左侧(慢病毒-)的图示出了未转染的细胞。在右侧(慢病毒+)的图示出了转染三种来自慢病毒包装系统的质粒的细胞。
实施例3.检测由M-TB衍生肽刺激的细胞因子基因表达。
PBMC获得自未感染的、无症状的隐性感染(LTBI)和活性TB供体。根据制造商的说明，通过添加T-SPOT.TB IFNγ释放分析(IGRA)(Oxford Immunotec,Marlborough,MA)中使用的肽混合物活化T细胞，该混合物衍生自免疫显性的分枝杆菌Ag Rv3875(ESAT6)和Rv3874(CFP10)。在不同的时间(4至120h)，将经刺激的细胞固定并透性化，然后用一种或多种如下所述的探针组进行杂交。通过使用可用的滤镜组，利用FC分析细胞以测定单独地和组合地表达靶的细胞的频率，其中滤镜组区分了用于标记探针的荧光团。
TNFα的探针组是实施例1中所指定的探针组。制备另外两个探针组，一个是IL-2的探针组，一个是IFNγ的探针组，其各自具有50个探针(Ensembl序列ID分别是ENST00000226730和ENST00000229135)。所有三组中的探针都是线性的(无规卷曲)寡核苷酸，15-25个核苷酸长，标记有单个荧光团。用于三组的三种荧光团是光学可区分的。这三种细胞因子基因是已知的区分T细胞亚型的T细胞活化和增殖的标记物。靶转录物是足够长的，以允许对每个靶使用至少50个探针。
为了利用FC检测细胞的一小部分(<0.01％)中的标记物表达，收集lx106个事件的结果。为了测定供体组之间差异的统计显著性，通过ROC曲线分析确定用于从应答细胞中分离非应答细胞的阈值(参见，例如Zweig等人，7993,Clinical Chemistry 39(8):561-577和Pepe,2003,The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction.NewYork,NY:Oxford)，并测定阳性细胞的频率。混合模型ANOVA可用于分析数据。在分析之前，将数据进行变换(如对数变换)。在简单的变换不足以解决ANOVA假设的情况下，则使用统计方法的非参数类似物。
在活化细胞中发现了所有三个标记物的可检测的表达频率。表达不同组合的标记物的细胞的频率是疾病的标签。
实施例4.结核分枝杆菌-特异性效应物T细胞的分析。
此实施例描述了检测结核分枝杆菌-特异性效应物T细胞的分析。
a.检测CD8+T效应物。TB患者通过用等位基因特异性mAb BB7.2和0222免疫染色的PBMC的FC检测或通过PCR确认进行HLA分型。基于HLA-A*0201的aAPC装载已知的衍生自Rvl886c、Rv3874和Rv3875的个体的HLA-A*0201表位(肽)。
这些肽衍生自结核分枝杆菌的免疫显性的Ag。PBMC分离自HLA-A2型TB患者并用Ag装载的、基于A2的aAPC以1：1的比例在标准培养条件下进行刺激。或者，分离的PBMC与添加的经内源性APC刺激的T细胞的肽孵育。在从4至120h的不同的时间，将细胞固定并透性化，并与IL-2、IFNγ和TNFα的特异性探针孵育。阴性对照包括来自健康的、未感染的(IGRA阴性)供体的用如上所述的Ag装载的aAPC刺激的PBMC和来自阳性供体的用装载有不相关的黑素瘤特异性Mart 1肽(26-35表位)和分化Ag gp100肽(44-59表位)的aAPC刺激的PBMC。阳性对照包括用抗-CD3mAb+PHA非特异性刺激的PBMC。
b.检测CD4+T效应物。通过使用如上所述的用于装配基于HLA-A*0201的aAPC的方法构建基于第一HLA-DRB 1*04的aAPC。这一方法的主要方面是表达可溶形式的HLA-DR4分子，其需要在生物合成期间II类a和b多肽的配对。为了促进MHC II类分子的可溶性类似物的亚基配对，使用IgG分子作为分子骨架：其是二价的且可以很容易地进行修饰以适应范围广泛的蛋白质结构域。将修饰的a和b链克隆于双启动子的杆状病毒表达载体中。受此载体感染的细胞分泌约0.5-2.0mg/ml的可溶性HLA-DR4-Ig样物质。