JP2732124B2 - 固相免疫検定用品及び該品を利用した検定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に免疫検定法、特に有機染料を利用し
て固相免疫検定を行うのに使用する物品に関する。さら
に、本発明はかかる物品を使用するための免疫法、免疫
物品の製造法および物品を組み入れた免疫検定を行うキ
ツトに関する。

最も広い意味において、免疫検定法は、生物流体中の
免疫反応性成分をその特定の免疫学的片方との結合を測
定することによつて検出する。免疫反応性成分はこの場
合抗原又は抗体にすることができる、従つてその免疫学
的片方はかかる成分に対して特定の抗体又は抗原であ
る。免疫反応性成分又はその片方は、さらにその免疫学
的物質を壊さない別の物質に結合される。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

抗原−抗体の複合体の存在を検出するために広範囲の
方法が開発されている。放射性免疫検定法においては、
未知の抗原に存在する流体の既知量の放射性標識化抗原
を添加する。この流体はその抗原に対して特定の抗体を
含有する別の混合体との反応を受ける。その標識化およ
び未標識化抗原は抗体と流体中のそれらの相対的濃度に
比例して反応する。抗体に結合した抗原を遊離抗原から
分離した後、抗原−抗体の放射能を測定する。

酸素に結合した免疫反応において、反応性標識はアル
カリ性のホスフアターゼ又はペルオキシダーゼのような
酵素と置換される。未知試料に存在する抗原又は抗体の
量は時間の経過後に生成した酸素反応生成物の量を測定
することによつて決定される。この量は試験試料に存在
する抗体の量に比例する。

高感度及び特異性を有する免疫検定試験を得るため
に、固相免疫検定法が開発された。この方法は、生物流
体中の抗原−抗体複合体の成分を反応混合体中の他の成
分から分離させる。固相免疫検定法において、免疫反応
の一成分である抗原又は抗体は固相支持体の表面に固定
化される。抗原又は抗体を固相支持体へ直接固定化する
ために多数の方法が開発されている。かかる方法の１つ
は、トリアジニル結合基を用いて抗原又は抗体を固相支
持体へ固定化している；別の方法はヒドロキシ低級アル
キルアミンを使用して重合体の固相支持体に抗原又は抗
体をコーテイングする；第３の方法はグルタルアルデヒ
ドを利用して抗原又は抗体を固定化している。これらの
方法は抗原又は抗体の直接固定化には有用であることが
証明されたが、赤血球、白血球、リンパ球、血小板又は
他の哺乳類の細胞のような全細胞の固定化における有効
性が示されていない。抗原がこの種の細胞の表面に存在
したり、吸着されることは周知である。血液グループお
よび感染性疾病作因、特に血液の細胞成分に直接影響を
与えるこれらの抗原の存在を測定することが有用になつ
てきた。固相支持体へ哺乳類の細胞全体を固定すること
によつて、この種の免疫検定の結果により著しい特異性
を得ることができる。

全細胞を固相支持体へ固定化するために、種々の試み
がされてきた。１つの方法は化学的な方法であつて、細
胞を固相支持体へ共有結合的に結合させる。この方法
は、カツプリング剤が高コストであり、かつ必要な共役
条件下で細胞の免疫学的完全性を壊わすことなく固定化
することができる細胞の種類の数が限定されるので、細
胞の固定化における用途が限定されることがわかつた。
この化学物質は、細胞を支持体へ橋かケする分子のいず
れかの端部にアルデヒド基を有する。この方法は細胞を
固相支持体へ結合させることにおいてある程度有効であ
るが、グルタルアルデヒドが細胞の表面を変性させて、
免疫反応を妨害することがわかつている。

全ての細胞を固相支持体へ固定化する最適の方法は、
支持体の表面に細胞の層を作るために共有結合よりもむ
しろ吸着を利用する。支持体上への細胞の吸着は、細胞
表面の組成、電荷および加齢に左右される。さらに、支
持体材料の組成、電荷および形状が細胞の支持体への付
着に影響を与える。細胞の吸着に伴う固有の問題点は、
細胞の支持体への結合が比較的弱いことである。この問
題は、これらの検定法を行う大部分の病院および研究所
において利用される自動化洗浄装置の着手のために誇張
される。自動化洗浄装置の使用は、必要でないならば、
支持体の反復処理による検定の汚染の危険を低減させる
ことが望ましい。さらに、ある種の血液に関係した病気
が高感染性であるために、試験を行う技術者のリスクは
直接処理が少ない方法によつて低減される。また、自動
化装置は、医者、等が診断をして、できる限り速く処置
を開始することができる最も早い時間内に多量の試験を
行うために必要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

