NO153988B - Fremgangsmaate for bestemmelse av celletype eller forenlighet paa en fast matrise. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise.

For mange medisinske formål er det nødvendig å bestemme forenligheten mellom blod fra en giver og en pasient. Blodcelleforenligheten bestemmes ved en ikke-opptreden

av en immunologisk reaksjon mellom antistoffer i blod-

serum hos en pasient og antigenet som er til stede i blodceller fra en giver. Hvis f.eks. blodcellene hos en pasient er av type A (dvs. har "A"-antigener på de røde blodceller), så vil serum fra en slik pasients blod ha anti-B-antistoffer, dvs. antistoffer som vil reagere med "BM<->celler. Hvis en slik pasient får "B"-blod, så vil det skje en immunologisk reaksjon mellom nevnte anti-B-antistoffer hos pasientens serum og B-antigenene i de røde blodceller fra giveren. En slik uforenlighet kan resultere i meget alvorlige tilstander p.g.a. en.intravaskulær hemolyse.

Prøver på blodcellers type og forenlighet er vanligvis

av to typer: (i) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff tilsatt cellene vil frembringe en agglutinering av disse, og (ii) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff som tilsettes de prøvede celler sammen med serumkomplement vil forårsake cellelysering.

Den første av disse to typer prøver, dvs. agglutinering, refererer seg til en sammenklumping av blodceller som f.eks. inneholder type A-antigener, og hvor anti-A-antistoffer tilsettes i et fravær av komplement. A-antigenet og anti-A- antistoffene reagerer spesifikt med hverandre ved en immunologisk reaksjon hvor antistoffet danner broer mellom tilstøtende celler. Dette fører til en sammenbundet masse av blodceller som bindes til hverandre ved hjelp av de nevnte tilsatte antistoffer.

Den andre av de to prøver som er nevnt ovenfor, dvs. cellelysering, angår opprivning eller oppløsning av celle-membranen som fører til en celledød, og som gjør at de frigir sitt indre innhold. "Cellelysering" er et resultat av en reaksjon som skjer mellom antistoffer som er bundet til cellemembranene og en gruppe potensielt destruk-tive proteiner i normalt serum (ofte kalles disse "komplement" .

Begge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter brukes for ut-prøving av type og forenlighet i cellulære blodlegemer, dvs. erytrocytter, granulocytter, lymfocytter og trombocytter eller plater. Skjønt de ofte brukes bare kvalitativt, så er begge metoder reelt kvantifiserbare og har vært brukt separat for bedømmelse av antigen, antistoff og serumkomplement.

I de fremgangsmåter som brukes i vanlige medisinske klinikker i dag for prøving av celletyper og deres forenlighet, så er både agglutineringsprøvene og celleoppløsnings-prøvene utført i en flytende fase, dvs. at serum som inneholder antistoffer med eller uten det komplement som skal prøves, blir blandet med suspensjoner av blodceller hvor man ønsker å få en utprøving av deres type og forenlighet. Vanligvis blir det brukt faste volumer.

En bedømmelse av resultatene etter en agglutineringsprøve krever at en teknikker eller lignende kvalifisert perso-nale kan skille mellom en celleagglutinering som skyldes nevnte spesifikke antigen-antistoff sammenbinding fra en ikke-spesifikk cellesammenklumping, hvor usammensatte krefter også kan forårsake en viss grad av sammenklumping. Nevnte teknikker må også være i stand til å skille frie uagglutinerte celler som kan være til stede fra sammenklumpede eller agglutinerte celler. Dette er en fremgangsmåte som krever meget erfarent personell eller meget kostbart utstyr eller instrumenter for nøyaktig partikkel-telling og fordeling på størrelse. Videre vil graden av spesifikk agglutinering i hvert enkelt tilfelle enten bli dårlig eller semi-kvantitativt, eller være meget kostbart og komplisert å utføre.

Skjønt det er utviklet visse instrumenterte prøver for utprøving &v røde blodcellers type ved agglutinering, så

er utstyret for disse fremgangsmåter både kostbart og komplisert å bruke. Det er f.eks. foreslått en anordning for prøving av røde blodceller i et instrument som brukes under navnet "Autoanalyzer" fremstilt av Berkman et al. og beskrevet i Transfusion, Vol. 11, nr. 6, side 317 og følgende (19 71). I nevnte Autoanalyzer blir blodprøver og serum med antistoffer kombinert under spesielle om-stendigheter i komplekse rørformede spiraler som er utformet slik at de skal frembringe en agglutinering. Den reagerte masse føres så forbi et T-rørledd med et av rørene i ned-advendt stilling, slik at de agglutinater som er blitt dannet, har tendens til å gå ned gjennom dette rør, og deretter fjernes. Agglutineringen kan så påvises ved å måle graden eller forskyvningen i optisk tetthet i den ikke-agglutinerte fraksjon som kommer ut i horisontal retning fra nevnte T-rør (Berkman et al.), eller ved å oppsamle agglutinatene fra den nedadvendte delen av T-røret på et filterpapir (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, side 348, 1969). Apparatet er imidlertid komplekst og kostbart, og fører i seg selv ikke til en enkel og automatisk teknikk som er egnet for rutinebruk i blodbanker og lignende.

