WO2021177560A1 - 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법 - Google Patents

당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a reagent kit for measuring the glycated albumin ratio capable of diagnosing diabetes mellitus and a method for measuring the glycated albumin ratio using the same, and more particularly, to gold nanoparticles to which an albumin antibody is bound and a boronic acid derivative to which a dye is bound. It relates to a reagent kit for measuring the glycosylated albumin ratio comprising a reagent kit and a method for measuring the glycosylated albumin ratio using the same.
  • Diabetes mellitus is a metabolic disease caused by an abnormality in insulin, which plays a role in regulating blood sugar.
  • Type 1 diabetes which occurs when cells that produce insulin are destroyed due to abnormalities in the immune system, and insulin secretion is insufficient or not used effectively. It is classified according to the cause, such as type 2 diabetes.
  • Diabetes mellitus is characterized by high blood sugar in which the concentration of glucose in the blood rises. Failure to control blood sugar can lead to complications such as diabetic retinopathy, kidney disease, and foot lesions, so the importance of blood sugar management in diabetic patients is increasing. .
  • glucose is used as a conventional diabetes measurement marker, there is a problem in that an error according to measurement time and fluctuation according to a patient's condition may appear directly because the blood glucose value before and after a meal fluctuates greatly.
  • glucose oxidase used for glucose measurement is vulnerable to environmental influences such as pH and other interfering substances contained in the blood, and may affect the activity of the enzyme by generating hydrogen peroxide.
  • glycated hemoglobin (HbA1c) has been used as a biomarker for measuring blood glucose that can be measured more accurately than glucose and is more stable. Since glycated hemoglobin is stable until red blood cells are destroyed, it is used as an index indicating the average blood sugar level of 2 to 3 months, so it is used to investigate the progress of diagnosis and treatment of diabetes.
  • the glycosylated hemoglobin measurement method is not suitable for patients with some diseases such as end-stage chronic renal failure, in which blood sugar cannot be maintained steadily, or for patients with abnormal red blood cells.
  • Albumin is a protein present not only in blood but also in major organs and body fluids. Depending on the concentration of glucose in the blood, glycated albumin is sometimes formed. Since albumin has a glucose binding rate 10 times higher than that of hemoglobin, glycated albumin responds more sensitively to changes in blood sugar than glycated hemoglobin. The average blood glucose level can be monitored. Therefore, it is useful as an important blood glucose control index in patients with end-stage chronic renal failure, iron deficiency anemia, and diabetic patients with mutant hemoglobin.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 2004-0018893 discloses a method for measuring the concentration of glycated hemoglobin using an immunochromatographic method.
  • Hemoglobin antibody, hemoglobin containing glycated hemoglobin, and glycated hemoglobin antibody are bonded to a nitrocellulose membrane in a sandwich method.
  • the red color of hemoglobin is absorbed through absorption spectroscopy.
  • the method of measuring the ratio is adopted.
  • the price of the glycated hemoglobin antibody is much higher than that of the hemoglobin antibody, which increases the unit price of the kit.
  • the method of measuring the absorbance of hemoglobin and the fluorescence of the dye attached to the glycated hemoglobin, respectively, and measuring the ratio has disadvantages in that it is necessary to measure each in different ways and use a relatively expensive fluorescence analyzer.
  • Korean Patent No. 2018-0032513 discloses a method for measuring the ratio of glycated albumin in albumin in blood or plasma by measuring the reflectivity of "dye encapsulated silica nanoparticles-boronic acid". Using a dye that selectively binds to glycosylated albumin may be helpful in measuring the ratio, but the error caused by measuring the signal of total albumin and the signal of glycosylated albumin reacted in different cartridges and calculating the ratio may be large. have.
  • Ikeda et al. disclosed an enzyme-boronic acid immunoassay (ELIBA) using an albumin antibody and boronic acid conjugated with a peroxidase enzyme (Ikeda et al, Clin Chem. 44(2):256-263, 1998). . Although these methods showed high selectivity and accuracy, their development as a low-cost rapid kit is limited due to the fact that they take a lot of time (30-90 minutes) and require an instrument capable of measuring fluorescence. Therefore, there is an urgent need to develop a method for measuring glycated albumin more simply and accurately.
  • ELIBA enzyme-boronic acid immunoassay
  • the present invention provides an albumin detection particle to which (a) an albumin antibody specifically binding to albumin is bound; and (b) a reagent kit for measuring a glycosylated albumin ratio comprising a boronic acid derivative to which a dye specifically detecting glycated albumin is provided.
  • the albumin detection particle to which the albumin antibody is bound and the boronic acid derivative to which the dye for detecting glycated albumin is bound has an absorption wavelength that does not interfere with each other.
  • the albumin detection particles are gold nanoparticles, polystyrene particles, quantum dot particles, upconversion nanoparticles, and silica particles having a dye fixed therein having an absorption wavelength of 450 to 650 nm that can be optically measured. characterized in that it is selected.
  • the albumin detection particle is characterized in that it has a diameter of 5 ⁇ 500nm.
  • the boronic acid derivative to which the dye is bound is characterized in that it is a yellow dye having an absorption wavelength of 400 to 430 nm or a blue dye having an absorption wavelength of 600 to 660 nm.
  • the present invention also relates to (a) albumin detection particles to which an albumin antibody specifically binding to albumin is bound; and (b) a method for measuring the glycosylated albumin ratio using a reagent kit for measuring the glycosylated albumin ratio comprising a boronic acid derivative to which a dye specifically detecting glycosylated albumin is provided.
  • the present invention also comprises the steps of (a) adding serum or plasma solution to albumin detection particles to which an albumin antibody specifically binding to albumin is bound; (b) administering the reactant to the albumin antibody-immobilized membrane of the cartridge; (c) administering the dye-bound boronic acid derivative to the membrane and then washing the membrane with a washing solution; and (d) measuring the optical reflectivity of the membrane with an optical instrument to calculate the ratio of total albumin and glycated albumin.