現在最も広く用いられている吸着法は、細胞をポリス
チレン支持体へ固定化するためにポリ−Ｌ−リシンを利
用している。ポリ−Ｌ−リシンと支持体間の結合はイオ
ン的であつて、細胞と固相支持体間の結合は比較的弱
い。この弱い結合は、自動化洗浄装置が使用されるとき
に吸着手段としてのポリ−Ｌ−リシンの利用を減じるこ
とになる。ポリ−Ｌ−リシンと細胞間の結合が、洗浄工
程中に細胞が除去されるのを防ぐには余りにも弱過ぎ
る。支持体上に層を結合する細胞のある量がかくの如く
除去されると、支持体自身又はカツプリング剤への試料
中の他の抗原又は抗体の非特異的結合のために、検定の
精度が著しく低下する。

従つて、本発明の主目的は、自動化洗浄装置との併用
に適する免疫検定を行う物品および方法を提供すること
である。

さらに、本発明の目的は、極めて特異性の免疫検定を
行うために細胞表面の免疫成分を完全に維持する固相支
持体へ細胞を結合させる吸着法を利用する方法を提供す
ることである。

本発明の別の目的は、比較的低コストで固相支持体へ
細胞を結合させる吸着法を利用して、生物学的流体中の
抗原又は抗体の存在を検出する方法を提供することであ
る。

さらに、本発明の目的は、現在既知の方法よりも強固
に支持体へ細胞を結合させるところの哺乳類細胞の全て
を固相支持体へ吸着させる方法を提供することである。

さらに、本発明の目的は、自動化洗浄機を使用すると
きに支持体に付着された細胞の単層からの細胞の損失を
著しく低減させるように全細胞を強固に結合させること
ができる固相支持体を提供することである。

本発明の目的は、上記目的の全てを達成する免疫検定
に使用する固体支持体を提供することである。

本発明の別の目的は、発明の目的を実施する固相支持
体を組み込んだ固相免疫検定法を行うキツトを提供する
ことである。

〔課題を解決するための手段〕

我々は、正味正の電荷を有し疎水性芳香族環構造をす
る有機染料が生物細胞又は細胞断片のような免疫学的反
応性成分の固定化に利用することができて、固相免疫検
定を行うのに有利な方法および物品を提供することを発
見した。最初に有機染料を固相支持体に塗工する。捕乳
類の細胞、赤血球、リンパ球、白血球又は血小板のよう
な正味負の電荷を有する免疫反応性成分が有機染料と接
触するとき、その成分が染料に非共有結合によつて固定
化されるようになる。免疫反応性細胞と有機染料間のこ
の結合は、大部分の自動化洗浄機によつて洗浄を受ける
ときに細胞単層の崩壊に抵抗する十分な強さを有する。

〔実施例〕

固相免疫検定法は固体支持体構造として広配列の品物
を利用する。その支持体はしばしば材料の試験管、ビー
ド、シート、ペトリ皿、膜又はミクロタイター・プレー
トの形を採る。他の型式の支持体や支持体の形態も本発
明の目的を達成するのに有用で同様に適用することがで
きる。

固相支持体はポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩
化ビニル又はナイロンのような有機重合体で構成するこ
とができる。有機染料で着色できる材料は全て、ガラス
のような有機重合体以外の固相免疫検定用支持体として
利用できる。

本発明による免疫検定を実施する最適の固相支持体は
複数の凹部を有するミクロタイター・プレートである。
ミクロタイター・プレートは有機重合体製が望ましく、
ポリスチレン製が最適である。

