JPH0264460A - 固相免疫検定用品及び該品を利用した検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に免疫検定法、特に有機染料を利用して
固相免疫検定全行うのに使用する物品に関する。さらに
、本発明はかかる物品を、使用するための免疫法、免疫
物品の製造法および物品を組み入れた免疫検定を行うキ
ットに関する。

最も広い意味において、免疫検定法は、生物流体中の免
疫反応性成分をその特定の免疫学的片方との結合を測定
することによって検出する。免疫反応性成分はこの場合
抗原又は抗体にすることができる、従ってその免疫学的
片方はかかる成分に対して特定の抗体又は抗原である。

免疫反応性成分又はその片方は、さらにその免疫学的性
質を壊さない別の物質に結合される。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課頌〕抗原−
抗体の重合体の存在を検出するために広節囲の方法が開
発されている。放射性免疫検定法におし・では、未知の
抗原に存在する流体に既知量の放射性標識化抗原を添加
する。この流体はその抗原に対して特定の抗体を含有す
る別の混合体との反応を受ける。その標識化および未標
識化抗原は抗体と流体中のそれらの相対的濃度に比例し
て反応する。抗体に結合した抗原を遊離抗原から分離し
た後、抗原−抗体の放射能を測定する。

酵業に結合した免疫反応において、反応性標識はアルカ
リ性のホスファターゼ又はベルオキシダゼのような酵素
と置換される。未知試料に存在する抗原又は抗体の前は
時間の経過後に生成した酵素反応生成物の全音測定する
ことによって決定される。この量は試験試料に存在する
抗体の量に比例する。

高感度及び特異ｅ！−有する免疫検定試験を得るために
、固相免疫検定法が開発された。この方法は、生物流体
中の抗原−抗体複合体の成分全反応混合体中の他の成分
から分離させる。固相免疫検定法において、免疫反応の
一成分である抗原又は抗体は固相支持体の表面に固定化
される。抗原又は抗体を固相支持体へ直接固定化するた
めに多数の方法が開発されている。かかる方法の１９は
、トリアジニル結合基を用いて抗原又は抗体を固相支持
体へ固定化している；別の方法はヒドロキシ低級アルキ
ルアミン金使用して重合体の固相支持体に抗原又は抗体
をコーティングする；第うの方法はグルタルアルデヒド
全利用して抗原又は抗体を固定化している。これらの方
法は抗原又は抗体の直接固定化には有用であることが証
明されたが、赤血球、白血球、リンパ球、血小板又は他
の捕乳類の細胞のような全細胞の固定化における有効性
が示されていない。抗原がこの種の細胞の表面に存在し
たり、吸着されることは周知である。血液グループおよ
び感染性疾病作因、特に血液の細胞成分に直接影響を与
えるこれらの抗原の存在全測定することが有用になって
きた。固相支持体へ捕乳類の細胞全体を固定することに
よって、この種の免疫検定の結果により著しい特異性を
得ることができる。

全細胞全固相支持体へ固定化するために、種々の試みが
されてきｆｃ、１９の方法は化学的な方法であって、細
胞を固相支持体へ共有結合的に結合させる。この方法は
、カップリング剤が高コストであり、かつ必要な共役条
件下で細胞の免疫学的完全性ｋｍわすことなく固定化す
ることができる・細胞の種類の数が限定されるので、細
胞の固定化にふ・ける用途が限定されることがわかった
。この化学物質は、細胞を支持体へ標かけする分子のい
ずれかの端部にアルデヒドＭｅ有する。この方法は細胞
全固相支持体へ結合させることにおいである程度有効で
あるが、グルタルアルデヒドが細胞の表面全変性させて
、免疫反応全妨害することがわかっている。

全ての細胞を固相支持体へ固定化する最適の方法は、支
持体の表面に細胞の層を作るために共有結合よりもむし
ろ吸着を利用する。支持体上への細胞の吸着は、細胞表
面の組成、電荷および加齢に左右される。さらに、支持
体材料の組成、電荷および形状が細胞の支持体への付着
に影響を与える。細胞の吸着に伴う固有の問題点は、細
胞の支持体への結合が比較的弱いことである。この問題
は、これらの検定法を行う大部分の病院および研究所に
おいて利用される自動化洗浄装置の着手のために誇張さ
れる。自動化洗浄装置の使用は、必要でないならば、支
持体の反復処理による検定の汚染の危険を低減させるこ
とが望ましい。さらに、ある種の血液に関係した病気が
高感染性であるために、試験を行う技術者のリスクは直
接処理が少ない方法によって低減される。また、自動化
装置は、医者、等が診断をして、できる限シ速く処置全
開始することができる最も早い時間内に多量の試験を行
うために必要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