为了使用通用的克隆载体pZig装配可溶性MHC II类HLA-DR4-Ig复合物，通过使用内切酶限制性位点将编码DR4蛋白的α和β链的II类细胞外结构域的DNA连接至编码Ig重链和轻链的DNA上；并将嵌合体依次连接至修饰的pAcUW51载体上。用与HLA-DR4特异性mAb 0222HA(One Lambda)并利用生化分析(SDS-PAGE和Western印迹)来确认分泌蛋白的产率、纯度和完整性。将纯化的可溶性HLA-DR4-Ig蛋白和抗-CD28mAb以1：1的比例缀合至磁珠(M-450Epoxy Dynabeads,Dynal Invitrogen)上。
将已知的来自于Rvl886c、Rv3874和Rv3875并受限于HLA-DRB 1*04等位基因(表1)的肽装载于基于HLA-DR4的aAPC上并用于刺激来自非感染的、LTBI和活性TB供体的PBMC。或者，将分离的PBMC与添加的用于通过内源性APC进行T细胞刺激的肽就行孵育。在4至72h的不同时间的刺激之后，探测细胞的IL-2、IFNγ和TNFαmRNA并通过FC进行分析。阴性和阳性对照如上对CD8+T细胞的描述所述。
将实施例3中所述的统计分析方法应用于这些结果。本实施例中的多重刺激方法也需要混合模型的ANOVA以进行比较。
上述测试能基于用等位基因特异性HLA I类-或II类-限制的肽进行的刺激来检测TB患者血液中的CD4+和CD8+效应物T细胞。识别Rvl886c、Rv3874和Rv3875Ag并能产生至少单个细胞因子IFNγ或TNFα的活化的效应物T细胞是易于检测的。两种细胞因子(IL-2+IFNγ+和IL-2+TNFα+)的共同产生在最终分化的T细胞(其是患有活性TB的患者的血液中主要的效应物)中不频繁。
实施例5.由感染阶段特异性Ag引起的单个T细胞的细胞因子谱。
在不同时间(4至120h)用装载了来自Rvl886c(活性TB阶段)和Rvl986、Rv2659c和Rv3407(LTBI阶段)的肽混合物的基于HLA-A2和HLA-DR4的aAPC刺激来自活性TB、LTBI和非感染供体的PBMC。或者，将分离的PBMC与添加的用于通过内源性APC进行T细胞刺激的肽孵育。读出(read-out)为使用三组的约50个单独标记的荧光探针的IL-2、IFNγ和TNFα的表达和表达细胞的数量的FC检测。为了鉴定能区分疾病状态的Ag候选物，使用单向ANOVA并将宽的p值(p＝0.25)作为取舍点。使用所选择的Ag并采用逻辑回归如多歧或累积逻辑回归的归纳(generalization)来开发区分供体组的应答模型。
用Rvl886c刺激产生了特征性的感染阶段相关的T细胞细胞因子谱：TB患者具有单、双和三生产者(producer)以及LTBI患者具有大部分的IL-2生产者。
实施例6.鉴定单个T细胞中与感染阶段相关的功能效应物和记忆标签。
由TCR活化可诱导的功能标记物可通过本发明的方法来进行测定，以准确地描述主要的功能T细胞亚群。对于此分析而言，选择在TCR结合后4-6小时内可诱导的候选标记物和/或反映成熟阶段和已知的T细胞亚群的功能的基因。所获得的在效应细胞、效应记忆细胞和中央记忆T细胞中表达的活化和功能性标记物的结果(表2)满足这些方面的考虑。表2中的数据自Zinkernagel RM.T cell activation.In:Mak TW,Saunders ME,editors.New York:Elsevier；2006.p.373-401和Doherty P.T cell differentiation and effector function.In:Mak TW,Saunders ME,editors.New York:Elsevier；2006.p.403-432及其参考文献搜集而来。