利用する固相支持体は慎重に取り扱い、免疫検定に影
響を与えるタンパク質の汚染がないように保つ必要があ
る。

本発明に有用な染料は正味正の電荷を有しかつ疎水性
芳香環構造を有する有機染料である。正味正の電荷を有
し固相支持体へ付着するような疎水性芳香環構造を有す
る染料はいずれも本発明の目的を達成する有用性を有す
る。

免疫検定を行うために固相品の調整に有用な多くの有
機染料は種々のクラスに分類することができる。特に有
用なクラスの染料の１つは正味正の電荷を有するアゾ染
料である。アゾ染料はアゾ結合、−Ｎ＝Ｎ−の存在を特
徴とし、２つの芳香族環を結合させる。この結合は一般
に強く着色される化合物を生成する。芳香族環はしばし
ばベンゼン又はナフタレン環である。アゾ基、−Ｎ＝Ｎ
−は化合物において１回以上生じうる。モノアゾ染料は
次の基本構造を有する： Ｒ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ ここでＲは芳香族環構造である。モノアゾ染料の例は、
化学式C₁₄H₁₇N₄OClと次の構造を有するｐ−エトキシク
リソイジン： 化学式C₁₂H₁₀N₅O₄Clと次の構造を有するアミドール・ブ
ラツク： および化学式C₃₈H₄₂N₈S₄Cl₂と次の構造を有するアルシ
アン・イエローを含む： アゾ結合はアゾ染料において２回生じており、次の一
般式を有する： Ｒ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ 式中のＲは芳香族環構造である。本発明に有用なジアゾ
染料の例は式C₂₁H₂₁N₆O₄Clと次の構造を有するジエーナ
ス・イエロー： および式C₂₆H₂₆N₅OClと次の構造を有するジエーナス・
レツドである： ２個以上のアゾ結合基を有する染料はポリアゾ染料とし
て知られている。ポリアゾ染料の例は化学式C₁₀₂H₉₇N₁₉
O₁₃S₁₄を有し次の構造を有する抗ルクソル青Ｇである。