現在最も広く用いられている吸着法は、細胞全ポリスチ
レン支持体へ固定化するためにポリーＬリシン全利用し
ている。ポリーＬ−リシンと支持体間の結合はイオン的
であって、細胞と固相支持体間の結合は比較的弱い。こ
の弱い結合は、自動化洗浄装置が使用されるときに吸着
手段としてのポリーＬ−リシンの利用を減じることにな
る。

ボＩＪ　−Ｌ−１７７ンと細胞間の結合が、洗浄工程中
に細胞が除去されるのを防ぐには余９にも弱過ぎる。支
持体上に層を結合する細胞のある量がかくの如く除去さ
れると、支持体自身又はカップリング剤への試料中の曲
の抗原又は抗体の非特異的結合のために、検定の精度が
著しく低下する。

従って、本発明の主目的は、自動化洗浄装置との併用に
適する免疫検定全行う物品および方法全提供することで
ある。

さらに、本発明の目的は、極めて特異性の免疫検定を行
うために細胞表面の免疫成分全完全に維持する固相支持
体へ細胞を結合させる吸着法を利用する方法を提供する
ことである。

本発明の別の目的は、比較的低コストで固相支持体へ細
胞を結合させる吸着法を利用して、生物学的流体中の抗
原又は抗体の存在を検出する方法を提供することである
。

さらに、本発明の目的は、現在既知の方法よりも強固に
支持体へ細胞全結合させるところの捕乳類細胞の全てを
固相支持体へ吸着させる方法を提供することである。

さらに、本発明の目的は、自動化洗浄機全使用するとき
に支持体に付着された細胞の単層からの細胞の損失を著
しく低減させるように全細胞を強固に結合させることが
できる固相支持体全提供することである。

本発明の目的は、上記目的の全てを達成する免疫検定に
使用する固体支持体を提供することである。

本発明の別の目的は、発明の目的全実施する固相支持体
全組み込んだ固相免疫検定法を行うキットを提供するこ
とである。

〔課萌ヲ解決するための手段〕

我には、正味正の電荷を有し疎水性芳香族環構造全する
有機染料が生物細胞又は細胞断片のような免疫学的反応
性成分の固定化に利用することができて、固相免疫検定
を行うのに有利な方法および物品を提供すること全発見
した。最初に有機染料全固相支持体に塗工する。捕乳類
の細胞、赤血球、リンパ球、白血球又は血小板のような
正味負の電荷を有する免疫反応性成分が有機染料と接触
するとき、その成分が染料に非共有結合によって固定化
されるようになる。免疫反応性細胞と有機染料間のこの
結合は、大部分の自動化洗浄機によって洗浄を受けると
きに細胞単層の崩壊に抵抗する十分な強さを有する。

〔実施例〕

固相免疫検定法は固体支持体構造として広配列の品物を
利用する。その支持体はしばしば材料の試験管、ビード
、シート、ペトリ皿、膜又はミクロタイター・プレート
の形を採る。他の型式の支持体や支持体の形態も本発明
の目的を達成するのに有用で同様に適用することができ
る。

固相支持体はポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化
ビニル又はナイロンのような有機重合体で構成すること
ができる。有機染料で着色できる材料は全て、ガラスの
ような有機重合体以外の固相免疫検定用支持体として利
用できる。

本発明による免疫検定全実施する最適の固相支持体は複
数の凹部を有するミクロタイター・プレートである。ミ
クロタイター・プレートは有機重合体製が望ましく、ポ
リスチレン製が最適である。

利用する固相支持体は慎重に取シ扱い、免疫検定に影響
を与えるタンパク質の汚染がないように保つ必要がある
。

本発明に有用な染料は正味正の電荷を廟しかつ疎水性芳
香環構造を有する有機染料である。正味正の電荷全有し
固相支持体へ付着するような疎水性芳香環構造金有する
染料はいずれも本発明の目的を達成する有用性ヲ壱する
。

