WO2021137472A1 - 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법 - Google Patents

당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법 Download PDF

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reaction
glycated
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이진우
전선아
전상연
이도연
국정근
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Definitions

  • the present invention relates to a reagent kit for measuring glycated albumin and a method for measuring the glycated albumin ratio using the same, and more particularly, to a reagent kit for measuring glycated albumin, one of the diagnostic indicators of diabetes, and a method for measuring the glycated albumin ratio using the same.
  • Diabetes mellitus is a metabolic disease caused by an abnormality in insulin, which plays a role in regulating blood sugar.
  • Type 1 diabetes which occurs when cells that produce insulin are destroyed due to abnormalities in the immune system, and insulin secretion is insufficient or not used effectively. It is classified according to the cause, such as type 2 diabetes.
  • Diabetes mellitus is characterized by high blood sugar in which the concentration of glucose in the blood rises. Failure to control blood sugar can lead to complications such as diabetic retinopathy, kidney disease, and foot lesions, so the importance of blood sugar management in diabetic patients is increasing. .
  • glucose is used as a conventional diabetes measurement marker, there is a problem in that an error according to measurement time and fluctuation according to a patient's condition may appear directly because the blood glucose value before and after a meal fluctuates greatly.
  • glucose oxidase used for glucose measurement is vulnerable to environmental influences such as pH and other interfering substances contained in the blood, and may affect the activity of the enzyme by generating hydrogen peroxide.
  • glycated hemoglobin (HbA1c) has been used as a biomarker for measuring blood glucose that can be measured more accurately than glucose and is more stable. Since glycated hemoglobin is stable until red blood cells are destroyed, it is used as an index indicating the average blood sugar level of 2 to 3 months, so it is used to investigate the progress of diagnosis and treatment of diabetes.
  • the glycosylated hemoglobin measurement method is not suitable for patients with some diseases such as end-stage chronic renal failure, where blood sugar cannot be maintained steadily, or for patients with abnormal red blood cells.
  • Albumin is a protein that exists not only in blood but also in major organs and body fluids. Depending on the concentration of glucose in the blood, glycosylated albumin is sometimes formed. Since albumin has a glucose binding rate 10 times higher than that of hemoglobin, glycated albumin responds more sensitively to changes in blood sugar than glycated hemoglobin, and albumin has a short lifespan of 15 to 20 days compared to 90 days of erythrocytes. The average blood glucose level can be monitored. Therefore, it is useful as an important blood glucose control index in patients with end-stage chronic renal failure, iron deficiency anemia, and diabetic patients with mutant hemoglobin.
  • U.S. Patent No. 7871789, U.S. Patent No. 6008006, U.S. Patent No. 8507223, Chinese Patent Laid-Open No. 104673878, and Chinese Patent Laid-Open No. 104614459 relate to a conventional method for measuring glycated albumin, which is present in a sample.
  • Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) produced by the enzyme reaction of the glycosylated amino acid oxidase (EC 1.5.3) series that reacts specifically with glycosylated amino acids or glycated peptides using proteolytic enzymes
  • EC 1.5.3 glycosylated amino acid oxidase
  • the glycosylated albumin enzymatic method has high selectivity and accuracy for albumin, as well as a faster time (10 to 30 minutes) than the immunological method, but the activity of the enzyme greatly affects the efficiency of the glycosylated albumin analysis method due to the nature of the enzyme protein. Strict attention to maintenance and storage is required.
  • glycosylated albumin enzyme method a step to remove the glycated amino acids and glycated peptides already present in the sample must be preceded, and the glycosylated amino acid oxidase (EC 1.5.3) cannot use the intact glycated protein as a substrate, so it must be a proteolytic enzyme It is a complex measurement method consisting of multiple steps, such as the step of decomposing glycated proteins into glycated amino acids or peptides using Therefore, it is necessary to develop a method capable of measuring glycated albumin more simply and quickly.
  • U.S. Patent No. 5223392, U.S. Patent No. 5908925, European Patent Application Publication No. 0657470, European Patent No. 0257421, and Chinese Patent Publication No. 103554256 are albumin antibodies and peroxidase enzymes to detect glycosylated albumin.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • ELIBA enzyme-boronic acid immunoassay
  • U.S. Patent No. 9128085, U.S. Patent Publication No. 2006-0270060, U.S. Patent Publication No. 2008-0227210, U.S. Patent Publication No. 2010-0167306, U.S. Patent No. 5470759 as a POC (Point of Care) or Rapid Kit And U.S. Patent No. 7659107 discloses a method using disposable strips and cassettes using antibody-based lateral flow immunochromatography to measure albumin and glycated albumin in samples such as blood and saliva. Patent No.
  • 2014-0170766 discloses a manufacturing method of a rapid kit to which lateral flow immunochromatography is applied using an albumin aptamer derived from a nucleic acid and a glycosylated albumin aptamer having an antibody-like action.
  • Patent No. 2014-0335630 discloses a measurement method using a glycosylated albumin aptamer and surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the aptamer composed of an antibody or nucleic acid also needs attention in maintenance and storage like the antibody.
  • glycated albumin using bromocresol green or bromocresol purple that specifically binds to total albumin and "silica nanoparticles encapsulating dye-boronic acid" that specifically binds to glycated albumin Measurements were initiated.
  • This method is a method of calculating the glycated albumin ratio by measuring total albumin and glycated albumin, respectively. Since the acidic albumin measuring reagent and the alkaline glycated albumin reagent are incompatible with each other, the measuring sample must be measured in each reagent, and the measuring reagent and cartridge must all be independently configured. Therefore, there is a need for a method capable of quickly measuring glycated albumin in a simpler way than this.
  • the present inventors have made efforts to solve the above problems, and as a result, (a) albumin pretreatment and reaction reagents; (b) a glycosylated albumin reaction reagent; and (c) when using a protein precipitating agent, it was confirmed that the glycated albumin ratio can be measured simply and accurately with an optical instrument through the series of reagent reactions with the administration of a single measurement sample, thereby completing the present invention.
  • the present invention is capable of measuring the glycosylated albumin ratio by administering a single measurement sample comprising (a) albumin pretreatment and reaction reagent, (b) glycated albumin reaction reagent and (c) protein precipitating agent.
  • a reagent kit for measuring glycated albumin is provided.
  • the albumin pretreatment and reaction reagent is (a) dithiothreitol (DTT), guanidine (guanidine), hydroxylamine (Hydroxylamine), 2-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol), sodium cia Noborohydride (sodium cyanoborohydride), tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) and tris (hydroxypropyl) phosphine (tris (hydroxypropyl) phosphine), urea (urea) Albumin pretreatment reagent and (b) tartrazine, ethacridine lactate, methyl orange and methyl red for modifying the protein structure selected from the group consisting of It is characterized in that it contains an albumin reaction reagent selected from the group.
  • DTT dithiothreitol
  • guanidine guanidine
  • hydroxylamine Hydroxylamine
  • 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
  • the protein precipitating agent is ammonium sulfate, caprylic acid, dimethyldioctadecylammonium chloride (DODMAC), trioctylmethylammonium chloride (TOMAC), polyethylene glycol It is characterized in that at least one selected from the group consisting of (PEG) and zinc sulfate.
  • the glycated albumin reaction reagent is a dye-conjugated boronic acid.
  • the dye is characterized in that it is a complementary dye or a fluorescent dye that is distinguished from the albumin measuring reagent, and includes Xylene cyanol FF (Xylene cyanol FF), Methylene blue, Fast Green FCF (Fast Green). FCF), FITC, rhodamine red, Texas red (Texas Red), cyanine 5 (Cyanine 5), body P (Bodipy) and characterized in that selected from the group consisting of quantum dots.