使用装载有肽(如实施例3或4)的aAPC以提供经TCR的刺激以及经CD28的共刺激，或与用于经内源性APC进行刺激的肽组合的抗-CD28mAb(如实施例3或4)，可快速增加关键趋化因子和细胞因子(包括但不限于MIP-Iα、IFNγ和TNFα)和其它共刺激分子(包括但不限于CD40L，CD 137)的表达，其反过来进一步增加了反应性。正反馈增强了用于检测的时间范围内的应答并增加了多参数分析的FC结果的灵敏度。选择所选标记物的组合，以能可重复的鉴定和表征个体效应细胞和记忆细胞以及其在供体组的外周血中的定量分析。使用四色FC，以使所鉴定的标签适合于使用常归用于临床环境的仪器的分析。
在获得自经ESAT6和CFP10肽的商业混合物和基于HLA-A2或HLA-DR4的aAPC刺激的PBMC的数据中发现了高度的供体可重复性。与基于内源性APC的常规IGRA相比，用此肽的混合物所获得的数据是非常准确的。通过aAPC提供的稳健的刺激延伸到多个靶(如上所述的标准细胞因子的靶)的诱导。相比于常规的APC刺激的情况而言，以更高的频率检测出表达多种标记物的细胞。本实施例的方法允许鉴定作为不同的存在于感染(此处是TB感染)的不同阶段的T细胞的标签的标记物组。
实施例7.在经刺激的PBMC中同时检测两种细胞因子mRNA
此实施例表明，能够检测非常小群体的荧光细胞。简言之，将CFSE标记的PMBC连续稀释至MITOTRACKER(Invitrogen)标记的PBMC中。发现此分析能够以0.0013％的频率检测前者，这证明了其具有足够的灵敏度。
为了证明IL-2、IFNγ和TNFαmRNA的检测，经TCR用抗-CD3mAb和已知诱导这些细胞中的各种细胞因子表达的PHA非特异性地刺激PBMC。刺激之后，将细胞固定并用针对IL-2和IFNγ、IL-2和TNFα以及IFNγ和TNFα的成对组合的探针组探测。每对中的一个探针组用Cy5荧光团标记，另一个用TMR荧光团标记。具体地，用抗-CD3mAb OKT3和PHA(两者均为1mg/ml)刺激PBMC5天，然后用4％的多聚甲醛和70％的乙醇固定。通过用特异于IL-2和IFNγ的Cy5-或TMR-标记的RNA探针孵育来标记固定并洗涤的细胞，再次洗涤并通过双色FC(LSRII，Becton Dickinson)进行分析。结果示于图2。图2中的四个斑点是：从左至右，未染色/空杂交的对照；单个细胞因子IFNγ-Cy5-标记的细胞；单个细胞因子IFNγ-TMR-标记的细胞；以及双细胞因子(IL-2、Cy5标记的和IFNγ、TMR-标记的)-标记的细胞。门控显示了表达一种或两种细胞因子的细胞群及其频率。
实施例8.检测离体刺激的结核分枝杆菌特异性细胞中的细胞因子mRNA
在此实施例中，根据本发明的方法用于检测离体刺激的结核分枝杆菌特异性细胞。循环中的结核分枝杆菌特异性细胞通常以低频率存在于具有潜伏的TB感染(LTBI)的患者中。获得来自LTBI供体的血液，并用来自结核分枝杆菌Ag ESAT6和CFP10(通常用于T-SPOT.TB试验)的肽的混合物刺激5小时。将PBMC在仅有培养基中或具有5μg/ml的ESAT6-和CFP10-衍生肽(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec,英国)的混合物的培养基中孵育5h。将固定且洗涤的细胞与互补于特异于GFP(作为阴性对照)或IL-2和TNFα的RNA的Cy5标记的DNA探针孵育，然后通过FC进行分析。细胞因子生产者的频率示于图3，其中三个较高的斑点是孵育于仅有培养基的PBMC，三个较低的斑点是孵育在包含Ag混合物的培养基中的PBMC。
实施例9.LTBI供体的共刺激PBMC中的IFNγ检测。
将PBMC与5μg/ml的具有或不具有抗-CD28mAb 53D10的ESAT6-和CFP10-衍生肽(T-SPOT.TB,Oxford Immunotec,英国)的混合物孵育5h。将固定且洗涤的细胞与特异于GFP mRNA(GFP，阴性对照)(GFP序列参考pTREd2EGFP(Invitrogen))或IFNγmRNA的Cy5-标记的DNA探针孵育，然后通过FC进行分析。细胞因子生产者的频率示于图4中。对照GFP的非特异性染色不受CD28共刺激的影响。
实施例10.活化的巨噬细胞中的细胞因子诱导。