  • the optical device measures the optical reflectivity by simultaneously irradiating the wavelength of the albumin detection particle to which the albumin antibody specifically binding to total albumin is bound and the wavelength of the boronic acid derivative to which the dye is bound with a light source. do it with
  • the reagent kit for measuring the glycosylated albumin ratio includes "albumin detection particles to which an albumin antibody specifically binding to total albumin is bound” and "boronic acid derivative to which a dye specifically binding to glycosylated albumin is bound” Therefore, the concentration of each sample can be measured individually without interfering with the inherent absorption wavelength of each dye by measuring the sample with a signal of a different dye, so that the ratio of glycated albumin in the blood can be easily calculated.
  • the reagent kit for measuring the glycosylated albumin ratio contains a dye that can label total albumin and glycated albumin, respectively, it can be easily used with an optical analyzer through only administration of a washing solution to the measurement cartridge without a separate separation process There is an advantage of being able to measure glycated albumin.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram illustrating a method for preparing an albumin detection particle/antibody conjugate to which an albumin antibody specifically binding to total albumin according to the present invention is bound.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a method for measuring glycated albumin and total albumin using the reagent kit and optical instrument for measuring the glycated albumin ratio of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the K/S value of glycated albumin measured according to the present invention.
  • A K/S substitution value of glycated albumin % reflectance value measured by irradiation with blue light source
  • B K/S substitution value of total albumin % reflectance value measured by irradiation with red light source
  • C ratio of glycated albumin in total albumin K/S ratio (A/B)
  • albumin detection particle to which an antibody that specifically binds to total albumin and "boronic acid derivative to which a dye that specifically binds to glycosylated albumin is bound” is a sandwich language comprising a membrane to which an albumin antibody is immobilized.
  • albumin and glycated albumin are measured by the signals of the albumin detection particle and the dye bound to the glycated albumin, respectively, and can be measured individually without interfering with their intrinsic absorption wavelength, so the ratio of glycated albumin in the blood We wanted to confirm that it can be easily calculated.
  • a cartridge comprising (a) an albumin detection particle to which an albumin antibody is bound, (b) a boronic acid derivative bound to a dye, and (c) a membrane and an absorption pad to which the albumin antibody is immobilized is prepared, respectively, and then the albumin antibody was reacted with the albumin detection particles bound to the plasma sample, the reaction solution was absorbed into the membrane of the cartridge, and the dye-bound boronic acid derivative was reacted.Then, the cartridge was put into an optical device, and the optical reflectance of the total albumin was measured. By measuring the optical reflectivity of the glycated albumin, it was confirmed that the ratio of the glycated albumin could be measured.
  • the present invention provides an albumin detection particle bound to (a) an albumin antibody specifically binding to albumin; and (b) a reagent kit for measuring a glycosylated albumin ratio comprising a boronic acid derivative to which a dye specifically detecting glycosylated albumin is bound.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing a method for producing an albumin detection particle to which an albumin antibody specifically binding to total albumin according to the present invention is bound.
  • the albumin detection particles have different absorption wavelengths depending on the size and type of particles, but gold nanoparticles, polystyrene particles, upconversion nanoparticles and silica particles having an absorption wavelength in the range of 450 to 650 nm and silica particles having a dye therein. It can be used, and it is preferable to use a diameter of 5 to 500 nm.
  • the dyes fixed to the inside of the silica particles are Corona green, Hoechst 33258, Newport green PDX (Newport green pdx), Oil red O (Oil red O), Pseudo-purpurine (Pseudo- purpurine), calcein, etc. are preferable.
  • the albumin antibody is an antibody capable of binding to general albumin and total albumin, and as a blocker for binding to gold nanoparticles, casein, bovine serum albumin, ethanolamine (Ethanolamine) and the like may be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the blocker is a material that binds the antibody to the gold nanoparticles and then fills the non-antibody-attached portion on the surface of the gold nanoparticles, and serves to minimize non-specific reactions.
  • the buffer used for preparing the albumin detection particle to which the total albumin-binding antibody is bound is Hepes buffer (HEPES), carbonate buffer (Carbonate buffer), phosphate buffered saline (Phosphate buffered saline), Tris buffer (Tris) buffer), a glycine buffer, etc.
  • HEPES Hepes buffer
  • Carbonate buffer Carbonate buffer
  • phosphate buffered saline Phosphate buffered saline
  • Tris buffer Tris buffer
  • glycine buffer glycine buffer
  • the dye-bonded boronic acid derivative may be a yellow dye having an absorption wavelength of 400 to 430 nm or a blue dye having an absorption wavelength of 600 to 660 nm.
  • the yellow dye is tartrazine, cilenterazine, Sunset Yellow FCF, and the blue dye is xylene cyanol, toluidine blue, and the like. may be exemplified, but is not limited thereto.
  • Boronic acid derivatives for imparting selectivity to glycated albumin are 4-carboxylicphenyl boronic acid (CPBA) and 3-aminophenyl boronic acid (APBA).
  • CPBA 4-carboxylicphenyl boronic acid
  • APBA 3-aminophenyl boronic acid
  • CPBA is relatively high compared to 3-aminophenyl boronic acid
  • APBA 3-aminophenyl boronic acid
  • the cartridge for measuring the glycated albumin ratio includes an absorbent pad that absorbs a reaction solution (sample) and a membrane to which an albumin antibody is fixed, and includes a housing surrounding them.
  • the absorbent pad may be made of polypropylene, sponge, cotton, cellulose fiber, or the like, and the membrane may include glass fiber, cellulose fiber, nitrocellulose, poly Commonly used, such as ester sulfone (polyester sulfone), nylon (nylon) membrane may be used without limitation.
  • the cartridge according to the present invention can measure the glycosylated albumin ratio based on the immunological method for measuring total albumin and the boronic acid affinity method for measuring glycosylated albumin, and both the immunolateral flow measurement method and the immune vertical measurement method are applicable.