本発明に有用で正味正の電荷を有する別のクラスの有
機染料はジアゾニウムおよびテトラアゾニウム塩であ
る。両者は次の構造を含む： 式中のＲは芳香族環構造である。ジアゾニウム塩はこれ
ら構造の１つのみを含むが、テトラゾニウム塩は２つを
含む。ジアゾニウム塩の例は化学式C₆H₅N₂Clと次の構造
を有するジアゾベンゼン： および化学式C₆H₃Cl₄N₂Zn_1/2と次の構造を有するフアー
スト・スカーレツトを含む： テトラゾニウム塩の例は化学式C₁₄H₁₂O₂N₄Cl₈Znと次
の構造を有するフアースト・ブルーＢである： 本発明に有用な第３のクラスの有機染料はテトラゾリ
ウム塩類である。テトラゾニウム塩類もテトラゾールと
して知られ、次の基本構造を有する： 式中のＲは芳香族環構造である。テトラゾリウム塩の例
は化学名が２−（ｐ−ヨードフエニル）−３（ｐ−ニト
ロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウム・クロライ
ドで、化学式C₁₉H₁₃N₅O₂IClと次の構造式を有するヨー
ドニトロテトラゾリウム： および化学名が3,3′（4,4′−ジ−Ｏ−アニシレン）−
2,2′−ジ（ｐ−ニトロフエニル）−ビス（５−フエニ
ル）で、化学式C₄₀H₃₀N₁₀O₆Cl₂と次の構造を有する塩化
ジテトラゾリウムである： 本発明に使用される第４のクラスの有機染料はトリフ
エニルメタンである。このクラスの化合物はメタンCH₄
の３つの水素原子をフエニル基と置換することを特徴と
する。一般式は次式で示される： トリフエニルメタンの特定例は化学式C₂₃H₂₅N₂Clと次の
構造を有するマラカイト・グリーンである： キサンテン又はアクリジンの名前で分類されるクラス
の有機染料は本発明に有用な第５のクラスから成る。こ
のクラスの化合物は次の構造を有するキサンテンの誘導
体である： 特定のキサンテン又はアクリジンの例は化学式C₁₃H₁₀N₂
OClと次の構造を有するアクリジン・レツド3B: および化学式C₂₃H₃₂N₃OCl₃ZH₂Oと次の構造を有するアタ
ブリンを含む： 第６のクラスの有機染料はキノリン染料と呼ばれる。
キノリン染料の例は化学式C₂₅H₂₅N₂Iと次の化学構造を
有するピナシアノールである： 本発明に有用な他のクラスの有機染料はチアゾールと
呼ばれる。チアゾールは次の構造の存在を特徴とする： 式中のＲは芳香族環構造である。チアゾールの特定例は
化学式C₁₅H₁₉N₂SClと次の化学構造を有するチアフラビ
ンTCNである： 本発明に有用なさらに別のグループの有機染料はイン
ダミン、アジン、アミノアジン、サフラニンおよびチア
ジンと呼ばれるクラスの染料である。インダミン染料は
次の基本構造を有する化合物である： Ｒ−Ｎ＝Ｒ 式中のＲは芳香族環構造である。フエニレン・ブルーは
インダギンの特定の例であつて、化学式C₁₂H₁₂N₃Clと次
の化学構造を有する： アジン基の染料は２つの形態の化学構造を有するフエ
ナジンの誘導体である： １個以上のアミノ基をフエナジンに導入すると、アミ
ノアジンが生成する。中性レツドはアミノアジンの例で
あつて、化学式C₁₅H₁₇N₄Clと次の構造を有する： サフラニンはアジンに類似する染料であるが、アジン
基の窒素原子の１つが五価であつて、それに結合したベ
ンゼン環を有する。特定の例は化学式C₁₈H₁₅N₄Clと次の
構造式を有するフエノサフラニンである： チアジンは、アジン基の窒素原子の１つの代りに硫黄
原子が置換されている。チアジンの特定例は化学式C₁₃H
₁₁N₃SClと次の構造式を有するアズレC: および化学式C₁₆H₁₈N₃SClと次の構造を有するメチレン
・ブルーを含む： 本発明に有用な最後に例示するクラスの有機染料はフ
タロシアニンである。これらは、中心の金属原子、典型
的には銅の周囲にイソインドールを有する環式化合物で
あつて、結合ブリツジ原子は−Ｎ＝構造である。フタロ
シアニンの特定例は次の構造式を有するアルシアン・ブ
ルー： 式中のＸはオニウム基 である；および次の構造を有するキノリンのフタロシア
ニンを含む： 前記クラスおよび例の染料は説明のためのものであつ
て限定を意味するものではない。正味正の電荷を有し固
相支持体を着色できる疎水性芳香族環構造を有する有機
染料は全て本発明の範囲内にあると考えられる。これら
の染料はそれぞれ既知の方法で製造できるし、或いは市
販されている。

有機染料によつて固定化される成分は、抗原、抗体、
それらに付着又は吸着された抗原を有する全細胞、モノ
クローナル抗体を生成する細胞、細胞質膜小胞、未シー
ル膜ゴースト、および細胞膜の断片のような他の細胞質
成分のように、正味負の電荷を有し疎水結合を受けると
ころの免疫反応成分にすることができる。使用できる全
細胞はヒト又は動物から供給されるものである。赤血
球、血小板、白血球およびリンパ球および捕乳類の細胞
が本発明の免疫検定法に使用するのに特に適する。ヒト
の赤血球および血小板が特に有効である。

適当な染料および支持体材料を選択したら、支持体上
に染料を塗工する。このために、染料の液体溶液を調製
して、過剰量の染料溶液を支持体に十分な時間接触させ
て、支持体をコートおよび着色させる。染料は、必要な
らば等張食塩水や適当なアルコールのような適当な液体
に溶解させる。染料はイオン結合、水素結合、フアンデ
ルワールス結合および疎水結合のような非共有結合の相
互作用によつて支持体へ供給される。染料は支持体と共
に長時間温置したり、或いは染料を含む溶液に浸漬して
染料の着色能力に依存して直ちに洗浄することができ
る。