免疫検定を行うために固相界の調製に有用な多くの有機
染料は種々のクラスに分類することができる。特に有用
なりラスの染料の１９は正味正の電荷を有するアゾ染料
である。アゾ染料はアゾ結合、−Ｎ＝Ｎ−の存在全特徴
とし、２つの芳香族環を結合させる。この結合は一般に
強く着色される化合物を生成する。芳香族環はしばしば
ベンゼン又はナフタレン環である。アゾ基、−Ｎ＝Ｎ−
は化合物において１回以上生じうる。モノアゾ染料は次
の基本構造を有する： Ｒ−Ｎ　　二　Ｎ−Ｒ ここでＲは芳香族環構造である。モノアゾ染料の例は、
化学式Ｃ，，Ｈ１？Ｎ、　ＯＣｌと次の構造を有するｐ
−エトキシクリソイジン： アゾ結合はアゾ染料において２回生じてお９、次の一般
式を有する： Ｒ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ 式中のＲは芳香族環構造である。本発明に有用なジアゾ
染料の例は式０．．　Ｈ，ｌＮ６０．　ＣＩｔと次の構
造を有スルシエーナス・イエロー： 化学式Ｃ！、！Ｈ，ｏＮ、Ｏ，Ｃｊと次の構造を有する
アミトール・ブラック： および式Ｃ，，Ｈ，、Ｎｌ５ＯＣＩと次の構造を有する
ジエーナス・レッドである： ？ｙ１ および化学式Ｃ３♂Ｈ，１Ｎ８Ｓ、　Ｃ１ｔと次の構造
を有するアルシアン・イエローラ含む： ２個以上のアゾ結合基を有する染料はポリアゾ染料とし
て知られている。ポリアゾ染料の例は化学０−・÷Ｚ− Ｃ１ テトラゾニウム塩の例は化学式ｃ、、　Ｈｌ　！　ｏ、
　Ｎ４　Ｃ’８Ｚｎと次の構造を有するファースト・ブ
ルーＢである： 本発明に有用で正味正の電荷を有する別のクラスの有機
染料はジアゾニウムおよびテトラアゾニウム塩である。

両者は次の構造を含む：＋ −Ｎ−Ｎ 式中のＲは芳香族環構造である。ジアゾニウム塩はこれ
ら構造の１９のみを含むが、テトラゾニウム塩は２つを
含む。ジアゾニウム塩の例は化学式ｃ、　Ｈ，Ｎ、　ａ
ｔと次の構造を有するジアゾベンゼン：０古ヨＮ己、 および化学式０６　Ｎ３　Ｃ７４Ｎ２　Ｚ　ｎ３／ｉｉ
と次の構造を有するファースト・スカーレットを含む： 本発明に有用な第５のクラスの有機染料はテトラゾリウ
ム塩類である。テトラゾニウム塩類もテトラゾールとし
て知られ、次の基本構造を有する：式中のＲは芳香族環
構造である。テトラゾリウム塩の例は化学名が２−（ｐ
−ヨードフェニル）５−（ｐ−二トロフェニル）−５−
フェニルテトラゾリウム・クロライドで、化学式〇、、
　）（ｔ３Ｎ５０□ＩＯＪ　　と次の構造式を有するヨ
ードニトロテトラゾリウム： レン）−２，２−ジ（ｐ−ニトロフェニル）−ビス（５
−フェニル）で、化学式Ｃ４０Ｈ，ｏＮＩＯｏ６ｃｊ。

と次の構造を有する塩化ジテトラゾリウムであるニトリ
フェニルメタンの特定例は化学式〇、、　Ｈ，５Ｎ２Ｃ
Ｉｔ　と次の構造を有するマラカイト・プリーンである
： 本発明に使用される第４のクラスの有機染料はトリフェ
ニルメタンである。このクラスの化学物はメタンＯＨ，
のうつの水素原子全フェニル基と置換すること全特徴と
する。一般式は次式で示される： キサンチン又はアクリジンの名前で分類されるクラスの
有機染料は本発明に有用な第５のクラスから成る。この
クラスの化合物は次の構造を有するキサンチンの誘導体
である： 特定のキサンチン又はアクリジンの例は化学式Ｃｌ５Ｈ
Ｉ。Ｎ、　ＯＯＡ！　と次の構造を有するアクリジン・
レッド５Ｂ； ｂよび化学式０，３Ｈ３，ＮＩ　ＱＣ／ｓＺＨ，Ｏと次
の構造を有するアタプリンを含む： 式中のＲは芳香族環構造である。チアゾールの特定例は
化学式０．、Ｈ，、Ｎ、　ＳＣｊと次の化学構造を有す
るチアフラピンＴＯＮである： 第６のクラスの有機染料はキノリン染料と呼ばれる。キ
ノリン染料の例は化学式〇、、　Ｈ，、Ｎ、　Ｉと次の
化学構造を有するビナシアツールである：本発明に有用
な他のクラスの有機染料はチアゾールと呼ばれる。チア
ゾールは次の構造の存在を。