  • the present invention provides an albumin detection particle bound to an albumin antibody that specifically binds to albumin; And (b) relates to a method for measuring the glycosylated albumin ratio using a reagent kit for measuring the glycosylated albumin ratio comprising a boronic acid derivative to which a dye specifically detecting the glycosylated albumin is bound.
  • the present invention comprises the steps of: (a) adding a serum or plasma solution to albumin detection particles to which an albumin antibody specifically binding to albumin is bound; (b) administering the reactant to the albumin antibody-immobilized membrane of the cartridge; (c) administering the dye-bound boronic acid derivative to the membrane and then washing the membrane with a washing solution; and (d) measuring the optical reflectivity of the membrane with an optical instrument to calculate the ratio of total albumin and glycated albumin.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a method for measuring glycated albumin and total albumin using the reagent kit and optical instrument for measuring the glycated albumin ratio of the present invention.
  • a sample (serum or plasma solution) is reacted with “albumin detection particles to which an albumin antibody that specifically binds to total albumin is bound”, and then the reactant is applied to the membrane on which the albumin antibody of the cartridge is immobilized.
  • the dye-bound boronic acid derivative is administered to the membrane, the unbound dye is washed, and the optical reflectance of the membrane can be measured with an optical instrument.
  • the optical device simultaneously irradiates with a light source the wavelength of the albumin detection particle to which the albumin antibody specifically binding to all albumin is bound and the wavelength of the boronic acid derivative to which the dye specifically detects glycated albumin is irradiated with a light source to achieve optical reflectivity can be measured.
  • the optical device can be used without any particular limitation as long as it is capable of measuring optical reflectivity using optical properties, and the wavelength of the albumin detection particle to which the albumin antibody specifically binding to total albumin is bound and the "dye-bound boronic acid"
  • the wavelength of the derivative is simultaneously irradiated with a light source (e.g., blue (620 nm) and red (425 nm)), and the reflected light signal is measured with a photodetector to measure the amount of albumin and glycosylated albumin through an optical signal converter, respectively.
  • a light source e.g., blue (620 nm) and red (425 nm
  • the ratio of glycated albumin can be calculated by the following formula by calculating the relative amount of glycated albumin according to the total amount of albumin.
  • glycosylated albumin ratio (%) glycosylated albumin/total albumin
  • the ratio of the glycated albumin is 16% or more, diabetes can be diagnosed.
  • Example 1 Preparation of reagent kit and cartridge for measuring the glycosylated albumin ratio
  • 0.5ml of dispersed polystyrene particles were placed in a 2ml microcentrifuge tube, and 0.1M borate buffer was filled in the tube and mixed well. The solution was centrifuged until a pellet was formed, and then the supernatant was removed with a micropipette, and 0.1M borate buffer was added to the solution from which the supernatant was removed, mixed well and centrifuged. After the final centrifugation, the supernatant was removed and the pellet was released after the process of adding 1ml 0.1M borate buffer.
  • a tellurium precursor (H 2 Te) was prepared by adding 15-20 ml of 0.5 M sulfuric acid to a 0.2 g Al 2 Te 3 lump, and then bubbles were removed with nitrogen for 20 minutes, and the product was stored at 4°C.
  • silica quantum dot particles (SiQDs)
  • 1.5 ml of 48 mM (3-mercapto propyl) trimethoxysilane (MPS) was added to 10 ml of CdTe quantum dot solution, and after stirring the mixture for 2 hours, the solution was diluted with 2 L of distilled water. dialyzed for hours.
  • the quantum dot particle pellet was dispersed by adding 1ml distilled water to ultrasonic treatment for 30 minutes to complete the preparation.
  • the surface was stirred for 17 hours.
  • the antibody is immobilized in the same manner as the antibody immobilization method of the upconverted nanoparticles in 1-1-3 above. As a result of measuring the absorption wavelength of the silica particles having the dye fixed therein, it was found that it was 630 nm.
  • silica nanoparticles encapsulating a yellow dye-boronic acid derivative was prepared.
  • YD@SNP For cross-linking between YD@SNP and the carboxyl group of CPBA, the hydroxyl group (-OH) on the surface of YD@SNP was substituted with a primary amine group. That is, 100 mg of YD@SNP was put in 100 ml of ethanol, dispersed for 30 minutes using an ultrasonic disperser, and then 1 ml of APTES (3-Aminopropyltriethoxysilane) was added to a stirrer and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, using a centrifuge, washing with ethanol 4 times and DI washing 3 times under the conditions of 3800 rpm, 15 minutes, put in an oven at 60° C. and dried to prepare aminated YD@SNP (YD@SNP-NH 2 ) .
  • APTES 3-Aminopropyltriethoxysilane
  • EDC 1-ethyl-3 [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • CPBA 4-carboxylicphenyl-boronic acid
  • nanoparticles having a uniform shape and a size of about 35 to 45 nm were synthesized.
  • the housing (upper and lower case) was combined to manufacture a cartridge.
  • Example 2 Measurement of glycosylated albumin using reagent kit for measurement of glycosylated albumin ratio
  • Example 2 25 ⁇ l of the "dye-coupled boronic acid derivative" prepared in Example 1 was added to the membrane on which the albumin antibody of the cartridge was immobilized, and then absorbed for 15 seconds. After absorption, 25 ⁇ l of the washing solution was administered to the cartridge and washed for 15 seconds.
  • the cartridge was placed in an optical instrument (Epithod ® 616 analyzer, Dixgen), and the optical reflectance of total albumin in red and the optical reflectance of glycated albumin in blue were measured.
  • the ratio (%) of glycated albumin was determined by comparing the optical reflectance of glycated albumin and total albumin measured in 2-3.
  • the % reflectance (%R) measured from each wavelength was used by converting the K/S value, which is a quantitative indicator of how much colored material is present on the surface, and converting the % reflectivity into K/S value.