本発明に関係する免疫検定法に使用する固相支持体の
調製に特に２種類の染料、アルシアン・ブルーおよびア
ルシアン・イエローが使用されてきた。アルシアン・ブ
ルーを使用して固相支持体を調製するために、染料は最
初等張塩類溶液に溶解させてその塩類溶液中に染料１μ
g/ml〜1g/mlの濃度を得る。次に、ミクロタイター・プ
レートに設けた１つの凹部当り十分な量の染料溶液（25
〜350μ／凹部）を有機重合体支持体上に塗布し、支
持体に十分な時間接触させて、染料を支持体に結合させ
そして支持体を着色させる。余分な染料は支持体からす
すぐ。

アルシアン・イエローの用途は、アルシアン・イエロ
ーが水溶液に溶解しない点において少し異なる。従つ
て、一定量のアルシアン・イエローは最初100％メタノ
ールの十分な量に溶解させ、次に得られた混合体に等体
積の等張塩類溶液を添加する。有用な濃度範囲は１μg/
ml〜1g/mlであり、25〜350μがミクロタイター・プレ
ートの凹部に塗布するのに十分な量である。

理解されるように、本発明に有用な有機染料はいずれ
も同じような方法で調製して使用される。個々の染料を
溶液に溶解させるために個々の方法が必要であり、本発
明の範囲内に包含される、そしてそれらの方法は周知で
ある。

免疫反応成分は次に染料を塗工した固相支持体上へ固
定化させなければならない。これは、その成分を含む溶
液を染料塗工支持体上へ配置し、その成分を重力又は遠
心分離によつて支持上に沈殿させ、支持体に付着するの
に十分な時間染料と接触させることによつて達成され
る。非結合免疫反応性成分は塩類溶液によつて洗浄除去
することができる。これによつて、染料を塗工した支持
体に固定化された免疫反応性成分の層が後に残る。

本発明の望ましい実施態様において、全細胞、特に赤
血球又は血小板は染料塗工支持体上へ固定化された免疫
反応性成分である。これらの全細胞は、正味負の電荷を
有して、非共有結合又は疎水性相互作用によつて正味正
の電荷および疎水性芳香族環構造を有する有機染料へ付
着される。これらの非共有結合の相互作用は、イオン、
水素、フアンデルフアールスおよび疎水結合を含む。細
胞を有機染料に接触させることによつて支持体の表面上
に免疫検定を行うのに極めて有用である細胞の単層が生
成する（それがいくらかの非特異的結合の可能性を排除
する）。細胞の単層を作るために、固定される細胞を最
初に洗浄して生物流体におけるタンパク質の汚染を無く
する。これが行われないと、これらのタンパク質は吸着
によつて染料に固定化されるようになつて、染料の正電
荷を妨げる。これは細胞が染料に吸着されるのを防止す
る。細胞は組織培養流体、水、等張塩類溶液又は５〜10
のpHを有するリン酸塩緩衝化塩類溶液のような適当な液
体中で洗浄される。

洗浄された細胞は次に等張溶液又はPBS中に懸濁され
て、重力又は遠心分離によつて染料と接触させる。細胞
と染料とを十分な時間相互作用させて細胞を染料に付着
させた後、非結合細胞は塩類溶液で洗浄除去し、後に染
料を塗工した固相支持体へ固定化された細胞の単層が残
る。その固相支持体は、生物試験流体中の抗原又は抗体
（存在する場合）を検出するために免疫検定を行うのに
使用する準備完了である。抗体−抗原複合体の存在を検
出するために免疫化学に使用される検出法はいずれも固
相赤血球付着法、免疫蛍光法、放射線免疫検定法、又は
ELISA（酵素−結合免疫吸着検定法）のような検定を定
量化するために使用される。

別の実施態様において、固定化された細胞の単層は細
胞表面に抗原に特異の抗体を吸着するために使用され
る。この場合に、固定化された抗体は次に他の細胞の表
面上、又は生物試料における抗体の検出に用いることが
できる、そして従来の分析法を続ける。

本発明に従つて調製した固相支持体は、赤血球、血小
板、又はリンパ球に対する抗体の検出にも特に有用であ
る。臨床的に重要な多くの抗体は患者や提供者の血清に
見られる。抗体のあるものは、溶血性輸血反応、新生児
の溶血病又は自己免疫溶血性貧血の結果として生き残つ
た赤血球を減少させる。他の抗体は血小板の免疫崩壊を
もたらしうる。生体外において抗体検出試験は患者又は
提供者の血清にこれら抗体の存在を示す。