  • the present invention also comprises the steps of (a) reacting albumin pretreatment and reaction reagent with serum or plasma; (b) reacting the reaction product of the albumin pretreatment and reaction reagent into the saccharified albumin reaction reagent; (c) reacting the reaction product of the glycated albumin reaction reagent into a protein precipitant; (d) administering the reactant with the protein precipitating agent to the measuring pad of the cartridge and then washing with a washing solution; and (e) measuring the optical reflectivity of the measuring pad with an optical instrument to calculate the glycosylated albumin ratio.
  • the measuring pad is selected from the group consisting of a membrane made of glass fiber, cellulose, and polyester sulfone, and the absorbent pad is made of cellulose fiber, glass It is characterized in that it is selected from the group consisting of fiber (glass fiber) and polyurethane (polyurethane).
  • the membrane pore size of the measuring pad is characterized in that 0.1 ⁇ m ⁇ 1 ⁇ m.
  • the optical device measures the optical reflectance by simultaneously irradiating a plurality of light sources capable of measuring the wavelength of the dye reagent representing the total amount of albumin and the wavelength of the glycated albumin reaction reagent representing the amount of glycated albumin characterized in that
  • the glycated albumin ratio measurement method using the reagent kit for measuring glycated albumin according to the present invention can determine the glycated albumin ratio by simultaneously measuring a plurality of light sources. It has the advantage of being able to measure
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method for measuring a glycosylated albumin ratio using the reagent kit and optical instrument for measuring glycated albumin of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing reflectance values measured according to the amount of albumin using an albumin pretreatment and measurement reagent and an optical device according to an embodiment of the present invention.
  • 3 to 5 show a comparison of reflectance values according to the ratio of glycated albumin of a measurement sample using a reagent kit and an optical device for measuring glycated albumin according to the presence or absence of a protein denaturant in the albumin pretreatment and reaction reagent according to an embodiment of the present invention. It is a graph.
  • albumin pretreatment and reaction reagent (a) albumin pretreatment and reaction reagent; (b) a glycosylated albumin reaction reagent; and (c) when using a protein precipitating agent, it was attempted to confirm that the glycated albumin ratio can be measured simply and accurately with an optical instrument.
  • a plasma or serum sample containing albumin and glycated albumin was added to the albumin pretreatment and reaction reagent and reacted, which was reacted with the glycated albumin reaction reagent, and then reacted with a protein precipitating agent.
  • the ratio of glycated albumin can be calculated by administering the reaction solution to the measurement pad, washing the unreacted reagents and reagents bound to impurities, and then measuring the optical reflectivity of the measurement pad with an optical instrument.
  • the albumin pretreatment reagent, guanidine is put in a plasma sample for reaction, and after reaction with xylene cyanol-DAPOL-CPBA, a glycosylated albumin reaction reagent, trioctylmethylammonium chloride, a protein precipitating agent, trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), administering to the measuring pad, washing, irradiating the measuring pad with red and blue light sources with an optical instrument to measure each optical reflectance, and based on the ratio, simply specify the ratio of glycated albumin I was able to confirm that it could be done.
  • the present invention provides a glycosylation capable of measuring the glycated albumin ratio by administering a single measurement sample comprising (a) albumin pretreatment and reaction reagent, (b) glycated albumin reaction reagent, and (c) protein precipitation agent. It relates to a reagent kit for the measurement of albumin.
  • the albumin pretreatment and reaction reagent is for facilitating the reaction between the glycosylated albumin and the glycosylated albumin reaction reagent, and includes an albumin pretreatment reagent and an albumin reaction reagent.
  • the albumin pretreatment reagent can be used without particular limitation as long as it can play a role in modifying the protein structure, dithiothreitol (DTT), guanidine, hydroxylamine (Hydroxylamine), 2-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol), sodium cyanoborohydride, tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), tris (hydroxypropyl) phosphine (tris (hydroxypropyl) ) phosphine), urea, and the like may be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the albumin reaction reagent is combined with albumin, and can be used without any particular limitation as long as it can be measured optically, and tartrazine, ethacridine lactate, methyl orange, methyl red (Tartrazine), ethacridine lactate (Ethacridine lactate), methyl orange (Methyl orange) Methyl red) and the like may be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the albumin pretreatment reagent varies depending on the type, but it is preferably treated at a concentration of 1 mM to 50 mM, and the albumin reaction reagent is preferably treated at a concentration of 0.1 mM to 10 mM.
  • the glycated albumin reaction reagent is for the selective detection of glycated albumin, and a dye-conjugated boronic acid may be used.
  • the dye is characterized in that it is a complementary dye or a fluorescent dye that is distinguished from the albumin measuring reagent, and includes Xylene cyanol FF (Xylene cyanol FF), Methylene blue, Fast Green FCF (Fast Green FCF), FITC, Rhodamine red (Rodamine Red), Texas red (Texas Red), cyanine 5 (Cyanine 5), body P (Bodipy), quantum dots and the like may be exemplified, but are not limited thereto.
  • Xylene cyanol FF Xylene cyanol FF
  • DAPOL as a linker for binding to CPBA.
  • CPBA 4-carboxylicphenyl boronic acid
  • APBA 3-aminophenyl boronic acid
  • CPBA 4-carboxylicphenyl boronic acid
  • APBA 3-aminophenyl boronic acid
  • the dye may be directly bonded to boronic acid, but in order to improve the stability and sensitivity of the dye, several dye molecules may be encapsulated in one silica nanoparticle and then combined with a boronic acid derivative.
  • xylene cyanol-DAPOL-CPBA tartrazine-APBA
  • Methylene blue-silica nanopatilce-CPBA FGS (Fast green FCF doped silica nanoparticle)-CPBA
  • FGS-APBA FGS-APBA
  • FITC-doped silica Nanoparticle-CPBA may be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the protein precipitating agent is for facilitating the measurement of glycated albumin on the absorbent pad of the cartridge, and includes ammonium sulfate, caprylic acid, dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC ), trioctylmethylammonium chloride (TOMAC), zinc sulfate, polyethylene glycol (PEG), and the like, but are not limited thereto.
  • the protein precipitation agent varies depending on the type, it is preferable to treat it at a concentration of 1 mM to 50 mM.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method for measuring a glycosylated albumin ratio using the reagent kit and optical instrument for measuring glycated albumin of the present invention.
  • the step of reacting the serum solution to the albumin pretreatment and reaction reagent (R1) the step of reacting the glycated albumin reaction reagent with the R1 reaction solution (R2), the treatment of the protein precipitation agent in the R2 reaction solution
  • the R3 reaction solution is administered to a cartridge including the measuring pad and the absorption pad, and the glycated albumin ratio can be measured by measuring the optical reflectivity of the measuring pad with an optical instrument.
  • the present invention provides a glycosylation that can measure the glycated albumin ratio by administering a single measurement sample comprising (a) albumin pretreatment and reaction reagent, (b) glycated albumin reaction reagent, and (c) protein precipitation agent. It relates to a method for measuring the glycated albumin ratio using a reagent kit for measuring albumin.
  • the present invention comprises the steps of (a) reacting with plasma or serum solution in albumin pretreatment and reaction reagent; (b) reacting the reaction solution with the albumin pretreatment and reaction reagent into the saccharified albumin reaction reagent; (c) reacting the reaction solution with the glycated albumin reaction reagent into a protein precipitant; (d) washing with a washing solution after administering the final reactant to the measuring pad of the cartridge; and (e) measuring the optical reflectivity of the measuring pad with an optical instrument to calculate the glycosylated albumin ratio.