此实施例说明了非T细胞的人工刺激的使用，在这种情况下，是在标准条件(补充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基)下通过附着到塑料上并培养2周以从外周血中获得的人类巨噬细胞。
简言之，用脂多糖(LPS)(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)的混合物或N-棕榈酰-S-[2,3-双(棕榈酰)-丙基]-(R)-半胱氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸(Pam3CSK4)(N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-propyl]-(R)-cysteinyl-(lysyl)3-lysine)(100ng/ml)进行活化4小时或1天。在含0.2-0.3％EDTA的PBS中，将经刺激的原代巨噬细胞从塑料上去除，如实施例7所述，进行固定和透性化，然后与特异于IFNγ和TNFαmRNA的FISH探针(表3)孵育并通过流式细胞术进行分析。如在实施例8中，将固定且洗涤的细胞与互补于特异于GFP的RNA的Cy5标记的DNA探针(表3)孵育并通过FC进行分析，作为阴性对照。用探针并利用FISH-flow分析所检测的细胞频率(如上所述，如在实施例2中)示于图5中，其中，顶行是GFP探针的结果，中间行是IFNγ探针的结果，底行是TNFα探针的结果。每一行中的第一列是用LPS和IFNγ刺激4小时，第二列是用LPS和IFNγ刺激1天，第三列是用Pam3CSK4刺激4小时，第四列是用Pam3CSK4刺激1天。
实施例11.活化的T细胞中的细胞因子和活化标记物的表达动力学。
此实施例证明鉴定了细胞因子、趋化因子和趋化因子受体的基因表达的时间分布，其是T细胞活化的标记物，其应答用来自Ficoll梯度上的外周血获得的人类T细胞的PMA(25ng/ml)和离子霉素(350ng/ml)的刺激。更具体地，在刺激的各个时期(2小时、1天、3天)之后，如实施例7中所述，将细胞固定并透性化，然后与特异于所示的mRNA的FISH探针(表3)孵育或与识别其蛋白产物的mAb孵育，然后进行流式细胞分析。如上所述，如在实施例2中，利用FISH-flow分析并用探针所检测的细胞的频率示于图6A，其中顶行是无刺激的结果，随后的行分别是刺激2小时、1天和3天之后的结果。各行中的第一列是使用GFP探针的结果；第二列是使用IL-2探针的结果；第三列是使用IFNγ探针的结果；第四列是使用TNFα探头的结果；第五列是使用CCL3探针的结果；第六列是使用CCR7探针的结果，最后一列是使用cFos探针的结果。顶行是对于GFP探针，中间行是对于IFNγ探针，底行是对于TNFα探针。利用FC并用mAb所检测的细胞的频率示于图6B中，其中顶行是无刺激的结果，随后的行分别是刺激2小时、1天和3天之后的结果。各行中的第一列是使用阴性对照-同种型匹配的(Iso)mAb的结果；第二列是使用识别IL-2的mAb的结果；第三列是使用识别IFNγ的mAb的结果；第四列是使用识别TNFα的mAb的结果。
实施例12.将活化的FISH探测的T细胞分离成表达细胞因子的群体和不表达的群体并分析。
此实施例证明，如上所述的FISH-flow能标记表达一种或多种应答刺激的靶的细胞，并且此类应答物能从整个细胞群体中分离出来，以用于探究它们的基因表达谱。
第一部分：分离成群体
将获得自Ficoll梯度上的外周血并且用PMA(25ng/ml)和离子霉素(350ng/ml)全局刺激2小时的人类T细胞，与互补于特异于GFP的RNA的Cy5标记的DNA探针孵育并通过FC进行分析(作为对照)，或者与对IL-2、IFNγ、TNFα和CCL3mRNA有反应的数个FISH探针组(表3)的混合物孵育(所有探针用Cy5单独标记)。如上所述，如在实施例2中，利用FISH-flow分析并用探针所检测的细胞的频率示于图7A和图7B中。用GFP探针所获得的结果示于图7A中。用探针混合物所获得的结果示于图7B中。