赤血球、血小板、又はリンパ球に対するIgG抗体を検
出する検定法において、正味正の電荷を有する有機染料
で処理した固相支持体、典型的に底部がＵ型のミクロタ
イター・プレートが利用される。予め洗浄して調製した
所定量の赤血球、血小板又はリンパ球を染料を塗つた各
凹部へ添加する。それらの細胞はミクロプレートの凹部
の表面上に遠心分離され、そこで細胞はイオン的に、非
共有結合的に染料塗工凹部へ結合され、そこに固定化さ
れるようになる。過剰の未結合細胞は手又は器具で洗浄
除去される。細胞を塗工した凹部に所定量の患者又は提
供者の血清又は血漿を添加する。細胞に特異の抗体が患
者の試料に存在する場合には、それらは細胞の単層へ免
疫学的に結合される。試料中の非特異的又は未結合抗体
および他の成分は洗浄除去される。

細胞に結合された抗体の存在を検出するために、指標
の赤血球をミクロプレートの凹部に添加して遠心機にか
ける。指標の赤血球は抗イムノグロブリンでコーテイン
グされた赤血球である。患者の試料が細胞の単層に特異
の抗体を含む場合には、指標細胞上の抗イムノグロブリ
ンは抗体（イムノグロブリン）に付着する、すなわち細
胞の単層に結合して指標細胞の単層へ付着させる、これ
が正の反応である。患者の試料が細胞単層に特異の抗体
を含まない場合には、抗イムノグロブリン指標の細胞は
遠心分離後に小球形化して凹部の底に個々の識別できる
ボタンとなる、これが負の反応である。

本発明は、患者又は提供者の血清におけるイムノグロ
ブリン（抗体）を決定するために固相赤血球付着免疫検
定を行うキツトも包含する。特に、免疫検定キツトは赤
血球、血小板又はリンパ球に特異の抗体の存在を検出す
る。キツトは複数のＵ型底部の凹部を有するミクロタイ
ター・プレートからなる。そのミクロプレートは本発明
の教示に従つて正味正の電荷を有する有機染料で処理さ
れた。好適な実施態様で使用された染料はアルシアン・
イエローである。ミクロタイター・プレートは密封箔又
はプラスチツク・パウチで供給される。ミクロタイター
はさらにグリシン、FD＆Ｃバイロレツト＃１染料および
保存剤（望ましくはアジ化ナトリウム0.1％）を含有す
る低イオン濃度溶液のバイアル（ガラスびん）；抗ヒト
のイムノグロブリンでコーテイングされ、保存剤（望ま
しくはクロラムフエニコール、0.25mg/ml）と共に緩衝
溶液中に懸濁された指標赤血球の懸濁液および硫酸ネオ
ミシン（0.1mg/ml）を含有する密封バイアル；および正
の対照品として使用するために少なくとも２種の濃度に
おける処理される細胞に対する既知抗体、赤血球、リン
パ球又は血小板を含むバイアル並びに負の対照品として
使用するために抗体を含まないバイアルを含む。キツト
は検定のために細胞の単層を形成するために使用するミ
クロタイター・プレートにコーテイングされる細胞を含
有するバイアルを提供する。

次の実施例は説明のためのものであつて限定を意図す
るものではない。

実施例１ 赤血球の表面上の抗原に特異の抗体を検出する免疫検
定を行うために、複数のＵ型底部に設けた凹部を有する
ミクロタイター・プレートをリン酸塩緩衝塩類溶液（PB
S）中で洗浄し、空気乾燥する。アルシアン・ブルーの
溶液は染料を等張塩類溶液に溶解し100mg/mlの濃度にす
ることによつて調製する。前記凹部に染料溶液250μ
を添加して、15分間温置する。余分の染料は自動洗浄機
（例えば、Bio−Tek EL402型）を使用して洗浄除去す
る。懸濁した赤血球の溶液はPBSで洗浄して汚染タンパ
ク質を除去する。所定量の細胞懸濁液を各凹部に添加
し、ミクロプレートはそれを収容できるロータを備えた
遠心分離機（Sorval GLC−2B）にかける。遠心分離は19
0×ｇで５分間行う。過剰又は未結合細胞は自動洗浄機
の標準使用を介して等張塩類溶液で４〜６回洗浄するこ
とによつて除去する。次に、所定量の試料を種々の釈度
において凹部へ添加する。試料は凹部において37℃で15
分間まで温置させる。余分の試料は除去して、プレート
は等張塩類溶液中で４〜６回洗浄する。各凹部は次にEL
ISAのような標準の免疫検定法によつて細胞の表面上の
抗原に結合した抗体の存在を分析する。