  • the albumin pretreatment and reaction reagent, the glycosylated albumin reaction reagent, and the protein precipitating agent are the same as described above.
  • the cartridge is intended to measure the ratio of glycated albumin from a reaction product obtained by treating serum or plasma with an albumin pretreatment and reaction reagent, a glycated albumin reaction reagent, and a protein precipitating agent with an optical instrument.
  • the cartridge includes a measurement pad for absorbing the reaction solution, an absorption pad positioned below the measurement pad, through which a liquid component of the reaction solution injected into the measurement pad moves, and a housing surrounding them.
  • the measurement pad is for measuring the reflectivity of the precipitate of the final reaction solution, and a membrane made of glass fiber, cellulose, and polyester sulfone with a pore size of 0.1 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the absorbent pad is made of cellulose fiber, glass fiber, polyurethane, or the like.
  • the optical device can be used without any particular limitation as long as it can measure optical reflectivity using optical properties, and a light source (red) capable of generating the wavelength of the albumin reaction reagent and the wavelength of the glycated albumin reaction reagent at the same time and blue), and the reflected optical signal is measured with an optical detector to calculate the glycosylated albumin ratio through an optical signal converter.
  • the red light source has a range of 600 to 670 nm and preferably measures a blue-based dye or fluorescence
  • the blue light source has a range of 430 to 490 nm, and preferably a yellow-red dye can be measured.
  • Example 1 Measurement of albumin optical reflectance using albumin reaction reagent and protein precipitant reagent
  • An albumin reaction reagent containing tartrazine was reacted with four concentrations of human serum albumin (HSA; Sigma-Aldrich A1653) and four serially diluted serum samples for each concentration.
  • the amount of albumin was measured by measuring the optical reflectivity of the reaction precipitate treated with the protein precipitant reagent containing octylmethyl ammonium chloride (TOMAC).
  • the measurement sample was mixed with an albumin reaction reagent containing tartrazine in a 1:1 ratio and reacted for 1 minute, and then 10 ⁇ L of the reaction solution was reacted with a protein precipitant reagent containing 200 ⁇ L of TOMAC for 5 minutes.
  • a protein precipitant reagent containing 200 ⁇ L of TOMAC for 5 minutes.
  • the reflectance of blue light (630 nm) was measured by putting the cartridge into an optical instrument (Episode ® 616, Dixgen).
  • the amount of albumin was converted into a K/S value according to the Kubelka-Munk equation for calculating optical reflectance, and the formula is as follows.
  • a cartridge including a measuring pad made of glass fiber and an absorbent pad made of cellulose fiber manufactured by Dixgene was used as the cartridge.
  • the blue light K/S value increased as the amount of albumin increased in albumin or serum samples using an albumin reaction reagent and a protein precipitant containing tartrazine.
  • Example 2 Measurement of optical reflectance using reagents for measuring glycated albumin
  • albumin pretreatment and reaction reagents were prepared by adding 1 ml of guanidine that modifies the protein structure to 1 ml of albumin reaction reagent containing tartrazine, and tartrazine It was compared in terms of glycated albumin reaction efficiency with an albumin reaction reagent containing
  • the measurement sample is a low-concentration (15.3% GA) and high-concentration (36.2% GA) solution of a standard solution of the reference reagent (Asahi Kasei Lucica GA-L) and a medium concentration (26.6% GA) solution in which these two solutions are mixed 1:1 was prepared and used after confirming the GA% value with the upper standard reagent (Asahi Kasei Lucica GA-L) and the standard equipment automatic biochemical analyzer (AU400, Beckman Coulter).
  • albumin reaction reagent containing only tartrazine and (2) pretreatment reagent containing guanidine are mixed in a 1:1 ratio to prepare albumin pretreatment and reaction reagent, and the albumin pretreatment and The reaction reagent was mixed with the measurement sample in a 1:1 ratio and reacted for 1 minute, respectively, and 25 ⁇ L of the reaction solution was reacted with a glycosylated protein reaction reagent containing 200 ⁇ L of xylene cyanol-DAPOL-CPBA for 5 minutes. Again, 25 ⁇ L of this reaction solution was reacted with 200 ⁇ L of protein precipitant reagent containing TOMAC for 5 minutes.
  • the final reaction solution 25 ⁇ L, is placed on the cartridge measuring pad of the optical instrument (Episode ® 616, Dixgene) to absorb for 15 seconds, and 25 ⁇ L washing solution (Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol and NaN 3 mixture) is added. and absorbed for 15 seconds.
  • the cartridge was put into an optical instrument (Episode ® 616, Dixgene) to measure the optical reflectance of the blue light source (630 nm) and the red light source (470 nm).
  • the blue light reflectance value obtained at the wavelength of the albumin reagent representing the total amount of albumin and the red light reflectance value obtained at the wavelength of the glycosylated albumin reagent representing the amount of glycated albumin were respectively calculated according to the Kubelka-Munk equation K/S value. After calculating as , it was possible to measure the glycated albumin% ratio by calculating the ratio of glycated albumin to total albumin.
  • albumin reaction reagent (DI / Tz, ⁇ ) containing only tartrazine or albumin pretreatment and reaction reagent containing guanidine and tartrazine (Gn / Tz, ⁇ )
  • reaction reagent containing guanidine and tartrazine (Gn / Tz, ⁇ )
  • Gn / Tz, ⁇ glycosylated protein reaction reagent containing xylene cyanol-DAPOL-CPBA and a protein precipitant reagent containing TOMAC
  • the correlation (R 2 ) was high, confirming that the modification of the protein structure had an effect on the glycated albumin reaction efficiency.
  • the sample to be measured is mixed with a low-concentration and high-concentration solution of a standard solution of a reference reagent (Asahi Kasei GA-L), and measured with an upper standard reagent (Asahi Kasei Lucica GA-L) and an automatic biochemical analyzer (AU400, Beckman Coulter) as standard equipment 23.9%, 29.1%, and 34.9% GA solutions were used.
  • a reference reagent Asahi Kasei GA-L
  • an upper standard reagent Asahi Kasei Lucica GA-L
  • AU400 automatic biochemical analyzer
  • the measurement sample is mixed with albumin pretreatment and reaction reagent containing 2-mercaptoethanol in a 1:1 ratio and reacted for 1 minute, then 25 ⁇ L reaction solution is mixed with 200 ⁇ L xylene cyanol-DAPOL-CPBA glycosylated protein reaction reagent and reacted for 3 minutes. Again, 25 ⁇ L of this reaction solution was reacted with a protein precipitant reagent containing 200 ⁇ L PEG and ammonium sulfate for 3 minutes.
  • the final reaction solution 25 ⁇ L, is placed on the cartridge measuring pad of the optical instrument (Episode ® 616, Dixgene) to absorb for 15 seconds, and 25 ⁇ L washing solution (Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol and NaN 3 mixture) is added. and absorbed for 15 seconds.
  • the cartridge was placed in an optical instrument (Episode ® 616, Dixgen) to measure the optical reflectance of the blue light source (630 nm) and the red light source (470 nm), and as described above, the K/S values were By calculating the ratio of glycated albumin to total albumin, the glycated albumin ratio was measured.
  • the ratio of glycated albumin was measured using albumin pretreatment and reaction reagent using TCEP, which reduces disulfide bonds like 2-mercaptoethanol but has better stability in albumin pretreatment and reaction reagent.