Et alternativt apparat er beskrevet under navnet "Groupa-matic" og koster flere hundre tusen dollar (se Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, side 241, 1974). I dette apparatet blir serum og blodcellesuspensjoner kombinert slik at man man får frembragt en agglutinering. Nærværet av agglutinering påvises ved å føre suspensjonen tvers over to lysstråler, hvorav den ene går gjennom sentrum av reaksjonskuvetten mens den andre går gjennom periferien.

En forskjell i transmisjonen av strålene tas som et mål

for styrken på agglutineringen. Det er imidlertid nødvendig med meget avansert elektronisk utstyr, og dette betyr at instrumentet blir så kostbart at det faller utenfor rekke-vidde for de aller fleste blodbanker.

Prøver basert på en immunlysering er intet problem når reaksjonen på celleoverflaten mellom antigen og antistoff er effektiv med komplement, f.eks. for utprøving av vev. Dette er imidlertid meget sjeldent tilfelle med røde blodceller fra mennesker, hvor enten cellemembran antigen-antistoffkomplekset reagerer ineffektivt med komplement, eller antistoffkonsentrasjonen må være begrenset for å hindre en for intens agglutinering som mekanisk vil på-virke immunlyseringen.

Slike problemer påvirker i høy'grad driften av blodbanker hvor selv en vanlig rutineutprøving av typer for røde blodceller er en tidskrevende manuell operasjon som krever vanligvis mer erfarent og utdannet personell enn det som er tilgjengelig. Videre er det relativt få blobanker som kan påta seg lymfocytologiske prøver som er nødvendig for utprøving av forskjellige typer vev. Det er videre ingen direkte immunologiske prøver som er,tilgjengelige for å bestemme forenligheten mellom granulocytter, og det er bare en indirekte prøve for blodplater såsom 14C-serotonin-frigjøring. (Skjønt granulocytter og blodplater til en viss grad kan betegnes HL-A-typer for visse utvalgte og passende prøver, så vil slik typeprøving ikke garantere deres forenlighet.)

Man har nå i foreliggende oppfinnelse oppdaget at både agglutinering og celleoppløsningsprøver på blodceller hos mennesker i vesentlig grad kan forbedres når et monolag av reaktive celler irreversibelt bindes til en fast matrise. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man (a) danner et første monolag av celler som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet nevnte celler har egne eller ervervede antigener; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoadsorpsjon til nevnte første lag av celler, i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i nevnte første lag; og (c) deretter måler graden av immunoadsorpsjon av nevnte antistoffer ved å påføre en annen oppløsning inneholdende lytisk komplement som lyserer cellene i laget (a) effektivt i nærvær av immunoadsorbert antistoff, og observerer graden av immunlysis som forekommer.

Ved en irreversibel binding av celler til en fast matrise mener man binding av reaktive celler ved molekylære krefter, slik som en dannelse av kovalente kjemiske bindinger mellom posisjoner på celleoverflaten og reaktive grupper på substratet, eller ved at det dannes bindinger ved svakere molekylære krefter som van der Waal-krefter, kolumbiske krefter eller hydrogenbindinger som vil motstå effekten av de videre utprøvningsbetingelser. Ikke bare øker man sensi-tiviteten eller følsomheten ved prøvingen, men resultatet av immunreaksjonen lar seg lett måle ved enkle instrumenter.

Som en enkel illustrasjon kan nevnte blodtypeprøver ut-føres i tre trinn: (1) Et encellet lag av erytrocytter (som er illustrasjon, så vil disse bli betegnet type A) bindes irreversibelt til til en fast matrise; (2) ved å bruke monolaget av celler som et immuno-adsorpsjonslag, blir antistoffer som anti-A-antistoffer påført og adsorbert spesifikt, og (3) de anti-stoffbelagte celler kan nå prøves for deres følsomhet

for immunlysering ved komplement (fastfase-lysering).

Prøveresultatet kan bedømmes på enhver hensiktsmessig

måte, f.eks. ved undersøkelse under et mikroskop, men det er av spesiell viktighet i foreliggende oppfinnelse at prøveresultatene er spesielt godt egnet for bedømmelse ved tetthetsmålingsteknikk hvor man bruker lett tilgjengelige standardinstrumenter.

J?røving av_antigener ve d konkurr erende immunoa dsorpsjon

Denne prøve innbefatter følgende trinn (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som man vet bærer antigener som skal prøves, under slike betingel-ser at man effektivt og irreversibelt får bundet et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en blanding av (i) en oppløsning av et antistoff som lar seg reagere ved immunadsorpsjon med det antigen som bæres av cellene i nevnte lag (a), og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon- som skal bedøm-mes for antigen ved konkurrerende hemmning av antistoffet i nevnte oppløsning (i):, og (c) deretter måler hvorvidt og hvor sterkt nevnte antistoff i oppløsning (i) er bundet ved immunadsorpsjon til nevnte lag (a).