実施例２ 本発明の教示はヒトの赤血球の血液型グループを決定
する検定に利用することができる。ミクロタイター・プ
レートは実施例１におけるように調製する。一定量のヒ
トのグループＡの赤血球を染料をコーテイングした凹部
に添加して付着させ、遠心分離によつてそこに固定化さ
せる。余分の細胞は自動洗浄機によつて洗浄除去する。
細胞単層は抗−Ａイムノグロブリンと感作する、そして
洗浄して余分のイムノグロブリンを除去する。別の組の
凹部を同様に調製する。ヒトのグループＢ細胞は抗−Ｂ
イムノグロブリンと感作する。未知のタイプの赤血球の
試料を凹部に添加して１分間遠心分離機にかける。その
試料細胞がグループＡの細胞の場合には、それらは細胞
単層上の抗−Ａイムノグロブリンに付着し、グループＡ
の血液型に対して正の反応を示す。グループＡ細胞はグ
ループＢ細胞の単層上の抗−Ｂイムノグロブリンに付着
しない、そして遠心分離の後にミクロプレート凹部の底
部における個々のボタンによつて負の反応が示される。

実施例３ 本発明の教示を取り入れたキツトは赤血球に対するIg
G抗体の検出用に調製することができる。複数のＵ型底
部の凹部を有するミクロタイター・プレートは有機染料
のアルシアン・イエローでコーテイングする。そのプレ
ートの凹部のグループに約35〜50μの洗浄、懸濁赤血
球溶液を添加する。そのプレートは190gで５分間遠心分
離する。余分の未結合細胞は除去して、プレートを等張
塩類溶液で４〜６回洗浄する。洗浄は自動洗浄器具の標
準使用によつて行う。これはプレートの汚染の危険を低
減する。それぞれの凹部へ70〜100μの低イオン濃度
の溶液を添加する。次に35〜50μの既知標準又は患者
又は提供者の血清又は血漿試料を各凹部に添加する。そ
のプレートは37℃で少なくとも15分間温置する。その混
合体はプレートからデカントし、再び前記等張塩類溶液
で４〜６回洗浄する。その凹部へウサギの抗−ヒトIgG
で予め感作された指標の赤血球35〜50mlを添加する。そ
のプレートは直ちに450gで１分間遠心分離する。そのプ
レートは対照表面に置いて赤血球単層への付着又は非付
着を検査する。正の反応は反応表面上での指標細胞の付
着によつて見られる。負の反応は凹部の底部に指標赤血
球の個々のボタンを形成し、付着を示さない。