  • the measurement sample is a low-concentration (15.7% GA) and high-concentration (36.9% GA) solution of a standard solution of a reference reagent (Asahi Kasei GA-L), a medium concentration (26.1% GA) solution in which the two solutions are mixed 1:1, and 11.8 %, 15.9%, 18.6%, and 23.5% of the serum samples having GA concentrations were used by measuring the GA% with an upper standard reagent (Asahi Kasei Lucica GA-L) and a standard equipment automatic biochemical analyzer (AU400, Beckman Coulter).
  • the sample was mixed with the albumin pretreatment and reaction reagent containing tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) in a 1:1 ratio and reacted for 1 minute, and then 25 ⁇ L of the reaction solution was added to 200 ⁇ L xylene cyanol-DAPOL- It was reacted with a glycosylated protein reaction reagent containing CPBA for 3 minutes. Again, 25 ⁇ L of this reaction solution was reacted with protein precipitant reagent containing 200 ⁇ L TOMAC for 3 minutes.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • the final reaction solution 25 ⁇ L, is placed on the cartridge measuring pad of the optical instrument (Episode ® 616, Dixgene) to absorb for 15 seconds, and 25 ⁇ L washing solution (Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol and NaN 3 mixture) is added. and absorbed for 15 seconds.
  • the cartridge was placed in an optical instrument (Episode ® 616, Dixgen) to measure the optical reflectance of the blue light source (630 nm) and the red light source (470 nm), and as described above, the K/S values were By calculating the ratio of glycated albumin to total albumin, the glycated albumin ratio was measured.
  • the method for measuring the glycated albumin ratio according to the present invention can be utilized as an index for diabetes diagnosis.
  • glycated albumin can be measured quickly and simply, so it is useful for diabetic patients.

Abstract

본 발명은 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 알부민 전처리 및 반응 시약, 당화 알부민 반응 시약 및 단백질 침전제를 포함하는 당화 알부민 측정용 시약 키트와 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 당화 알부민 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율 측정법은 복수의 광원을 동시에 측정하여 당화 알부민 비율을 특정할 수 있으므로, 별도의 측정과정 없이 하나의 측정 카트리지에서 광학분석기로 간단하게 당화 알부민을 측정할 수 있는 장점이 있다.

Description

당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법
본 발명은 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당뇨병 진단 지표 중 하나인 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법에 관한 것이다.
당뇨병은 혈당조절 역할을 하는 인슐린의 이상으로 인해 발생하는 대사질환으로, 인슐린을 생성하는 세포가 면역 시스템의 이상으로 인해 파괴되어 부족할 때 발생되는 1형 당뇨와 인슐린의 분비량이 부족하거나 효과적으로 사용되지 못함에 따라 발생되는 2형 당뇨 등 발병 원인에 따라 분류된다.
당뇨병은 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 혈당관리 조절을 실패할 경우 당뇨망막증, 신장질환, 족부병변 등의 합병증이 유발될 수 있기 때문에 당뇨병 환자들의 혈당 관리에 대한 중요성은 증가되고 있다.
종래의 당뇨병 측정 마커는 포도당을 사용하였으나, 식전 식후의 혈당 값 변동이 심하기 때문에 측정하는 시간에 따른 오차 및 환자의 컨디션에 따른 변동이 직접적으로 나타날 수가 있다는 문제점이 있다. 또한 포도당 측정에 사용하는 포도당산화효소는 pH나 혈액 내에 포함된 다른 방해물질 등과 같은 측정하는 환경영향에 취약하며, 과산화수소를 발생시킴에 따라 효소의 활성에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 최근에는 포도당보다 정확하게 측정할 수 있고, 보다 안정적인 혈당 측정용 바이오 마커로써 당화혈색소(glycated hemoglobin, HbA1c)를 이용하고 있다. 당화혈색소는 생성되면 적혈구가 소멸되기까지는 안정하므로 2~3개월의 평균혈당치를 나타내는 지표로 사용되므로, 실제 당뇨병의 진단 및 치료 경과 추이를 조사하는데 활용된다. 하지만 당화혈색소 측정법은 말기 만성신부전 등과 같이 혈당이 꾸준히 유지되지 못하는 일부의 질환자나 적혈구에 이상이 있는 환자에게는 적합하지 않다고 알려져 있다.
알부민은 혈액뿐만 아니라 주요 장기와 체액에 존재하는 단백질로, 혈액의 포도당 농도에 따라 포도당이 결합된 당화 알부민이 형성되기도 한다. 알부민은 혈색소에 비해 포도당의 결합률이 10배 정도 높아서 당화 알부민은 당화혈색소보다 혈당 변화에 더욱 민감하게 반응하고, 적혈구 수명이 90일 정도인 것에 비하여 알부민은 15~20일 정도로 짧아서, 최근 2주 동안 혈중 포도당 수준의 평균치를 모니터링할 수 있다. 따라서, 혈당이 꾸준히 유지되지 않는 말기 만성신부전 환자, 철 결핍성 빈혈 환자, 변종 헤모글로빈을 가진 당뇨환자에서 중요한 혈당 컨트롤 지표로 유용하다.
미국등록특허 제7871789호, 미국등록특허 제6008006호, 미국등록특허 제8507223호, 중국공개특허 제104673878호 및 중국공개특허 제104614459호는 종래의 당화 알부민을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 시료에 존재하는 당화 단백질을 단백질분해효소를 사용하여 당화 아미노산 또는 당화 펩타이드로 분해한 후 이와 특이적으로 반응하는 당화 아미노산 산화 효소 (EC 1.5.3) 계열의 효소 반응으로 생성된 과산화수소(H 2O 2)를 다시 페록시다아제(peroxidase) 효소를 이용하여 측정하는 당화 알부민 효소법을 개시하였다.
당화 알부민 효소법은 알부민에 대한 높은 선택성 및 정확성뿐만 아니라, 면역법 보다 빠른 시간 내(10~30분) 검사가 가능하지만, 효소 단백질 특성상 그 활성이 당화 알부민 분석법 효율에 큰 영향을 미치기 때문에, 효소의 활성 유지 및 보관에 엄격한 주의가 요구된다.
당화 알부민 효소법은 시료 내에 이미 존재하는 당화 아미노산과 당화 펩타이드를 제거하기 위한 단계가 선행되어야 하며, 당화 아미노산 산화효소(EC 1.5.3)는 온전한 당화 단백질을 기질로 사용할 수 없기 때문에, 반드시 단백질 분해효소를 사용하여 당화 단백질을 당화 아미노산 또는 펩타이드로 분해하는 단계가 선행되어야 하는 등 다단계로 구성된 복잡한 측정법이다. 따라서 이보다 간단하며 신속하게 당화 알부민을 측정할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
또한 미국등록특허 제5223392호, 미국등록특허 제5908925호, 유럽공개특허 제0657470호, 유럽등록특허 제0257421호 및 중국공개특허 제103554256호는 당화 알부민을 검출하기 위하여 알부민 항체 및 페록시다아제 효소와 컨주게이션된 당화 알부민 항체를 이용한 효소 면역측정법(ELISA)을 개시하였고, Ikeda 등은 알부민 항체 및 페록시다아제 효소와 컨주게이션된 보론산을 이용한 효소-보론산 면역측정법(ELIBA)을 개시하였다(Ikeda et al, Clin Chem. 44(2):256-263, 1998). 이들 방법은 높은 선택성 및 정확성을 보였으나, 항체 및 효소의 보관 및 유지가 필요하고, 많은 시간(30~90분)이 소요되어 래피드 키트로의 개발에는 제한이 있다. 게다가 고가의 당화알부민 항체는 제품화하는데 큰 걸림돌이 되고 있다.