在基于FSC和SSC(各图中的左侧)门控淋巴细胞群体之后，应用保守的额外的门控以将所分析的淋巴细胞分离成两个不同的群体(各图中的右侧)-细胞因子阳性(表示为IFN+)和阴性(表示为IFN-)。GFP探测的细胞的门控设置(图7A)将所有所分析的淋巴细胞定义为两个群体，0.1％的IFN+和71.2％的IFN-。相同的门控下，IL-2：IFNγ：TNFα：CCL3探测的(图7B)群体是10.2％的IFN+和33.7％的IFN-。将后面的FISH探测的细胞(图7B)利用FACS分成阳性和阴性群体，以在如下所述的分离的表达细胞因子的细胞和不表达细胞因子的细胞中进行基因表达分析。这种方法也成功用于仅用IFNγ特异性FISH探针标记的经刺激的T细胞，将其进行区分并分成IFN+和IFN-亚群。
第二部分：FISH探测的并分成活化的和非应答T细胞群的细胞因子基因表达分析。
如第一部分所述，将制备并分成不同群体的活化的和非应答T细胞进行分析，以证明不同的基因表达谱与它们与特异的FISH探针的反应性相一致。选择两个基因IFNγ和“持家基因”GAPDH(对照)所编码的mRNA的表达以例证此目的的可行性。根据供应商所述的方案，将通过标准方法分离自所分选的细胞群体的RNA使用QIAGEN OneStepRT-PCR试剂盒并使用特异于两个基因之一的引物进行RT-PCR(逆转录，再将所得到的cDNA通过聚合酶链式反应进行扩增)。用于扩增反应的引物序列如下：
IFNγ正向引物：5'GAGCACCAAAAGAGTGTGGAG(SEQ ID NO：36)
IFNγ反向引物：5'TTCATGTATTGCTTTGCGTTGG(SEQ ID NO：37)
GAPDH正向引物：5'CCAATATGATTCCACCCATGGC(SEQ ID NO：38)
GAPDH反向引物：5'TCCTGGAAGATGGTGATGGGAT(SEQ ID NO：39)
在RT孵育并于94℃初始变性15分钟之后，热循环步骤是：于94℃0.5分钟，于55℃0.5分钟，于72℃1分钟，进行40个循环。利用SYBR Green染料检测扩增产物。扩增反应的阈值循环示于图8A中。为了验证扩增结果并排除假象的可能性，利用凝胶电泳并用IFNγ特异性和GAPDH特异性引物来验证所鉴定的扩增子的大小。结果示于图8B。
表3.探针序列
上述实施例和优选实施方式的描述应被视为示例性的，而不是为限制由权利要求所限定的本发明。
容易理解的是，可以利用如前所述的各种变化和特征的组合而不脱离如权利要求中所述的本发明的范围。这样的变化不被视为脱离本发明的范围，并且所有的这样的变化都包括在权利要求的范围之内。本文所引用的所有的参考文献均以其整体并入本文。

Claims (38)

1.一种检测至少一种表达于单个细胞中的RNA分子的拷贝的方法，其包括：
(a)提供包含细胞群的样品，其中细胞表达能够通过结合它们的配体或刺激分子来起始导致基因表达的信号级联的特异性受体；
(b)通过将细胞与至少一种结合特异性受体并启动基因表达的化合物孵育，在离体细胞中立即或培养后诱导基因表达；
(c)固定细胞并将细胞透性化；
(d)用一组荧光标记的寡核苷酸杂交探针标记至少一种由细胞表达的RNA分子的拷贝，并洗涤掉未结合的探针；和
(e)利用流式细胞术(FC)检测具有表达事件的细胞，表达事件是通过荧光强度门控分类的一种或多种荧光测量。
2.如权利要求1所述的方法，其中诱导步骤包括利用存在于细胞群的抗原呈递细胞(APC)或利用人工APC(aAPC)刺激T细胞受体(TCR)信号和下游基因表达。
3.如权利要求2所述的方法，其中经APC或aAPC诱导的刺激进行30分钟至6小时。
4.如权利要求2所述的方法，其中诱导步骤包括与至少一种单克隆抗体(mAb)共刺激。
5.如权利要求2所述的方法，其中诱导步骤包括与至少一种结合aAPC的单克隆抗体(mAb)共刺激。
6.如权利要求1所述的方法。其中化合物源自微生物。
7.如权利要求1所述的方法，其中化合物包括肽或肽的混合物。
8.如权利要求2所述的方法，其中将与MHC I类或MHC II类分子相关的肽或肽的混合物添加到APC或aAPC。