特徴とする二 本発明に有用なさらに別のグループの有機染料はインダ
ミン、アジン、アミノアジン、サフラニンおよびチアジ
ンと呼ばれるクラスの染料である。

インダミン染料は次の基本構造全有する化合物である： 、Ｒ−Ｎ＝Ｒ 式中のＲは芳香族環構造である。フェニレン・フルーは
インダミンの特定の例であって、化学式Ｃ，，Ｈ，，Ｎ
５ＣＡ！と次の化学構造を有す、る：Ｈ，４ト＝０＝晶
・ アジン基の染料は２つの形態の化学構造を有するフェナ
ジンの誘導体である： １４固以上のアミノ基を７エナジンに導入すると、アミ
ノアジンが生成する。中性レッドはアミノアジンの例で
あって、化学式Ｃ，５Ｈ，？Ｎ、　Ｃ！　ｌと次の構造
を有する： チアジンは、アジン基の窒素原子の１９の代りに硫黄原
子が置換されている。チアジンの特定例は化学式ｅｔａ
）（ｔｔＮ３Ｆ３Ｃ１と次の構造式全有するアズレＣ： および化学式Ｃ，，Ｈ，，Ｎ、　８０！と次の構造を有
するメチレン・ブルー金倉む： サフラニンはアジンに類似する染料であるが、アジン基
の窒素原子の１９が五価であって、それに結合したベン
ゼン環を有する。特定の例は化学式Ｃｌ８Ｈ，５Ｎ、　
０７と次の構造式を有するフェノサフラニンである： 本発明に有用な最後に例示するクラスの有機染料はフタ
ロシアニンである。これらは、中心の金属原子、典型的
には銅の周囲にイソインドールを有する環式化合物であ
って、結合ブリッジ原子は−Ｎ−構造である。フタロシ
アニンの特定例は次の構造式を有するアルシアン・ブル
ー二式中のＸはオニウム基 である；および次の構造を有するキノリンのフタロシア
ニンを含む： 前記クラスおよび例の染料は説明のためのものであって
限定を意味するものではない。正味正の電荷を有し固相
支持体を着色できる疎水性芳香族環構造を有する有機染
料は全て本発明の範囲内にあると考えられる。これらの
染料はそれぞれ既知の方法で製造できるし、或いは市販
されている。

有機染料によって固定化される成分は、抗原、抗体、そ
れらに付着又は吸着された抗原を有する全細胞、モノク
ローナル抗体を生成する細胞、細胞質膜小胞、未シール
膜ゴースト、および細胞膜の断片のような他の細胞質成
分のように、正味負の電荷を有し疎水結合を受けるとこ
ろの免疫反応成分にすることができる。使用できる全細
胞はヒト又は動物から供給されるものである。赤血球、
血小板、白血球およびリンパ琢および捕乳類の細胞が本
発明の免疫検定法に使用するのに特に適する。ヒトの赤
血球および血小板が特に有用である。

適当な染料および支持体材料全選択したら、支持体上に
染料を塗工する。このために、染料の液体溶液を調製し
て、過剰量の染料溶液を支持体に十分な時間接触させて
、支持体全コートおよび着色させる。染料は、必要なら
ば等張食塩水や適当なアルコールのような適当な液体に
溶解させる。

染料はイオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合
および疎水結合のような非共有結合の相互作用によって
支持体へ結合される。染料は支持体と共に長時間高置し
たり、或いは染料を含む溶液に浸漬して染料の着色能力
に依存して直ちに洗浄することができる。

本発明に関係する免疫検定法に使用する固相支持体の調
製に特に２糧類の染料、アルシアン・ブルーおよびアル
シアン・イエローが使用されてきた。アルシアン・ブル
ーを使用して固相支持体全調製するために、染料は最初
等張塩類溶液に溶解させてその塩類溶液中に染料１ｕＪ
’／ｉｔ／〜１ｔｚ／ｍｌの濃度を得る。次に、ミクロ
タイター・プレートに設けた１９の凹部当９十分な量の
染料溶液（２５〜５５０μｊ／凹部）を有機重合体支持
体上に塗布し、支持体に十分な時間接触させて、染料を
支持体に結合させそして支持体を着色させる。

余分な染料は支持体からすすぐ。

アルシアン−イエローの用途は、アルシアン・イエロー
が水溶液に溶解しない点において少し異なる。従って、
一定量のアルシアン・イエローは最初１００％メタノー
ルの十分な量に溶解させ、次に得られた混合体に等体積
の等張塩類溶液を添加する。有用な濃度範囲は１　ｕ　
Ｉ　／　ｍｌ−１１／　ｍｌであり、２５〜３５０μｊ
がミクロタイター・プレートの凹部に塗布するのに十分
な言である。

理解されるように、本発明に有用な有機染料はいずれも
同じような方法で調製して使用される。

個々の染料を溶液に溶解させるために個すの方法が必要
であシ、本発明の範囲内に包含される、そしてそれらの
方法は周知である。

免疫反応成分は次に染料を塗工した固相支持体上へ固定
化させなければならない。これは、その成分全含む溶液
を染料塗工支持体上へ配置し、その成分を重力又は遠心
によって支持上に沈殿させ、支持体に付着するのに十分
な時間染料と接触させることによって達成される。非結
合免疫反応性成、／）ｄ塩類溶液によって洗浄除去する
ことができる。