  • the formula to do is as follows:
  • the % reflectance value obtained by irradiating a blue light source (620 nm) representing the amount of glycated albumin and the % reflectance value obtained from a red light source (425 nm) representing the amount of total albumin are respectively K/S values It was possible to measure the amount of glycated albumin by calculating their ratio after substitution with .
  • Figure 3 (c) is a value obtained by substituting K/S for the reflectance of glycated albumin measured with a blue light source by a value obtained by substituting a K/S value for the reflectivity of all albumin measured with a red light source. It is a graph showing the ratio of (K/S ratio value). From this, it was found that as the ratio of glycated albumin contained in the blood increased, the amount of glycated albumin (K/S ratio value) that was bound to the dye-bound boronic acid derivative was relatively increased.
  • albumin antibody-bound polystyrene particles may be used instead of “albumin antibody-bound gold nanoparticles” It was found that the same results were obtained in both cases.
  • the method for measuring glycated albumin according to the present invention can be widely used for diagnosing diabetes.
  • glycated albumin can be measured quickly and simply, so it is useful for diabetic patients.

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Abstract

본 발명은 당뇨병 유무를 진단할 수 있는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알부민 항체가 결합된 금 나노입자 및 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것이다. 본 발명의 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트는 (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 포함한다. 본 발명의 따른 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트는 "전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자"와 "당화 알부민과 특이적으로 결합하는 염료가 결합된 보론산 유도체"를 포함하기 때문에 시료를 각각 다른 염료의 신호로 측정하여 염료마다의 고유의 흡수파장을 방해하지 않고, 각 시료의 농도를 개별적으로 측정할 수 있으므로, 혈중 당화 알부민의 비율을 용이하게 계산할 수 있다.

Description

당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법
본 발명은 당뇨병 유무를 진단할 수 있는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알부민 항체가 결합된 금 나노입자 및 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것이다.
당뇨병은 혈당조절역할을 하는 인슐린의 이상으로 인해 발생하는 대사질환으로, 인슐린을 생성하는 세포가 면역 시스템의 이상으로 인해 파괴되어 부족할 때 발생되는 1형 당뇨와 인슐린의 분비량이 부족하거나 효과적으로 사용되지 못함에 따라 발생되는 2형 당뇨 등 발병 원인에 따라 분류된다.
당뇨병은 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 혈당관리 조절을 실패할 경우 당뇨망막증, 신장질환, 족부병변 등의 합병증이 유발될 수 있기 때문에 당뇨병 환자들의 혈당 관리에 대한 중요성은 증가되고 있다.
종래의 당뇨병 측정 마커는 포도당을 사용하였으나, 식전 식후의 혈당 값 변동이 심하기 때문에 측정하는 시간에 따른 오차 및 환자의 컨디션에 따른 변동이 직접적으로 나타날 수가 있다는 문제점이 있다. 또한 포도당 측정에 사용하는 포도당산화효소는 pH나 혈액 내에 포함된 다른 방해물질 등과 같은 측정하는 환경영향에 취약하며, 과산화수소를 발생시킴에 따라 효소의 활성에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 최근에는 포도당보다 정확하게 측정할 수 있고, 보다 안정적인 혈당 측정용 바이오 마커로써 당화혈색소(glycated hemoglobin, HbA1c)를 이용하고 있다. 당화혈색소는 생성되면 적혈구가 소멸되기까지는 안정하므로 2~3개월의 평균혈당치를 나타내는 지표로 사용되므로, 실제 당뇨병의 진단 및 치료 경과 추이를 조사하는데 활용된다. 하지만 당화혈색소 측정법은 말기 만성신부전 등과 같이 혈당이 꾸준히 유지되지 못하는 일부의 질환자나 적혈구에 이상이 있는 환자에게는 적합하지 않다고 알려져 있다.
알부민은 혈액뿐 만 아니라 주요 장기와 체액에 존재하는 단백질로, 혈액의 포도당 농도에 따라 포도당이 결합된 당화 알부민이 형성되기도 한다. 알부민은 혈색소에 비해 포도당의 결합률이 10배 정도 높아서 당화 알부민은 당화혈색소보다 혈당 변화에 더욱 민감하게 반응하고, 적혈구 수명이 90일 정도인 것에 비하여 알부민은 15~20일 정도로 짧아서, 최근 2주 동안 혈중 포도당 수준의 평균치를 모니터링할 수 있다. 따라서, 혈당이 꾸준히 유지되지 않는 말기 만성신부전 환자, 철 결핍성 빈혈 환자, 변종 헤모글로빈을 가진 당뇨환자에서 중요한 혈당 컨트롤 지표로 유용하다.
한국공개특허 제2004-0018893호는 면역크로마토그래피 방법을 이용하여 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법을 개시하였다. 니트로셀룰로즈 멤브레인에 혈색소 항체, 당화혈색소가 포함된 혈색소, 당화혈색소 항체를 샌드위치방식으로 결합시켜 전체 혈색소는 혈색소의 적색을 흡수분광법으로, 당화혈색소는 당화혈색소 항체에 부착시킨 형광염료를 형광분석법을 통해 각각을 정량한 후 비율을 측정하는 방식을 채택하고 있다. 당화혈색소 항체는 혈색소 항체에 비해 그 가격이 월등히 높아 키트의 단가를 높인다. 또한, 혈색소의 흡광도와 당화혈색소에 부착된 염료의 형광도를 각각 측정하여 그 비율을 측정하는 방법은 다른 방식으로 각각 측정해야하는 점과 비교적 고가의 형광 분석기를 이용해야한다는 단점이 있다.
한국등록특허 제2018-0032513호는 "염료를 캡슐화한 실리카 나노입자-보론산"의 반사도를 측정함으로써 혈액 또는 혈장 내 알부민 중 당화 알부민의 비율을 측정하는 방법을 개시하였다. 당화 알부민에 선택적으로 결합하는 염료를 이용하는 점은 비율 측정에 도움이 될 수 있지만, 다른 카트리지에서 반응한 전체 알부민의 신호와 당화 알부민의 신호를 각각 측정하여 그 비율을 계산함으로써 발생하는 오차가 클 수 있다.