9.如权利要求8所述的方法，其中肽或肽的混合物以1-20μg/ml之间的浓度存在。
10.如权利要求1所述的方法，其中至少一种RNA分子由细胞因子基因编码。
11.如权利要求10所述的方法，其中基因编码IL-2、TNFα或IFNγ。
12.如权利要求1所述的方法，其中刺激分子是结核分枝杆菌衍生的免疫原性肽。
13.如权利要求1所述的方法，其中探针组包括20-60个探针，其每个均用相同的荧光部分单独标记。
14.如权利要求1所述的方法，其中细胞群是获得自人类PBMC的T细胞，至少一种RNA分子由细胞因子基因编码，细胞群中的细胞利用aAPC并用一种或多种与TCR相互作用的装载肽的MHC分子诱导，并且探针组包括20-60个探针，其每个均用相同的荧光部分单独标记。
15.如权利要求1所述的方法，其中具有表达事件的所检测的细胞与不具有表达事件的细胞相分离。
16.如权利要求15所述的方法，其中分离的细胞仅包括一个细胞。
17.如权利要求15所述的方法，其中分离的细胞包括多于一个细胞。
18.如权利要求15所述的方法，其中利用荧光活化的细胞分选进行分离。
19.如权利要求15所述的方法，其中测量分离的细胞中的基因表达。
20.如权利要求19所述的方法，其中基因表达的测量利用RT-PCR或细胞中RNA的转录组分析来实现。
21.如权利要求1所述的方法，其中诱导步骤包括用微生物产物或合成化合物刺激toll样受体信号和下游基因表达。
22.如权利要求21所述的方法，其中微生物产物是脂质、聚糖、糖脂、硫脂、糖蛋白、蛋白质、肽或核酸。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中刺激进行30分钟至6小时。
24.如权利要求2、21或22所述的方法，其中刺激进行6小时至24小时。
25.如权利要求2、21或22所述的方法，其中刺激进行24小时至72小时。
26.如权利要求21或22所述的方法，其中刺激物以1-100ng/ml之间的浓度存在。
27.如权利要求21或22所述的方法，其中刺激物以100-1000ng/ml之间的浓度存在。
28.如权利要求21或22所述的方法，其中刺激物以1-20μg/ml之间的浓度存在。
29.如权利要求1所述的方法，其中化合物是细胞因子。
30.如权利要求29所述的方法，其中细胞因子选自IFNγ、IL-2、IL-15和TNFα。
31.如权利要求29所述的方法，其中细胞因子是IFNγ、IL-2、IL-15或TNFα之外的细胞因子。
32.如权利要求1或21所述的方法，其中提供多于一个的化合物或刺激物。
33.如权利要求32所述的方法，其中在不同的时间提供不同的刺激物。
34.如权利要求22所述的方法，其中核酸是RNA或DNA。
35.一种检测至少一种表达于单个细胞中的RNA分子的拷贝的方法，其包括：
(a)提供包含细胞群的样品，其中细胞表达能够通过结合它们的配体或刺激分子来起始导致基因表达的信号级联的特异性受体；
(b)固定细胞并将细胞透性化；
(c)用一组荧光标记的寡核苷酸杂交探针标记至少一种由细胞表达的RNA分子的拷贝，并洗涤掉未结合的探针；和
(d)利用流式细胞术检测具有表达事件的细胞，表达事件是通过荧光强度门控进行分类的一种或多种荧光测量。
36.如权利要求1或35所述的方法，其中受体选自toll样受体、NOD和NOD样受体、G蛋白偶联受体、多肽激素受体、细胞因子受体、B细胞受体和T细胞受体。
37.如权利要求36所述的方法，其中G蛋白偶联受体是趋化因子受体。
38.如权利要求1或35所述的方法，其中群体包括选自PBMC、T细胞、淋巴细胞、CD3+CD4+T细胞(T辅助细胞1或Th1细胞)、CD3+CD4+T细胞(T辅助细胞2或Th2细胞)、CD3+CD8+T细胞、Th17、Treg细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突细胞、包括各种身体器官的内皮和上皮的细胞和神经系统细胞的细胞。
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