POC(Point of care)나 래피드 키트로써 미국등록특허 제9128085호, 미국공개특허 제2006-0270060호, 미국공개특허 제2008-0227210호, 미국공개특허 제2010-0167306호, 미국등록특허 제5470759호 및 미국등록특허 제7659107호는 혈액, 침 등의 시료에서 알부민 및 당화 알부민을 측정을 위해 항체 기반의 측면유동면역발색법(lateral flow immunochromatography)을 이용한 일회용 스트립 및 카세트 이용한 방법을 개시하였고, 미국공개특허 제2014-0170766호는 항체와 유사한 작용을 하는 핵산 유래의 알부민 앱타머와 당화 알부민 앱타머를 이용한 측면유동면역발색법(lateral flow immunochromatography)을 적용시킨 래피드 키트의 제조방법을 개시하였으며, 미국공개특허 제2014-0335630호는 당화 알부민 앱타머와 SPR (surface plasmon resonance)을 이용한 측정법을 개시하였다. 그러나 항체 또는 핵산으로 구성된 앱타머 역시 항체와 같이 유지 및 보관에 주의가 필요하다.
국내등록특허 제10-2029798에서 전체 알부민에 특이적으로 결합하는 브로모크레졸그린 또는 브로모크레졸퍼플과 당화알부민에 특이적으로 결합하는 "염료를 캡슐화한 실리카 나노입자-보론산"을 이용한 당화알부민 측정법을 개시하였다. 이 방법은 전체 알부민과 당화알부민을 각각 측정하여 당화알부민 비율을 계산하는 방법이다. 산성의 알부민 측정시약과 알칼리성의 당화알부민 시약은 서로 양립할 수 없기 때문에 측정 시료를 각각의 시약에서 측정해야만 하여 측정 시약 및 카트리지 등이 모두 독립적으로 구성되어야만 한다. 따라서, 이보다 간소화하여 신속하게 당화알부민을 측정할 수 있는 방법이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, (a) 알부민 전처리 및 반응 시약; (b) 당화 알부민 반응 시약; 및 (c) 단백질 침전제를 이용할 경우, 한 번의 측정 시료의 투여로 상기 일련의 시약 반응을 거쳐 광학기기로 당화 알부민 비율을 간단하고, 정확하게 측정 할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 당뇨병 진단의 지표로써 활용될 수 있는 당화 알부민 비율을 한 번의 측정시료의 투여로 간단하고 정확하게 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트와 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 전처리 및 반응 시약은 (a) 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 구아니딘(guanidine), 하이드록실아민(Hydroxylamine), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 나트륨시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 및 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine), 우레아(urea)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 구조를 변형시키기 위한 알부민 전처리 시약 및 (b) 타르트라진 (Tartrazine), 에타크리딘 락테이트(Ethacridine lactate), 메틸 오렌지(Methyl orange) 및 메틸 레드(Methyl red)로 구성된 군에서 선택되는 알부민 반응 시약을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 침전제는 황산암모늄(ammonium sulfate), 카프릴산(caprylic acid), 디메틸옥타데실염화암모늄(dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC), 트리옥틸메틸염화 암모늄(trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 황산아연(Zinc sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 한다.
본 발명에 있어서, 상기 당화 알부민 반응 시약은 염료-컨쥬게이션 보론산인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 염료는 알부민 측정 시약과 구별되는 보색계열 염료나 형광염료인 것을 특징으로 하며, 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF), 메틸렌 블루(Methylene blue), 패스트 그린 FCF(Fast Green FCF), FITC, 로다민 레드(Rodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 사이아닌 5(Cyanine 5), 보디피(Bodipy) 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, (a) 알부민 전처리 및 반응 시약을 혈청 또는 혈장과 반응시키는 단계; (b) 알부민 전처리 및 반응 시약의 반응물을 당화 알부민 반응 시약에 넣고 반응시키는 단계; (c) 당화 알부민 반응시약의 반응물을 단백질 침전제에 넣고 반응시키는 단계; (d) 단백질 침전제와의 반응물을 카트리지의 측정 패드에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및 (e) 광학기기로 측정 패드의 광학 반사도를 측정하여 당화 알부민 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율 측정법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 패드는 유리 섬유(glass fiber), 셀룰로즈(cellulose), 폴리에스테르 술폰(polyesther sulfone) 소재의 멤브레인으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 흡수패드는 셀룰로즈 섬유(cellulose fiber), 유리 섬유(glass fiber) 및 폴리우레탄(polyurethane)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 패드의 멤브레인 포어 크기는 0.1 μm~1 μm 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 광학기기는 전체 알부민의 양을 나타내는 염료 시약의 파장과 당화 알부민의 양을 대변하는 당화 알부민 반응 시약의 파장을 측정할 수 있는 복수의 광원을 동시에 조사하여 광학 반사도를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 당화 알부민 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율 측정법은 복수의 광원을 동시에 측정하여 당화 알부민 비율을 특정할 수 있으므로, 별도의 측정과정 없이 하나의 측정 카트리지에서 광학분석기로 간단하게 당화 알부민을 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 광학기기를 이용하여 당화 알부민 비율 측정 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 알부민 전처리 및 측정 시약 및 광학기기를 이용하여 알부민 양에 따른 측정 반사도 값을 나타낸 그래프이다.
도 3~5는 본 발명의 일 실시예에 따른 알부민 전처리 및 반응 시약에서 단백질 변성제의 유무에 따른 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 광학기기를 이용하여 측정 시료의 당화 알부민 비율에 따른 반사도 값을 비교한 그래프이다.
본 발명에서는 (a) 알부민 전처리 및 반응 시약; (b) 당화 알부민 반응 시약; 및 (c) 단백질 침전제를 이용할 경우 광학기기로 당화 알부민 비율을 간단하고, 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 알부민 전처리 및 반응 시약에 알부민 및 당화 알부민을 포함하는 혈장 또는 혈청 샘플을 넣어 반응시키고, 이를 당화 알부민 반응 시약과 반응시킨 다음, 단백질 침전제와 반응시켰다. 다음으로 반응액을 측정 패드에 투여한 후, 반응하지 않은 시약 및 불순물과 결합된 시약을 세척한 다음, 광학기기로 측정 패드의 광학 반사도를 측정하여 당화 알부민의 비율을 계산할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 알부민 전처리 시약인 구아니딘에 혈장샘플에 넣어 반응시키고, 당화 알부민 반응 시약인 xylene cyanol-DAPOL-CPBA와 반응시킨 뒤에, 단백질 침전제인 트리옥틸메틸염화 암모늄(Trioctylmethylammonium chloride, TOMAC)과 반응시키고, 측정 패드에 투여한 후, 세척한 다음, 광학기기로 측정 패드를 적색 및 청색 광원으로 조사하여 각각의 광학 반사도를 측정함으로써, 그 비율을 토대로 당화 알부민의 비율을 간단하게 특정할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트에 관한 것이다.
상기 알부민 전처리 및 반응 시약은 당화 알부민과 당화 알부민 반응 시약의 반응을 용이하게 하기 위한 것으로, 알부민 전처리 시약 및 알부민 반응 시약을 포함한다.