Ikeda 등은 알부민 항체 및 페록시다아제 효소와 컨주게이션된 보론산을 이용한 효소-보론산 면역측정법(ELIBA)을 개시하였다 (Ikeda et al, Clin Chem. 44(2):256-263, 1998). 이들 방법은 높은 선택성 및 정확성을 보였으나, 많은 시간(30~90분)이 소요되며 형광측정이 가능한 기기가 필요하다는 점으로 인해 저가 래피드 키트로의 개발에는 제한이 있다. 그러므로 보다 간단하면서도 정확하게 당화 알부민을 측정하는 방법의 개발이 절실하다.
본 발명의 목적은 당화 알부민 비율을 간단하고 정확하게 측정할 수 있는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자와 당화 알부민을 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체는 서로 간섭받지 않는 흡수파장을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 검출입자는 광학적 측정이 가능한 450~650 nm 대의 흡수파장을 갖는 금 나노입자, 폴리스티렌 입자, 양자점 입자, 상향전환 나노입자 및 내부에 염료가 고정된 실리카 입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 검출입자는 5~500nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 염료가 결합된 보론산 유도체는 400~430nm의 흡수파장을 갖는 황색 계열 염료 또는 600~660nm의 흡수파장을 갖는 청색 계열 염료인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자에 혈청 또는 혈장용액을 넣고 반응시키는 단계; (b) 반응물을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 투여하는 단계; (c) 염료가 결합된 보론산 유도체를 상기 멤브레인에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및 (d) 광학기기로 멤브레인의 광학 반사도를 측정하여 전체 알부민 및 당화 알부민의 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율의 측정방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 광학기기는 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자의 파장 및 염료가 결합된 보론산 유도체의 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 따른 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트는 "전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자"와 "당화 알부민과 특이적으로 결합하는 염료가 결합된 보론산 유도체"를 포함하기 때문에 시료를 각각 다른 염료의 신호로 측정하여 염료마다의 고유의 흡수파장을 방해하지 않고, 각 시료의 농도를 개별적으로 측정할 수 있으므로, 혈중 당화 알부민의 비율을 용이하게 계산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트는 전체 알부민과 당화 알부민을 각각 표지하여 구별할 수 있는 염료를 포함하고 있으므로, 별도의 분리과정 없이 측정 카트리지에 세척액 투여만을 통해 광학분석기로 간단하게 당화 알부민을 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자/항체 결합체의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
도 2는 본 발명의 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 광학기기를 이용하여 당화 알부민 및 전체 알부민을 측정하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 3은 본 발명에 따라 측정된 당화 알부민의 K/S 값을 나타낸 그래프이다.
(A: 청색광원 조사로 측정된 당화 알부민 %반사도 값의 K/S 치환값, B: 적색광원 조사로 측정된 전체 알부민 %반사도 값의 K/S 치환값, C: 전체 알부민 중의 당화 알부민의 비율을 나타내는 K/S ratio(A/B))
본 발명에서는 "전체 알부민과 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 알부민 검출입자"와 "당화 알부민과 특이적으로 결합하는 염료가 결합된 보론산 유도체"를 알부민 항체가 고정된 멤브레인을 포함하는 샌드위치 어세이에 적용시킬 경우, 알부민과 당화 알부민을 각각 알부민 검출입자 및 당화 알부민과 결합된 염료의 신호로 측정하여, 이들의 고유 흡수파장을 방해하지 않고 개별적으로 측정할 수 있으므로, 혈중 당화 알부민의 비율을 용이하게 계산할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 (a) 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자, (b)　염료가 결합된 보론산 유도체 및 (c）알부민 항체가 고정된 멤브레인과 흡수패드를 포함하는 카트리지를 각각 제조한 다음, 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자와 혈장샘플을 반응시키고, 반응액을 카트리지의 멤브레인에 흡수시키고, 염료가 결합된 보론산 유도체를 반응시켰다. 그 후, 카트리지를 광학기기에 넣고, 전체 알부민의 광학 반사도와 당화 알부민의 광학 반사도를 측정함으로써, 당화 알부민의 비율을 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 검출입자는 입자의 크기 및 종류에 따라 흡수파장이 다르지만 450~650nm 대의 흡수파장을 갖는 금 나노입자, 폴리스티렌 입자, 상향전환 나노입자 및 내부에 염료가 고정된 실리카 입자를 이용할 수 있으며, 직경은 5~500nm인 것을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 실리카 입자의 내부에 고정된 염료는 코로나 그린(Corona green), 호크스트 33258(Hoechst 33258), 뉴포트 그린 PDX (Newport green pdx), 오일 레드 O(Oil red O), 슈도푸르푸린(Pseudo-purpurine), 칼세인(Calcein) 등인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 알부민 항체는 일반 알부민 및 전체 알부민과 결합할 수 있는 항체이며, 금 나노입자와 결합을 위한 블록커(Blocker)로는 카제인(Casein), 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin), 에탄올아민(Ethanolamine) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
참고로, 상기 블록커는 금 나노입자에 항체를 결합시킨 뒤 금 나노입자 표면에 항체가 붙지 않은 부분을 채우는(Blocking) 물질로서, 비특이적 반응을 최소화시키는 역할을 한다.