これによって、染料全塗工した支持体に固定化された免
疫反応（・生成分の層が後に残る。

本発明の望ましい実施態様において、全細胞、特に赤血
球又は血小板は染料塗工支持体上へ固定化さ！″した免
疫反応性成分である。これらの全細胞は、正味負の電荷
？イ〕′シて、非共有結合又は疎水性相互作用によって
正味正の電荷シよび疎水性芳香族環構造を有する有機染
料へ付着される。これらの非共有結合の相互作用は、イ
オン、水素、ファンデルファールスおよび疎水結合を含
む。細胞全有機染料に接触させることによって支持体の
表面上に免疫検定を行うのに極めて有用である細胞の単
層が生成する（それがいくらかの非特異的結合の可能性
を排除する）。細胞の単層？作るために、固定される細
胞を最初に洗浄して生物流体におけるタンパク質の汚染
を無くする。これが行われないと、これらのタンパク質
は吸着によって染料に固定化されるようになって、染料
の正電荷を妨げる。これｔｆｉ細胞が染料に吸着される
のを防止する。細胞は組織培養流体、水１等張塩類溶液
又は５〜１０のｐＨｒ有するリン酸塩緩衝化塩類溶液の
ような適当な液体中で洗浄される。

洗浄された細胞は次に等張溶液又はＰＨ３中に懸濁され
て、重力又は遠心によって染料と接触させる。細胞と染
料とを十分な時間相互作用させて細胞を染料に付着させ
た後、非結合細胞は塩類溶液で洗浄除去し、後に染料を
塗工した固相支持体へ固定化された細胞の単層が残る。

その固相支持体は、生物試験流体中の抗原又は抗体（存
在する場合）を検出するために免疫検定を行うのに使用
する準備完了である。抗体−抗原複合体の存在を検出す
るために免疫化学に使用される検出法はいずれも固相赤
血球付着法、免疫螢光法、放射線免疫検定法、又はＥＬ
ＩＳＡ（酵素−結合免疫吸着検定法）のような検定を定
量化するために使用される。

別の実施態、様において、固定化された細胞の単層は細
胞表面に抗原に特異の抗体を吸着するために使用される
。この場合に、固定化された抗体は次に他の細胞の表面
上、又は生物試料における抗体の検出に用いることがで
きる、そして従来の分析法を続ける。

本発明に従って調製した固相支持体は、赤血球、血小板
、又はリンパ球に対する抗体の検出にも特に有用である
。臨床的に重要な多くの抗体は患者や提供者の血清に見
られる。抗体のあるものは、溶血性輸血反応、新生児の
溶血病又は自己免疫溶血性貧血の結果として生き残った
赤血球を減少させる。他の抗体は血小板の免疫崩壊をも
たらしうる。生体外において抗体検出試験は患者又は提
供者の血清にこれら抗体の存在を示す。

赤血球、血小板、又はリンパ球に対するＩ、９Ｇ抗体を
検出する検定法において、正味正の電荷を有する有機染
料で処理した固相支持体、典型的に底部がＵ型のミクロ
タイター・プレートが利用される。予め洗浄して調製し
た所定量の赤血球、血小板又はリンパ球を染料を塗った
各凹部へ添加する。

それらの細胞はミクロプレートの凹部の表面上に遠心分
離され、そこで細胞はイオン的に、非共有結合的に染料
塗工凹部へ結合され、そこに固定化されるようになる。

過剰の未結合細胞は手又は器具で洗浄除去される。細胞
を塗工した凹部に所定量の患者又は提供者の血清又は血
漿を添加する。

細胞に特異の抗体が患者の試料に存在する場合には、そ
れらは細胞の単層へ免疫学的に結合される。

試料中の非特異的又は未結合抗体および他の成分は洗浄
除去される。

細胞に結合された抗体の存在を検出するために、指標の
赤血球全ミクロプレートの凹部に添加して遠心機にかけ
る。指標の赤血球は抗イムノグロブリンでコーティング
された赤血球である。患者の試料が細胞の単層に特異の
抗体を含む場合には、指標細胞上の抗イムノグロブリン
は抗体（イムノグロブリン）に付着する、すなわち細胞
の単層に結合して指標細胞の単層へ付着させる、これが
正の反応である。患者の試料が細胞単層に特異の抗体を
含まない場合には、抗イムノグロブリン指標細胞は遠心
分離後に小球形化して凹部の底に個りの識別できるボタ
ンとなる、これが負の反応である。