상기 알부민 전처리 시약은 단백질 구조를 변형시킬 수 역할을 할 수 있다면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 구아니딘(guanidine), 하이드록실아민(Hydroxylamine), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 나트륨시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP), 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine), 우레아(urea) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알부민 반응 시약은 알부민과 결합되며, 광학으로 측정할 수 있는 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 타르트라진 (Tartrazine), 에타크리딘 락테이트(Ethacridine lactate), 메틸 오렌지(Methyl orange), 메틸 레드(Methyl red) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알부민 전처리 시약은 그 종류에 따라 달라지지만 1 mM~50 mM 농도로 처리하는 것이 바람직하고, 알부민 반응 시약은 0.1 mM~10 mM 농도를 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 당화 알부민 반응 시약은 당화 알부민의 선택적 검출을 위한 것으로서, 염료-컨쥬게이션 보론산을 이용할 수 있다.
상기 염료는 알부민 측정 시약과 구별되는 보색계열 염료나 형광염료인 것을 특징으로 하며, 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF), 메틸렌 블루(Methylene blue), 패스트 그린 FCF(Fast Green FCF), FITC, 로다민 레드(Rodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 사이아닌 5(Cyanine 5), 보디피(Bodipy), 양자점 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 참고로, 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF)은 CPBA와의 결합을 위한 링커로 DAPOL을 포함하고 있다.
당화 알부민에 대한 선택성을 부여하기 위한 보론산은 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylicphenyl boronic acid, CPBA)과 3-아미노페닐 보론산(3-Aminophenyl boronic acid, APBA)를 사용하는 것이 바람직한데, 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylicphenyl boronic acid, CPBA)는 상대적으로 3-아미노페닐 보론산(3-Aminophenyl boronic acid, APBA)에 비하여 상대적으로 열적 안정성이 높기 때문에 CPBA를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 염료는 보론산과 직접 결합될 수도 있으나, 염료의 안정성 및 감도 향상을 위하여, 여러 개의 염료 분자를 하나의 실리카 나노입자 안에 캡슐화시킨 후 이를 보론산 유도체와 결합시킬 수도 있다.
따라서, 상기 염료-컨쥬게이션 보론산으로는 xylene cyanol-DAPOL-CPBA, tartrazine-APBA, Methylene blue-silica nanopatilce-CPBA, FGS (Fast green FCF doped silica nanoparticle)-CPBA, FGS-APBA, FITC-doped silica nanoparticle-CPBA 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 침전제는 카트리지의 흡수패드에서 당화 알부민의 측정을 용이하게 하기 위한 것으로서, 황산암모늄(ammonium sulfate), 카프릴산(caprylic acid), 디메틸옥타데실염화암모늄(dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC), 트리옥틸메틸염화 암모늄(trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), 황산아연(Zinc sulfate), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질 침전제는 그 종류에 따라 달라지지만 1 mM ~50 mM 농도로 처리하는 것이 바람직하다.
도 1은 본 발명의 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 광학기기를 이용하여 당화 알부민 비율 측정 방법을 나타낸 순서도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 알부민 전처리 및 반응 시약에 혈청 용액을 넣고 반응시키는 단계(R1), R1 반응액에 당화 알부민 반응 시약을 반응시키는 단계(R2), R2 반응액에 단백질 침전제를 처리하는 단계(R3)를 수행한 다음, 측정패드 및 흡수패드를 포함하는 카트리지에 R3 반응액을 투여하고, 광학기기로 측정패드의 광학 반사도를 측정하면 당화 알부민 비율을 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율 측정법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 알부민 전처리 및 반응 시약에 혈장 또는 혈청 용액을 넣고 반응시키는 단계; (b) 알부민 전처리 및 반응 시약과의 반응액을 당화 알부민 반응 시약에 넣고 반응시키는 단계; (c) 당화 알부민 반응시약과의 반응액을 단백질 침전제에 넣고 반응시키는 단계; (d) 최종 반응물을 카트리지의 측정 패드에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및 (e) 광학기기로 측정 패드의 광학 반사도를 측정하여 당화 알부민 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율 측정법에 관한 것이다.
본 발명의 당화 알부민 비율 측정법에 있어서, 상기 알부민 전처리 및 반응 시약, 당화 알부민 반응 시약 및 단백질 침전제는 앞서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에 있어서, 상기 카트리지는 혈청 또는 혈장에 알부민 전처리 및 반응 시약, 당화 알부민 반응 시약 및 단백질 침전제를 처리하여 획득한 반응물로부터 당화 알부민의 비율을 광학기기로 측정할 수 있도록 하기 위한 것이다.
상기 카트리지는 반응액을 흡수하는 측정패드, 상기 측정패드 하부에 위치하며, 측정패드에 투입된 반응액중 액체성분이 이동되는 흡수패드 및 이들을 둘러싼 하우징을 포함한다.
상기 측정 패드는 최종 반응액의 침전물의 반사도를 측정하기 위한 것으로, 포어 크기 0.1 μm~1 μm 포어 크기의 유리 섬유(glass fiber), 셀룰로즈(cellulose), 폴리에스테르 술폰(polyesther sulfone) 소재의 멤브레인을 이용하는 것이 바람직하며, 상기 흡수패드는 셀룰로즈 섬유(cellulose fiber), 유리 섬유(glass fiber), 폴리우레탄(polyurethane) 등을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 광학기기는 광학 특성을 이용하여 광학 반사도를 측정할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 알부민 반응 시약의 파장 및 당화 알부민 반응 시약의 파장을 동시에 발생시킬 수 있는 광원(적색 및 청색)으로 조사하고, 반사된 광신호를 광학검출기(photodetector)로 측정하여 광신호 변환기를 통해 당화 알부민 비율을 계산할 수 있다. 적색 광원은 600~670 nm 범위를 가지며 바람직하게는 청색계열 염료나 형광을 측정하며, 청색 광원은 430~490 nm 범위를 나타내며 바람직하게는 황적색계열의 염료를 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 알부민 반응 시약과 단백질 침전제 시약을 이용한 알부민 광학 반사도 측정
타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 반응 시약과 4종의 농도별 인체 혈청 알부민 측정시료(human serum albumin, HSA; 씨그마알드리치 A1653)와 연속 희석한 4종의 농도별 혈청시료를 반응시키고, 트리옥틸메틸염화 암모늄(TOMAC)을 포함하는 단백질 침전제 시약을 처리한 반응 침전물의 광학반사도를 측정하여 알부민 양을 측정하였다.
즉, 측정 시료를 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 반응 시약과 1:1 비율로 혼합하여 1분간 반응시킨 후, 10 μL 반응액을 200 μL TOMAC을 포함하는 단백질 침전제 시약과 5분간 반응시켰다. 25 μL 최종 반응액을 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)의 카트리지 측정 패드에 올려 15초 동안 흡수시키고, 25 μL 세척 용액(Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol 및 NaN 3 혼합액)을 넣고 15초 동안 흡수시켰다. 다음으로, 카트리지를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)에 넣어 청색광(630nm)의 반사도를 측정하였다. 알부민 양을 광학 반사도(Reflectance)를 계산하는 쿠벨라-뭉크 방정식(Kubelka-Munk theory)에 따라 K/S 값으로 변환하여 나타내었고, 그 공식은 다음과 같다.