또한, 전체 알부민과 결합하는 항체가 결합한 알부민 검출입자 제조에 사용되는 버퍼(Buffer)는 헤페스 버퍼(HEPES), 카보네이트 버퍼(Carbonate buffer), 인산완충생리 식염수(Phosphate buffered saline), 트리스 버퍼(Tris buffer), 글라이신 버퍼(Glycine buffer) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 염료가 결합된 보론산 유도체는 400~430nm의 흡수파장을 갖는 황색 계열 염료 또는 600~660nm의 흡수파장을 갖는 청색 계열 염료를 이용할 수 있다. 상기 황색 계열 염료로는 타르트라진(Tartrazine), 실렌테라진(Coelenterazine), 선셋 옐로우 FCF(Sunset Yellow FCF), 청색 계열 염료로는 자일렌 사이아놀(xylene cyanol), 톨루이딘 블루(toluidine blue) 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당화 알부민에 대한 선택성을 부여하기 위한 보론산 유도체는 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylicphenyl boronic acid, CPBA)과 3-아미노페닐 보론산(3-Aminophenyl boronic acid, APBA)를 사용하는 것이 바람직한데, 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylicphenyl boronic acid, CPBA)는 상대적으로 3-아미노페닐 보론산(3-Aminophenyl boronic acid, APBA)에 비하여 상대적으로 열적 안정성이 높기 때문에 CPBA를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 당화 알부민 비율 측정용 카트리지는 반응액(시료)을 흡수하는 흡수패드 및 알부민 항체가 고정된 멤브레인이 접합되어 있고, 이들을 둘러싼 하우징을 포함한다.
상기 흡수패드는 폴리프로필렌(polypropylene), 스폰지, 솜, 셀룰로즈 섬유(cellulose fiber) 등을 이용할 수 있으며, 상기 멤브레인은 유리 섬유(glass fiber), 셀룰로즈 섬유(cellulose fiber), 니트로셀룰로즈(Nitrocellulose), 폴리에스테르 술폰(polyester sulfone), 나일론(nylon) 멤브레인 등 통상적으로 사용되는 것을 제한 없이 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 카트리지는 전체 알부민을 측정하는 면역법과 당화알부민을 측정하는 보론산친화법을 기반으로 당화 알부민 비율을 측정할 수 있으며, 면역측면유동 측정법 또는 면역 수직측정법 모두 적용이 가능하다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자에 혈청 또는 혈장용액을 넣고 반응시키는 단계; (b) 반응물을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 투여하는 단계; (c) 염료가 결합된 보론산 유도체를 상기 멤브레인에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및 (d) 광학기기로 멤브레인의 광학 반사도를 측정하여 전체 알부민 및 당화 알부민의 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율의 측정방법에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 광학기기를 이용하여 당화 알부민 및 전체 알부민을 측정하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 시료(혈청 또는 혈장용액)을 "전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자"와 반응시킨 다음, 반응물을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 투여하고, 염료가 결합된 보론산 유도체를 상기 멤브레인에 투여한 후, 결합되지 않은 염료를 세척하고, 광학기기로 멤브레인의 광학 반사도를 측정할 수 있다.
이때, 상기 광학기기는 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자의 파장 및 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체의 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정할 수 있다.
상기 광학기기는 광학 특성을 이용하여 광학 반사도를 측정할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자의 파장 및 "염료가 결합된 보론산 유도체의 파장을 동시에 광원(예:청색 (620nm), 적색(425nm)으로 조사하고, 반사된 광신호를 광검출기(photodetector)로 측정하여 광신호 변환기를 통해 알부민 및 당화 알부민의 양을 각각 측정할 수 있다.
당화 알부민의 비율은 전체 알부민 양에 따른 당화 알부민의 상대적인 양을 다음 식으로 계산할 수 있다.
* 당화 알부민 비율(%)=당화 알부민/전체 알부민
일반적으로 상기 당화 알부민의 비율이 16% 이상인 경우 당뇨병으로 진단할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트 및 카트리지 제조
1-1-1: 알부민 항체가 결합된 금 나노입자 제조
금 나노입자(colloidal gold) 10 ml과 알부민 항체용액(Abcam, ab10241) 200 μl를 자성교반기로 1시간동안 혼합하였다. 혼합 후 0.01M 에탄올아민(Ethanolamine) 200 μl를 추가로 투입한 후 1시간동안 자성교반기로 혼합 및 반응시켰다. 반응 후, 원심분리기를 이용하여 13,000 ×g, 30분의 조건으로 3회 카보네이트 버퍼로 세척 한 후 4℃ 냉장보관 하였다. 제조된 금 나노입자의 흡수파장을 측정한 결과 525 nm임을 알 수 있었다.
1-1-2: 알부민 항체가 결합된 폴리스티렌 입자 제조
분산된 폴리스티렌 입자 0.5ml을 2ml 마이크로원심분리 튜브에 넣고 여기에 0.1M 보레이트 버퍼(Borate buffer)를 튜브에 채운 후 잘 섞었다. 이 용액을 펠렛(pellet)이 생길 때까지 원심분리 한 후 마이크로 피펫으로 상층액을 제거하고, 상층액이 제거된 용액에 다시 0.1M 보레이트 버퍼를 첨가한 후 잘 섞어 원심분리시켰다. 마지막 원심분리 후 상층액 제거 및 1ml 0.1M 보레이트 버퍼 투입 과정을 진행한 후 펠렛을 풀어줬다.
위 용액에 1 mg/ml의 HSA 항체를 400μl 첨가한 후 상온에서 17시간동안 믹서(mixer)로 반응시켰다. 반응 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 10 mg/ml의 농도로 BSA가 첨가된 0.1M 보레이트 버퍼 1ml를 넣어 펠렛을 재 분산시켰다. BSA가 첨가된 용액을 30분동안 상온에서 믹서(mixer)로 반응했다. 5~6분동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 10 mg/ml BSA, 0.1% NaN 3, 5% glycerol이 포함된 0.1M PBS를 1ml 넣어 펠렛을 풀어주었다. 제조된 폴리스티렌 입자의 흡수파장을 측정한 결과 475 nm임을 알 수 있었다.
1-1-3: 알부민 항체가 결합된 양자점 입자 제조
0.985 g의 과염소산카드뮴 육수화물(Cd(ClO 4) 2·6H 2O)와 125mL의 증류수를 3구 플라스크에 넣고 녹인 후, 5.7mM의 thioglycolic acid(HSCH 2COOH, TGA)를 넣고 교반하였다. 이후 1M NaOH로 용액이 투명해질 때까지 pH를 적정하였다. 다음으로 100℃ 이하에서 용액을 환류시켜 TGA를 CdTe 나노결정으로 대체시키고 난 후, 질소가스로 20분간 기포를 제거하였다.