本発明は、患者又は提供者の血清におけるイムノグロブ
リン（抗体）全決定するために固相赤血球付着免疫検定
を行うキットも包含する。特に、免疫検定キットは赤血
球、血小板又はリンパ球に特異の抗体の存在を検出する
。キットは複数のＵ型底部の凹部を有するミクロタイタ
ー・プレートからなる。そのミクロプレートは本発明の
教示に従って正味正の電荷を有する有機染料で処理され
た。好適な実施態様で使用された染料はアルシアン・イ
エローである。ミクロタイター・プレートは密封箔又は
プラスチック・パウチで供給される。

ミクロタイターはさらにグリシン、ＦＤ　＆　Ｏハイロ
レットナ１染料および保存剤（望ましくはアジ化ナトリ
ウム０．１％）を含有する低イオン濃度溶液のバイアル
（ガラスびん）；抗ヒトのイムノグロブリンでコーティ
ングされ、保存剤（望ましくバクロラムフェニコール、
０．２５　ｍｙ／ｍｌ　）　ト共に緩衝溶液中に懸濁さ
れた指標赤血球の懸濁液および硫酸ネオミシン（０，１
１５１７ａｔ　）　ｆ含有する密封バイアル；および正
の対照品として使用するために少なくとも２種の濃度に
おける処理される細胞に対する既知抗体、赤血球、リン
パ球又は血小板を含むバイアル並びに負の対■品として
使用するために抗体を含まないバイアルを含む。キット
は検定のために細胞の単層を形成するために使用するミ
クロタイター・プレートにコーティングされる細胞を含
有するバイアル全提供する。

次の実施例は説明のためのものであって限定を意図する
ものではない。

・実施例１ 赤血球の表面上の抗原に特異の抗体全検出する免疫検定
を行うために、複数のＵ型底部に設けた凹部を有するミ
クロタイター・グレートをリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢ
Ｓ）中で洗浄し、空気乾燥する。アルシアン・ブルーの
溶液は染料を等張塩類溶液に溶解し１００１ｇ／ｍｊの
濃度にすることによって調製する。前記凹部に染料溶液
２５０μｊを添加して、１５分間温扁置る。余分の染料
は自動洗浄機（例えば、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　　ＢＬヰ０２
型）を使用して洗浄除去する。懸濁した赤血球の溶液は
ＰＢＳで洗浄して汚染タンパク質を除去する。

所定量の細胞懸濁液を各凹部に添加し、ミクロプレート
はそれを収容できるロータ金偏えた遠心分離機（Ｓｏｒ
ｖａｌ　ＧＬＣ−２Ｂ）にかける。遠心分離は１９０ｘ
ＩＩで５分間行う。過剰又は未結合細胞は自動洗浄機の
標準使用を介して等張塩類溶液で４〜６回洗浄すること
によって除去する。次に、所定量の試料を種々の粗度に
おいて凹部へ添加する。

試料は凹部において３７℃で１５分間まで高置させる。

余分の試料は除去して、プレートは等張塩類溶液中で１
１〜６回洗浄する。各凹部は次にＥＬＩＳＡのような標
準の免疫検定法によって細胞の表面上の抗原に結合した
抗体の存在を分析する。

実施例２ 本発明の教示はヒトの赤血球の血液型グループ全決定す
る検定に利用することができる。ミクロタイター・プレ
ートは実施例１におけるように調製する。一定量のヒト
のグループＡの赤血球を染料をコーティングした凹部に
添加して付着させ、遠心分離によってそこに固定化させ
る。余分の細胞は自動洗浄機によって洗浄除去する。細
胞単層は抗−Ａイムノグロブリンと感作する、そして洗
浄して余分のイムノグロブリンを除去する。別の組の四
部を同様に調製する。ヒトのグループＢＭＢ胞は抗−Ｂ
イムノグロブリンと感作する。未知のタイプの赤血球の
試料を凹部に添加して１分間遠心分離機にかける。その
試料細胞がグループＡの細胞の場合には、それらは細胞
単層上の抗−Ａイムノグロブリンに付着し、グループＡ
の血液型に対して正の反応を示す。グループＡ細胞はグ
ループＢＭＵ胞の単層上の抗−Ｂイムノグロブリンに付
着しない、そして遠心分離の後にミクロプレート凹部の
底部における個々のボタンによって負の反応が示される
。

実施例う 本発明の教示を取シ入れたキットは赤血球に対するＩＩ
ＩＧ　抗体の検出用に調製することができる。

複数のＵ型底部の凹部を有するミクロタイター・プレー
トは有機染料のアルシアン・イエローでコ−ティングす
る。そのプレートの凹部のグループに約３５〜５０μｊ
の洗浄、懸濁赤血球溶液全添加する。そのプレートは１
９０１１で５分間遠心分離する。余分の未結合細胞は除
去して、プレートを等張塩類溶液で１１〜６回洗浄する
。洗浄は自動洗浄器具の標準使用によって行う。これは
プレートの汚染の危険を低減する。それぞれの凹部へ７
０〜１００μｊの低イオン濃度の溶液を添加する。