Figure PCTKR2020018293-appb-img-000001
(K= 흡수계수, S= 산란계수)
참고로, 카트리지는 딕스젠에서 제조한 유리 섬유 소재의 측정패드 및 셀룰로즈 섬유 소재의 흡수패드를 포함하는 카트리지를 사용하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 반응 시약과 단백질 침전제를 이용하여 알부민이나 혈청시료에서 알부민 양이 증가할수록 청색광 K/S 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시 예 2 : 당화 알부민 측정용 시약을 이용한 광학 반사도 측정
2.1 당화 알부민 측정용 시약을 이용한 광학 반사도 측정 1
당화 알부민 측정 효율을 증가시키기 위하여 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 반응시약 1 ml에 단백질 구조를 변형시키는 구아니딘(guanidine) 1 ml을 추가한 알부민 전처리 및 반응 시약을 제조하여, 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 반응시약과 함께 당화알부민 반응 효율 측면에서 비교하였다. 측정 시료는 기준시약(아사히 가세이 루시카 GA-L)의 표준 용액의 저농도(15.3% GA)와 고농도(36.2% GA)와 이 두 용액을 1:1로 혼합한 중농도(26.6% GA) 용액을 준비하였고, 상위 기준시약(아사히 가세이 루시카 GA-L)과 기준장비 자동생화학분석기(AU400, Beckman Coulter)으로 GA% 값을 확인한 후 사용하였다.
자세하게는 (1) 타르트라진(tartrazine)만을 포함하는 알부민 반응시약과 (2)구아니딘(guanidine)을 포함하는 전처리 시약을 1:1 비율로 혼합하여 알부민 전처리 및 반응 시약을 제조하고, 이 알부민 전처리 및 반응 시약을 측정 시료와 1:1 비율로 혼합하여 각각 1분간 반응시킨 후, 25 μL 반응액을 200 μL xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약과 5분간 반응시켰다. 다시 이 반응액의 25 μL를 TOMAC을 포함하는 단백질 침전제 시약 200 μL과 5분간 반응시켰다. 최종 반응액, 25 μL를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)의 카트리지 측정 패드에 올려 15초 동안 흡수시키고, 25 μL 세척 용액(Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol 및 NaN 3 혼합액)을 넣고 15초 동안 흡수시켰다. 다음으로, 카트리지를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)에 넣어 청색 광원(630nm) 및 적색 광원(470nm)의 광학 반사도(reflectance)를 측정하였다.
전체 알부민 양을 나타내는 알부민 시약의 얻은 파장에서 얻은 청색광 반사도 값과 당화알부민 양을 나타내는 당화알부민 시약의 파장에서 얻은 적색광 반사도값을 각각 쿠벨라-뭉크 방정식(Kubelka-Munk theory)에 따라 K/S값으로 계산한 후, 전체 알부민 대비 당화알부민의 비율을 계산하여 당화알부민% 비율을 측정할 수 있었다.
도 3에 기재된 바와 같이, 타르트라진(tartrazine)만을 포함하는 알부민 반응시약(DI/Tz, △)이나 구아니딘과 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약(Gn/Tz, ●)을, xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약 및 TOMAC을 포함하는 단백질 침전제 시약과 반응시켰을 때, 당화 알부민의 비율이 증가함에 따라 상대적으로 K/S값의 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
하지만, 타르트라진(tartrazine)만을 포함하는 알부민 반응시약(R 2=0.8496)보다 구아니딘(guanidine)과 타르트라진(tartrazine)을 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약(R 2=0.977)이 당화 알부민% 값에 대한 상관도(R 2)가 높게 나타나 단백질 구조의 변형이 당화 알부민 반응 효율에 영향이 있음을 확인할 수 있었다.
2-2: 당화 알부민 측정용 시약을 이용한 광학 반사도 측정 2
알부민 전처리 및 반응 시약에서 구아니딘이 다른 종류의 단백질 변성제로 대체가 가능한지를 확인하기 위하여 단백질을 완전히 변성시키는 구아니딘(guanidine)을 단백질의 이황화 결합(disulfide bond)을 환원시키는 2-mercaptoethanol로 대체한 알부민 전처리 및 반응 시약을 실시예 2-1과 동일한 방법으로 제조하였고, 단백질 침전제 시약에서 TOMAC를 30 중량% PEG와 50 mM ammonium sulfate로 대체한 버퍼를 제조하여 당화알부민 비율을 측정하였다. 측정 시료는 기준시약(아사히 가세이 GA-L)의 표준 용액의 저농도와 고농도 용액을 혼합하여, 상위 기준시약(아사히 가세이 루시카 GA-L)과 기준장비 자동생화학분석기(AU400, Beckman Coulter)로 측정한 23.9%, 29.1%, 34.9% GA 용액을 사용하였다.
자세하게는 측정 시료를 2-mercaptoethanol을 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약과 1:1 비율로 혼합하여 1분간 반응시킨 후, 25 μL 반응액을 200 μL xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약과 3분간 반응시켰다. 다시 이 반응액의 25 μL를 200 μL PEG와 ammonium sulfate를 포함하는 단백질 침전제 시약과 3분간 반응시켰다. 최종 반응액, 25 μL를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)의 카트리지 측정 패드에 올려 15초 동안 흡수시키고, 25 μL 세척 용액(Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol 및 NaN 3 혼합액)을 넣고 15초 동안 흡수시켰다. 다음으로, 카트리지를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)에 넣어 청색 광원(630nm) 및 적색 광원(470nm)의 광학 반사도(reflectance)를 측정하였고, 상기에 기술한 바와 같이, K/S 값을 계산하여 전체 알부민 대비 당화알부민의 비율을 계산하여 당화알부민 비율을 측정하였다.
도 4에 기재된 바와 같이, 2-mercaptoethanol을 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약, xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약, 및 PEG와 ammonium sulfate를 포함하는 단백질 침전제 시약을 사용한 경우에도, 당화 알부민의 비율이 증가함에 따라 상대적으로 K/S값의 비율이 높아지는 것(R 2=0.9845)을 확인할 수 있었다.
2-3: 당화 알부민 측정용 시약을 이용한 광학 반사도 측정 3
또 다른 예로, 알부민 전처리 및 반응 시약에서 2-mercaptoethanol과 같이 이황화 결합을 환원시키나 안정성이 더 좋은 TCEP를 사용한 알부민 전처리 및 반응 시약을 이용하여 당화알부민 비율을 측정하였다. 측정 시료는 기준시약(아사히 가세이 GA-L)의 표준 용액의 저농도 (15.7% GA)와 고농도(36.9% GA)와 이 두 용액을 1:1로 혼합한 중농도(26.1% GA) 용액과 11.8%, 15.9%, 18.6%, 23.5% GA 농도를 갖는 혈청 샘플을 상위 기준시약(아사히 가세이 루시카 GA-L)과 기준장비 자동생화학분석기(AU400, Beckman Coulter)로 GA% 측정하여 사용하였다.
자세하게는 시료를 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)를 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약과 1:1 비율로 혼합하여 1분간 반응시킨 후, 25 μL 반응액을 200 μL xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약과 3분간 반응하였다. 다시 이 반응액의 25 μL를 200 μL TOMAC이 포함된 단백질 침전제 시약과 3분간 반응시켰다. 최종 반응액, 25 μL를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)의 카트리지 측정 패드에 올려 15초 동안 흡수시키고, 25 μL 세척 용액(Morpholine, NaCl, Triton X-100, Glycerol 및 NaN 3 혼합액)을 넣고 15초 동안 흡수시켰다. 다음으로, 카트리지를 광학기기(에피소드 ® 616, 딕스젠)에 넣어 청색 광원(630nm) 및 적색 광원(470nm)의 광학 반사도(reflectance)를 측정하였고, 상기에 기술한 바와 같이, K/S 값을 계산하여 전체 알부민 대비 당화알부민의 비율을 계산하여 당화알부민 비율을 측정하였다.