0.2g의 Al 2Te 3 덩어리에 0.5M 황산을 15~20ml을 첨가하여 텔루륨 전구체(H 2Te)를 제조한 후 질소로 20분간 기포를 제거하고, 생성물은 4℃에서 보관하였다.
실리카 양자점 입자(SiQDs)를 제조하기 위해, 1.5ml의 48mM (3-mercapto propyl)trimethoxysilane(MPS)을 10ml CdTe 양자점 용액에 첨가하고, 2시간동안 혼합액을 교반한 후, 용액을 2L의 증류수로 1시간동안 투석하였다.
이후 혼합액에 2ml의 sodium silicate를 첨가하여 실리카의 중합반응을 시작하고 12시간동안 표면 silica 껍질의 성장을 진행하였고, 2ml의 에탄올을 첨가하여 반응 종료 후 원심분리(15,110 ×g, 4℃, 2분)하여 상등액을 제거하였다. 양자점 입자 펠렛을 1ml 증류수를 넣어 30분간 초음파 처리하여 분산시켜 제조를 완료하였다.
양자점 입자 용액 100 μl와 400μg/mL의 농도의 항체용액 100μL를 37℃에서 30분간 혼합하여 항체를 양자점 입자에 부착시키고, 원심분리(15110 ×g, 4℃, 10분)하여 반응하지 않은 항체를 제거하고 양자점 입자-항체 복합체의 펠렛을 200μL PBS로 분산시켜 4℃에서 보관하여 제조를 완료하였다. 제조된 양자점 입자의 흡수파장을 측정한 결과 590 nm임을 알 수 있었다.
1-1-4: 알부민 항체가 결합된 내부에 염료가 고정된 실리카 입자 제조
사이클로헥세인(cyclohexane) 150ml, 트리톤 X-100 33.5 ml 및 n-헥산올(n-hexanol) 35.3 ml을 포함하는 1L 둥근 바닥 플라스크에 자일렌 사이아놀과 실리카 전구체의 교반 반응물(Dye-Pre_Si) 용액 <대한민국 등록특허 10-2055341 실시예 1-1-1> 9.25 ml 및 TEOS(tetraethyl orthosilicate) 2.7 ml을 넣고 교반기를 이용하여 1시간 동안 균일하게 혼합시켰다.
이후 15~30% 암모니아수 (NH 4OH) 1.5 ml을 넣고, 상온에서 20~30시간 동안 반응시킨 후 에탄올 300ml을 첨가하여 반응을 종결하고, 원심분리기를 이용하여 3900 rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 60℃ 오븐에 넣고 건조시켜 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하였다.
폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)을 1:100 비율로 혼합한 용액 100μl을 에탄올에 분산된 "내부에 염료가 고정된 실리카 나노입자" 5ml과 혼합한 후 17시간동안 교반하여 표면개질된 실리카나노입자를 제조한 후 위 1-1-3에서 상향전환 나노입자의 항체고정화 방법과 동일하게 항체를 고정화한다. 제조된 내부에 염료가 고정된 실리카 입자의 흡수파장을 측정한 결과 630 nm임을 알 수 있었다.
1-2: 염료가 결합된 보론산 유도체 제조
한국등록특허 제2029798호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 황색염료를 캡슐화한 실리카 나노입자-보론산 유도체를 제조하였다.
1-2-1: 황색 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자(YD@SNP) 합성
사이클로헥세인(cyclohexane) 135.0㎖, 트리톤 X-100 31.8㎖, n-헥산올 (n-hexanol) 32.4㎖, 0.1M 타르트라진 6.12㎖, TEOS(tetraethyl orthosilicate) 2.7㎖을 1L 둥근 바닥 플라스크에 넣고 교반기를 이용하여 1시간 동안 균일하게 혼합시켰다. 25~30% 암모니아수(NH 4OH) 1.08㎖를 넣고 상온에서 24시간 동안 반응시킨후 에탄올 200㎖을 첨가하여 반응을 종결하고, 원심분리기를 이용하여 3800rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 60℃ 오븐에 넣고 건조시켰다.
1-2-2: 황색 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자(YD@SNP)의 아민화
YD@SNP와 CPBA의 카르복실기의 교차 결합을 위하여, YD@SNP의 표면에 있는 수산화 그룹(-OH)을 1차 아민기로 치환하였다. 즉, YD@SNP 100㎎을 100㎖의 에탄올에 넣고, 초음파 분산기를 이용하여 30분간 분산시킨 후, APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane) 1㎖을 교반기에 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 원심분리기를 이용하여 3800rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 60℃ 오븐에 넣고 건조시켜 아민화된 YD@SNP (YD@SNP-NH 2)를 제조하였다.
1-2-3: 아민화된 황색 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자(YD@SNP-NH 2) 및 CPBA의 접합
당화 알부민과의 결합능을 부여하기 위하여, 카르복실기와 1차 아민기를 연결하는 교차결합제인 1-에틸-3[3-디메틸 아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 이용한 카르보디이미드 교차 커플링 방법으로 당화 알부민 결합물질인 4-카르복실릭페닐보론산(4-carboxylicphenyl-boronic acid, CPBA)을 아민화된 황색 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자(YD@SNP-NH 2) 표면에 고정화시켰다.
즉, 빛이 차단된 환경에서, CPBA의 카르복실 작용기를 활성화시키기 위하여 3.48mM CPBA를 0.1M의 MES(2-(Morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액 (pH 6.0)에 녹이고 최종농도 1mM의 EDC를 넣고 30분간 교반하며 반응시킨 후, YD@SNP-NH 2를 첨가한 후 10~20시간 동안 교반기에서 상온 반응시켰다.