次に３５〜５０μｌの既知標準又は患者又は提供者の血
清又は血漿試料を各凹部に添加する。そのプレートは３
７℃で少なくとも１５５分間装置る。

その混合体はプレートからデカントし、再び前記等張塩
類溶液で４〜６回洗浄する。その凹部ヘウサギの抗−ヒ
）Ｉ、９Ｇで予め感作された指標の赤血球３５〜５０ｍ
／ｉ添加する。そのプレートは直ちにｌｌ５０ｇで１分
間遠心分離する。そのプレートは照射表面に宜いて赤血
球単層への付着又は非付着を検査する。正の反応は反応
表面上での指標細胞の付着によって見られる。負の反応
は凹部の底部に指標赤血球の個々のボタンを形成し、付
着を示さない。

実施例４ 組織培養で成長したヒトの星細胞腫の表面上の抗原に特
異の抗体を検出する免疫検定を行うために、等張塩類溶
液に染料ｆ　１　ｍｇ　／　ｍｌの濃度で溶解さすこと
によってアルシアン・ブルーの溶液を調製する。その染
料溶液５００ｄをＵ型底のミクロタイター・プレートの
凹部へ添加して５０分間まで装置する。余分の染料は自
動ミクロプレート洗浄器具を使用して洗浄除去する。組
織培養流体中の懸濁星細胞腫細胞の溶液をＰＢＳで洗浄
して汚染タンパク質を除去する。一定量の細胞懸濁液を
アルシアン・ブルーをコーティングした凹部の各々に添
加し、ミクロプレートを収容できるロータ金偏えた遠心
機でミクロプレートラ遠心分離する。

遠心分離は１．９０！ｉで５分間行う。未結合細胞は自
動ミクロプレート洗浄装置を使用してＰ　Ｂ　Ｓ”ｉ洗
浄することによって除去する。次に、星細胞腫抗原に特
異のヒトの抗体を含むと考えられる一定量の試料を凹部
へ添加する。その試料は凹部において３７℃で５００分
間装置せる。余分の試料は除去し、プレー）ｉＰ　Ｂ　
Ｓで４〜６回洗浄し、ウサギの抗−ヒト免疫グロブリン
で予め感作された指標の赤血球３５〜５０μＩｆ凹部へ
添加する。