도 5에 기재된 바와 같이, TCEP를 포함하는 알부민 전처리 및 반응 시약, xylene cyanol-DAPOL-CPBA를 포함하는 당화단백질 반응시약, 및 TOMAC을 포함하는 단백질 침전제 시약을 이용한 경우에도, 당화 알부민의 비율이 증가함에 따라 상대적으로 K/S값의 비율이 높아지는 것(R 2=0.9899)을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 당화 알부민 비율의 측정법은 당뇨병 진단의 지표로써 활용될 수 있다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 당화 알부민 측정용 시약 키트를 이용하면, 신속하고 간단하게 당화 알부민을 측정할 수 있으므로, 당뇨병 환자들에게 유용하다.

Claims (17)

  1. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  2. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 당화 알부민 측정용 시약 키트에 있어서,
    상기 알부민 전처리 및 반응 시약은 (a) 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 구아니딘(guanidine), 하이드록실아민(Hydroxylamine), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 나트륨시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 및 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine), 우레아(urea)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 구조를 변형시키기 위한 알부민 전처리 시약 및 (b) 타르트라진 (Tartrazine), 에타크리딘 락테이트(Ethacridine lactate), 메틸 오렌지(Methyl orange) 및 메틸 레드(Methyl red)로 구성된 군에서 선택되는 알부민 반응 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  3. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 당화 알부민 측정용 시약 키트에 있어서,
    상기 단백질 침전제는 황산암모늄(ammonium sulfate), 카프릴산(caprylic acid), 디메틸옥타데실염화암모늄(dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC), 트리옥틸메틸염화 암모늄(trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 황산아연(Zinc sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  4. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 당화 알부민 측정용 시약 키트에 있어서,
    상기 알부민 전처리 및 반응 시약은 (a) 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 구아니딘(guanidine), 하이드록실아민(Hydroxylamine), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 나트륨시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 및 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine), 우레아(urea)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 구조를 변형시키기 위한 알부민 전처리 시약 및 (b) 타르트라진 (Tartrazine), 에타크리딘 락테이트(Ethacridine lactate), 메틸 오렌지(Methyl orange), 및 메틸 레드(Methyl red)로 구성된 군에서 선택되는 알부민 반응 시약을 포함하고, 상기 단백질 침전제는 황산암모늄(ammonium sulfate), 카프릴산(caprylic acid), 디메틸옥타데실염화암모늄(dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC), 트리옥틸메틸염화 암모늄(trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 황산아연(Zinc sulfate) 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 당화 알부민 반응 시약은 염료-컨쥬게이션 보론산인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염료는 알부민 측정 시약과 구별되는 보색계열 염료나 형광염료인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염료는 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF), 메틸렌 블루(Methylene blue), 패스트 그린 FCF(Fast Green FCF), FITC, 로다민 레드(Rodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 사이아닌 5(Cyanine 5), 보디피(Bodipy) 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  8. 제5항에 있어서, 상기 보론산은 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylicphenyl boronic acid, CPBA) 또는 3-아미노페닐 보론산(3-Aminophenyl boronic acid, APBA)인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 측정용 시약 키트.
  9. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약, (b) 당화 알부민 반응 시약 및 (c) 단백질 침전제를 포함하는 한 번의 측정 시료의 투여로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있는 당화 알부민 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율 측정법.
  10. (a) 알부민 전처리 및 반응 시약을 혈청 또는 혈장과 반응시키는 단계;
    (b) 알부민 전처리 및 반응 시약의 반응물을 당화 알부민 반응 시약에 넣고 반응시키는 단계;
    (c) 당화 알부민 반응시약의 반응물을 단백질 침전제에 넣고 반응시키는 단계;
    (d) 단백질 침전제와의 반응물을 카트리지의 측정 패드에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및
    (e) 광학기기로 측정 패드의 광학 반사도를 측정하여 당화 알부민 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율 측정법.
  11. 제10항에 있어서, 알부민 전처리 및 반응 시약은 (a) 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 구아니딘(guanidine), 하이드록실아민(Hydroxylamine), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 나트륨시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 및 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine), 우레아(urea)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 구조를 변형시키기 위한 전처리 시약 및 (b) 타르트라진 (Tartrazine), 에타크리딘 락테이트(Ethacridine lactate), 메틸 오렌지(Methyl orange) 및 메틸 레드(Methyl red)로 구성된 군에서 선택되는 알부민 반응 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 당화 알부민 반응 시약은 염료-컨쥬게이션 보론산인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 단백질 침전제는 황산암모늄(ammonium sulfate), 카프릴산(caprylic acid), 디메틸옥타데실염화암모늄(dimethyldioctadecylammonium chloride, DODMAC), 트리옥틸메틸염화 암모늄(trioctylmethylammonium chloride, TOMAC), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 황산아연(Zinc sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 카트리지는 반응액을 흡수하는 측정패드, 상기 측정패드 하부에 위치하며, 측정패드에 투입된 반응액중 액체성분이 이동되는 흡수패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 측정 패드는 유리 섬유(glass fiber), 셀룰로즈(cellulose), 폴리에스테르 술폰(polyesther sulfone) 소재의 멤브레인으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 흡수패드는 셀룰로즈 섬유(cellulose fiber), 유리 섬유(glass fiber) 및 폴리우레탄(polyurethane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 측정 패드의 멤브레인 포어 크기는 0.1 μm~1 μm 인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 광학기기는 전체 알부민의 양을 나타내는 염료 시약의 파장과 당화 알부민의 양을 대변하는 당화 알부민 반응 시약의 파장을 측정할 수 있는 복수의 광원을 동시에 조사하여 광학 반사도를 측정하는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354745A (zh) * 2021-07-09 2021-09-07 温州医科大学 一种组合物及规模化生产成纤维细胞生长因子的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114112587A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 青岛汉唐生物科技有限公司 糖化白蛋白校准品或质控品的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919708A (en) * 1990-11-14 1999-07-06 Axis Biochemicals As Assay for glycated blood proteins
KR20100137851A (ko) * 2009-06-23 2010-12-31 주식회사 올메디쿠스 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법
KR20150116011A (ko) * 2014-04-03 2015-10-15 케이맥(주) 전기영동을 이용한 당화단백질의 정량적 분석 방법 및 이를 이용한 키트
KR20180032512A (ko) * 2016-09-22 2018-03-30 주식회사 딕스젠 당화혈색소 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화혈색소의 측정방법
KR20180032513A (ko) * 2016-09-22 2018-03-30 주식회사 딕스젠 당화 알부민 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화 알부민의 측정방법
CN107870170A (zh) * 2017-12-25 2018-04-03 广州市进德生物科技有限公司 一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559643B (zh) 2011-12-26 2014-06-04 宁波美康生物科技股份有限公司 果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919708A (en) * 1990-11-14 1999-07-06 Axis Biochemicals As Assay for glycated blood proteins
KR20100137851A (ko) * 2009-06-23 2010-12-31 주식회사 올메디쿠스 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법
KR20150116011A (ko) * 2014-04-03 2015-10-15 케이맥(주) 전기영동을 이용한 당화단백질의 정량적 분석 방법 및 이를 이용한 키트
KR20180032512A (ko) * 2016-09-22 2018-03-30 주식회사 딕스젠 당화혈색소 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화혈색소의 측정방법
KR20180032513A (ko) * 2016-09-22 2018-03-30 주식회사 딕스젠 당화 알부민 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화 알부민의 측정방법
CN107870170A (zh) * 2017-12-25 2018-04-03 广州市进德生物科技有限公司 一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354745A (zh) * 2021-07-09 2021-09-07 温州医科大学 一种组合物及规模化生产成纤维细胞生长因子的方法

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