반응이 완료된 후, 원심분리기를 이용하여 3800rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 상온 또는 동결건조하여 황색 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자-보론산(YD@SNP-CPBA)를 제조하였다.
주사전자현미경과 동적광산란법을 이용하여 분석한 결과, 입자의 형태가 균일하고, 크기가 약 35~45nm인 나노입자가 합성된 것을 확인할 수 있었다.
1-3: 항체가 고정되지 않은 멤브레인과 하우징의 결합을 통한 카트리지 제조
멤브레인(니트로셀룰로오즈)과 흡수패드(셀룰로즈 섬유)를 접합시킨 후, 하우징(상부 및 하부 케이스)을 결합하여 카트리지를 제조하였다.
1-4: 당화 알부민 비율 측정용 카트리지 제조
1-3에서 제조된 카트리지의 멤브레인에 알부민 항체용액(abcam, ab83465)을 피펫으로 15ul 로딩하고 37℃ 건조오븐에서 10시간동안 건조시켜서 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 제조하였다.
실시예 2: 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 측정
2-1: 전체 알부민과 특정 시약의 반응
실시예 1에서 제조된 "알부민 항체가 결합된 금 나노입자" 200μl을 투명한 튜브에 넣고, 기준시약(아사히 가세이 GA-L)을 이용하여 올림푸스 AU400 분석기로 당화 알부민의 비율(%)을 측정한 혈장 샘플 5μl를 첨가한 후, 10회 흔들어 혼합하였다. 반응액 25μl을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 올려 15초 동안 흡수시켰다.
2-2: 당화 알부민과 특정 시약의 반응
실시예 1에서 제조된 "염료가 결합된 보론산 유도체" 25μl을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 투입한 후 15초 동안 흡수시켰다. 흡수가 끝난 카트리지에 세척액 25μl을 투여하여 15초 동안 세척시켰다.
2-3: 전체알부민과 당화 알부민 측정
카트리지를 광학기기(Epithod ®616 analyzer, 딕스젠)에 넣고, 적색의 전체 알부민의 광학 반사도와 청색의 당화 알부민의 광학 반사도를 측정하였다.
2-4: K/S값을 이용한 당화 알부민 측정
2-3에서 측정된 당화 알부민과 전체 알부민의 광학 반사도를 비교하여 당화 알부민의 비율(%)을 결정하였다. 각각의 파장으로부터 측정된 %반사도(%R)는 얼마만큼의 색을 띄는 물질이 해당 표면에 존재하는지에 대한 정량지표인 K/S값으로 변환하여 사용하였으며, %반사도를 K/S값으로 변환하는 공식은 아래와 같다.
K/S=
Figure PCTKR2020018295-appb-img-000001
(K=흡수계수, S=산란계수)
도 3에 기재된 바와 같이, 당화 알부민의 양을 대변하는 청색 광원(620nm)을 조사하여 얻은 %반사도 값과 전체 알부민의 양을 대변하는 적색 광원(425nm)으로부터 얻은 %반사도 값을 각각 K/S값으로 치환한 뒤 이들의 비율을 계산함으로써 당화 알부민의 양을 측정할 수 있었다. 도 3의 (c)는 청색광원으로 측정되는 당화 알부민의 반사도를 K/S로 치환한 값을 적색광원으로 측정되는 전체 알부민의 반사도를 K/S값으로 치환한 값으로 나눠 전체 알부민내 당화 알부민의 비율(K/S ratio 값)을 나타낸 그래프이다. 이로부터, 혈액 내에 포함된 당화 알부민의 비율이 증가함에 따라 상대적으로 염료가 결합된 보론산 유도체와 결합된 당화 알부민의 양(K/S ratio 값)이 높아지는 것을 알 수 있었다.
또한, "알부민 항체가 결합된 금 나노입자" 대신에 "알부민 항체가 결합된 폴리스티렌 입자", "알부민 항체가 결합된 양자점" 및 "알부민 항체가 결합된 내부에 염료가 고정된 실리카 입자"를 이용할 경우에도 동일한 결과가 나오는 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 당화 알부민의 측정방법은 당뇨병 진단에 널리 활용될 수 있다는 것을 확인하였다.
이상 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 이용하면, 신속하고 간단하게 당화 알부민을 측정할 수 있으므로, 당뇨병 환자들에게 유용하다.

Claims (8)

  1. (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및
    (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자와 당화 알부민을 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체는 서로 간섭받지 않는 흡수파장을 갖는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알부민 검출입자는 광학적 측정이 가능한 450~650nm 대의 흡수파장을 갖는 금 나노입자, 폴리스티렌 입자, 양자점 입자, 상향전환 나노입자 및 내부에 염료가 고정된 실리카 입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알부민 검출입자는 5~500nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 염료가 결합된 보론산 유도체는 400~430nm의 흡수파장을 갖는 황색 계열 염료 또는 600~660nm의 흡수파장을 갖는 청색 계열 염료인 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트.
  6. (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자; 및 (b) 당화 알부민을 특이적으로 검출하는 염료가 결합된 보론산 유도체를 포함하는 당화 알부민 비율 측정용 시약 키트를 이용한 당화 알부민 비율의 측정방법.
  7. (a) 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자에 혈청 또는 혈장용액을 넣고 반응시키는 단계;
    (b) 반응물을 카트리지의 알부민 항체가 고정된 멤브레인에 투여하는 단계;
    (c) 염료가 결합된 보론산 유도체를 상기 멤브레인에 투여한 후 세척액으로 세척하는 단계; 및
    (d) 광학기기로 멤브레인의 광학 반사도를 측정하여 전체 알부민 및 당화 알부민의 비율을 계산하는 단계를 포함하는 당화 알부민 비율의 측정방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 광학기기는 전체 알부민과 특이적으로 결합하는 알부민 항체가 결합된 알부민 검출입자의 파장 및 염료가 결합된 보론산 유도체의 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정하는 것을 특징으로 하는 당화 알부민 비율의 측정방법.
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