実施例４ 組織培養で成長したヒトの星細胞腫の表面上の抗原に
特異の抗体を検出する免疫検定を行うために、等張塩類
溶液に染料を1mg/mlの濃度で溶解さすことによつてアル
シアン・ブルーの溶液を調製する。その染料溶液300ml
をＵ型底のミクロタイター・プレートの凹部へ添加して
30分間まで温置する。余分の染料は自動ミクロプレート
洗浄器具を使用して洗浄除去する。組織培養流体中の懸
濁星細胞腫細胞の溶液をPBSで洗浄して汚染タンパク質
を除去する。一定量の細胞懸濁液をアルシアン・ブルー
をコーテイングした凹部の各々に添加し、ミクロプレー
トを収容できるロータを備えた遠心機でミクロプレート
を遠心分離する。遠心分離は190gで５分間行う。未結合
細胞は自動ミクロプレート洗浄装置を使用してPBSを洗
浄することによつて除去する。次に、星細胞腫抗原に特
異のヒトの抗体を含むと考えられる一定量の試料を凹部
へ添加する。その試料は凹部において37℃で30分間温置
させる。余分の試料は除去し、プレートをPBSで４〜６
回洗浄し、ウサギの抗−ヒト免疫グロブリンで予め感作
された指標の赤血球35〜50μを凹部へ添加する。プレ
ートは直ちに450gで１分間遠心分離する。プレートは星
細胞腫細胞の単層への付着又は非付着を検査する。正の
反応は反応表面上の指標細胞の付着によつてわかる。負
の反応は凹部の底部における指標赤血球の個々のボタン
を形成し、付着を示さない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フレツド・ブイ・プラツプ アメリカ合衆国カンサス州オーバーラン ド・パーク・リーズ・レイン8319 (56)参考文献 特開 昭60−35000（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固相支持体； 正の正味電荷と疎水性芳香環構造を有する有機染料を前
   記支持体に吸着された有機染料被膜；および 該有機染料に固定化された免疫反応性全細胞から成る単
   層から成ることを特徴とする固相免疫検定用品。
2. 【請求項２】前記全細胞は、赤血球、リンパ球、白血
   球、血小板および組織細胞から成る群から選ぶ請求項１
   記載の固相免疫検定用品。
3. 【請求項３】前記固相支持体は、試験管、ミクロタイタ
   ー・プレート、ビード、シートおよび又は膜から成る群
   から選ぶ請求項２記載の固相免疫検定用品。
4. 【請求項４】前記染料は、アゾ染料、ジアゾニウム塩
   類、テトラゾニウム塩類、テトラゾリウム塩類、トリフ
   ェニルメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、チ
   アゾール、インダミン、アジン、アミノアジン、チアジ
   ンおよびフタロシアニンから成る群から選ぶ請求項１記
   載の固相免疫検定用品。
5. 【請求項５】固相支持体； 該支持体上にあって、全細胞を固定化でき正の正味電荷
   と疎水性芳香環構造を有して前記支持体に吸着され、ア
   ゾ染料、ジアゾニウム塩類、テトラゾニウム塩類、テト
   ラゾリウム塩類、トリフェニルメタン、キサンテン、ア
   クリジン、キノリン、チアゾール、インダミン、アジ
   ン、アミノアジン、チアジンおよびフタロシアニンから
   成る群から選ぶ有機染料から成る；および 赤血球、リンパ球、白血球、血小板および組織細胞から
   成る群から選び、前記有機染料に固定化された免疫反応
   性全細胞から成ることを特徴とする固相免疫検定用品。
6. 【請求項６】アゾ染料、ジアゾニウム塩類、テトラゾニ
   ウム塩類、テトラゾリウム塩類、トリフェニルメタン、
   キサンテン、アクリジン、キノリン、チアゾール、イン
   ダミン、アジン、アミノアジン、チアジンおよびフタロ
   シアニンから成る群から選んだ有機染料を被覆した固相
   支持体を提供する工程； 前記被覆支持体上に所定量の全細胞を配置する工程； 前記全細胞を前記有機染料の上に提供するように、該全
   細胞を該有機染料に固定化させる工程； 生物流体の免疫学的反応成分を免疫学的片方に結合させ
   るのに十分な時間、生物流体を前記支持体に接触させる
   工程； 前記支持体から過剰の流体を除去する工程；および 前記免疫学的片方に結合した前記免疫学的反応成分の存
   在を分析する工程； から成ることを特徴とする、汚染蛋白質を含まない全細
   胞に結合される免疫学的片方への付着を検出することに
   よって、生物流体中の免疫反応成分の存在を決定する固
   相免疫検定法。
7. 【請求項７】前記全細胞は、赤血球、リンパ球、白血
   球、血小板および組織細胞から成る群から選ぶ請求項６
   記載の固相免疫検定法。
8. 【請求項８】前記免疫学的反応成分が、血清又は血漿に
   存在する抗体であり、前記全細胞は哺乳動物の細胞、赤
   血球、リンパ球、白血球、血小板、から成る群から選ぶ
   請求項６記載の固相免疫検定法。
9. 【請求項９】前記免疫反応成分の存在の分析は指示薬の
   赤血球の添加によって決定する請求項６記載の固相免疫
   検定法。