プレートは直ちに１１５ＯＦで１分間遠心分離する。

プレートは星細胞腫細胞の単層への付着又は非付着を検
査する。正の反応は反応表面上の指標細胞の付着によっ
てわかる。負の反応は凹部の底部における指標赤血球の
個々のボタンを形成し、付着を示さない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固相支持体；および正味正の電荷を有し前記支持体
   に吸着される疎水性芳香族環構造を有する有機染料の被
   膜から成ることを特徴とする固相免疫検定用品。 ２、前記有機染料に固定化された免疫反応性成分の単層
   を含む請求項１記載の固相免疫検定用品。 ３、前記免疫反応成分は捕乳類の細胞、細胞膜小胞およ
   び細胞膜断片から成る群から選ぶ請求項１記載の固相免
   疫検定用品。 ４、前記捕乳類細胞は赤血球、リンパ球、白血球、血小
   板および組織細胞から成る群から選ぶ請求項３記載の固
   相免疫検定用品。 ５、前記有機染料はアゾ染料、ジアゾニウム塩類、テト
   ラゾニウム塩類、テトラゾリウム塩類、トリフェニルメ
   タン、キサンチン、アクリジン、キノリン、チアゾール
   、インダミン、アジン、アミノアジン、チアジンおよび
   フタロシアニンから成る群から選ぶ請求項１記載の固相
   免疫検定用品。 ６、前記支持体が有機重合体製である請求項１記載の固
   相免疫検定用品。 ７、前記支持体がガラス製である請求項１記載の固相免
   疫検定用品。 ８、前記支持体は試験管、ミクロタイター・プレート、
   ビード、シート又は膜から成る群から選ぶ請求項１記載
   の固相免疫検定用品。 ９、正味正の電荷と疎水性芳香族環構造を有する有機染
   料で固相支持体をコーティングする工程； 免疫学的な片方を前記有機染料へ固定化する工程； 生物学的流体を前記固相支持体へ十分な時間をかけて添
   加して、前記生物流体中の免疫反応性成分を前面免疫学
   的片方へ結合させる工程； 前記支持体から過剰の流体を除去する工程；および前記
   免疫学的片方へ結合した前記免疫反応性成分の存在を試
   験する工程から成ることを特徴とする、生物学的流体中
   の免疫反応性成分のその免疫学的片方への付着を検出す
   ることによつて生物学的流体中の免疫反応性成分の存在
   を決定する固相免疫検定法。 １０、固相支持体が有機重合体製である請求項９記載の
   方法。 １１、前記支持体は試験管、ミクロタイター・プレート
   、ビード、シート又は膜から成る群から選ぶ請求項１０
   記載の方法。 １２、有機染料がアゾ染料、ジアゾニウム塩類、テトラ
   ゾニウム塩類、テトラゾリウム塩類、トリフェニルメタ
   ン、キサンテン、アクリジン、キノリン、チアゾール、
   インダミン、アジン、アミノアジン、チアジンおよびフ
   タロシアニンから成る群から選んだ化合物である請求項
   ９記載の方法。 １３、前記免疫学的片方は抗原、抗体、捕乳類の細胞、
   細胞膜小胞および細胞膜断片から成る群から選ぶ請求項
   ９記載の方法。 １４、前記捕乳類の細胞は赤血球、リンパ球、白血球、
   血小板および組繊細胞から成る群から選ぶ請求項１３記
   載の方法。 １５、前記捕乳類の細胞、細胞膜小胞、および細胞膜断
   片は前記表面の抗原に結合した抗体を有する請求項１３
   記載の方法。 １６、前記免疫反応性成分は抗原と抗体から成る群から
   選ぶ請求項９記載の方法。 １７、前記支持体はガラス製である請求項９記載の方法
   。 １８、正味正の電荷と疎水性芳香族環構造を有する有機
   染料をコーティングした固相支持体を供給する工程； 免疫学的片方を前記有機染料へ付着させる工程； 生物学的流体を前記固相支持体へ十分な時間をかけて添
   加して、前記流体中の免疫反応性成分を前記免疫学的片
   方へ結合させる工程； 過剰の流体を前記支持体から除去する工程； および前記免疫学的片方へ結合された免疫反応性成分の
   存在を試験する工程から成ることを特徴とする、免疫反
   応性成分のその免疫学的片方への付着を検出することに
   よつて生物学的流体中の免疫反応性成分の存在を検出す
   る固相免疫検定法。 １９、前記免疫学的片方は各々が細胞表面抗原を有する
   捕乳類の細胞、赤血球、血小板、白血球、およびリンパ
   球から成る群から選ぶ請求項１８記載の方法。 ２０、前記免疫反応性成分が、前記捕乳類の細胞、赤血
   球、リンパ球、白血球又は血小板の１つに特異の血清又
   は血漿に存在する抗体である請求項１８記載の方法。 ２１、前記免疫反応性成分の存在が指標の赤血球の添加
   によつて決定される請求項２０記載の方法。 ２２、免疫検定を行うのに適した固相支持体を供給する
   工程； 正味正の電荷と疎水性芳香族リング構造を有する十分な
   量の有機染料を前記支持体へ接触させる工程； 前記染料を前記支持体に十分な時間接触させて該染料を
   前記支持体へ吸着させる工程；および 前記支持体にすずきを与えて未吸着の染料を除去する工
   程から成ることを特徴とする免疫検定用固相支持体の製
   造法。 ２３、前記支持体が有機重合体製である請求項２２記載
   の方法。 ２４、前記支持体がガラス製である請求項２２記載の方
   法。 ２５、前記支持体は試験管、ミクロタイター・プレート
   、ビード、シート又は膜から成る群から選ぶ請求項２２
   記載の方法。 ２６、前記支持体が複数の凹部を有するミクロタイター
   ・プレートである請求項２２記載の方法。 ２７、前記有機染料はアゾ染料、ジアゾニウム塩類、テ
   トラゾニウム塩類、テトラドリウム塩類、トリフェニル
   メタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、チアゾー
   ル、インダミン、アジン、アミノアジン、チアジン、フ
   タロシアニンから成る群から選ぶ請求項２２記載の方法
   。 ２８、前記アゾ染料は化学式Ｃ＿３＿８Ｈ＿４＿２Ｎ＿
   ８Ｓ＿Ｃｌ＿２を有する化合物である請求項２７記載の
   方法。 ２９、前記化合物は１μｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌの濃度を
   有する溶液に溶解される請求項２８記載の方法。 ３０、前記フタロシアニンが次の構造を有することを特
   徴とする請求項２７記載の方法。▲数式、化学式、表等
   があります▼ 但し、式中のＸは次の構造を有するオニウム基である： ▲数式、化学式、表等があります▼ ３１、前記フタロシアニンが１μｇ〜１ｇ／ｍｌの濃度
   を有する溶液中に溶解される請求項３０記載の方法。