I ovenstående fremgangsmåte kan graden av immunoadsorpsjon bestemmes ved en eller flere av de teknikker som generelt er beskrevet ovenfor.

Til tross for langvarige kliniske problemer forbundet med utprøving i blodbanker samt nødvendigheten av å forbedre fremgangsmåter og gjøre disse tilgjengelige for instrumen-

tering og automasjon, har det vært lite fremgang på

feltet i de senere år. I en rekke år har man brukt de såkalte "Eldon"-kort for prøver av blodtyper. Disse kort er bl.a. beskrevet i US patent 2.770.572. Dette patent beskriver et prøvekort som kan brukes for prøving av typer i menneskeblod, hvor et bærende- ark bærer på forskjellige steder på overflaten tørkede prøver av forskjellige sera som inneholder antistoff-faktorer i en blanding med konglutinin eller konglutinin-erstatnings-stoffer. Når man utfører en blodtypeprøve ved hjelp av dette kort, blir blodprøver fra den pasient hvis blod man skal typebestemme, plassert i små dråper på de forskjellige serumflekker som finnes på kortet, og deretter under-søkt etter en passende reaksjonstid for nærvær av agglutinering. Prøvene er imidlertid begrenset til anti-A,

anti-B og anti-Rh (RhQ eller D), og selv disse prøver er forbundet med betydelige tolkningsfeil.

Mer nylig beskrives i US patent 3.666.421 et annet diag-nostisk prøveobjektglass hvor serologiske reagenser er plassert i dråper på prøveglasset og tørket til en flekk som deretter kan rekonstitueres og reageres i en agglutineringsreaksjon for identifikasjon av blodtype (eller andre antigen-antistoff-reaksjonssystemer som lar seg identifisere ved agglutinering). Det objektglass som er beskrevet i nevnte US patent har imidlertid visse defekter som er karakteristisk for vanlig flytende fase-agglutinering, idet prøven i alt vesentlig bare viser nærvær eller fravær av agglutinering og er avhengig av en bedømmelse av erfarent personell for å bestemme hvorvidt agglutineringen er et resultat av en spesifikk antigen-antistoff-reaksjon eller kun er et resultat av en ikke-spesifikk celleaggregering. Det er vanskelig å bedømme hvorvidt frie, uagglutinerte celler er til stede sammen med sammenklumpede celler i spesifikke agglutinater.

I US patent 3.770.380 beskrives en anordning som er angitt

å kunne bedømme immun-adhesjonsreaksjoner. Det skal imidlertid bemerkes at nevnte immun-adhesjonsreaksjoner som beskrives i dette US patent, skiller seg fra de immun-adsorps jonsfenomener på hvilke foreliggende oppfinnelse er basert. Immun-adhesjon er en ikke-spesifikk sammenklumping av partikler eller celler som skyldes nærværet av komplement, og i denne prøve er det komplementet som forårsaker bindingen. Immun-adhesjon er karakterisert ved ikke-spesifikke reaksjoner mellom komplementet og de partikler eller celler det binder. Immun-adsorpsjon er på den annen side en spesifikk binding mellom antigeniske posisjoner på en cellemembran og de antistoffer som måtte være til stede i et serum. Således er immunadsorpsjon i mot-setning til immunadhesjon en spesifikk blanding mellom antigener og antistoffer.

Den anordning som er beskrevet i US patent 3.770.380 er

en flat, cellelignende struktur som er belagt med suksessive lag av et bakterie- eller virusholdig materiale som et topplag, som er bundet til bunnen av cellestrukturen eller anordningen ved hjelp av et transparent tørket protein-underlag. Immun-adsorpsjonsreaksjoner mellom bakterier eller virus i det således preparerte lag og røde celler som har antistoff og komplement i en prøvevæske som påføres, kan så bedømmes ved å bestemme graden hvorved de spesielt fremstilte røde celler i den påførte væske fester seg til det bakterie- eller virusholdige topplag. De fremgangsmåter som er beskrevet i ovennevnte US patent har ikke funnet praktisk klinisk anvendelse p.g.a. at immun-adhesjon i seg selv ikke er særlig anvendbart, fordi immun-adhesjon er en ikke-spesifikk reaksjon som ikke er egnet for bedømmelse av spesifikke antigen-antistoffreaksjoner.

Et lag av blodceller innleiret i et fast bærende lag er blitt brukt for visse vitenskapelige formål som ikke har noe å gjøre med blodtyper og prøving av forenlighet. Slike lag er ikke bundet ved kovalente eller andre molekylære krefter. Således beskriver Goodman (Nature, 193:350, 1962) en kolonne av formalinisert røde blodceller fra mennesker innleiret i polyuretan som han brukte for å fraksjonere anti-antistoffer fra røde blodceller hos mennesker på

basis av deres bindestyrke til de innleirede røde celler. Edelman et al. (Proe. Nat. Acad. Sei. 68:2153, 1971) frak-sjonerte blodceller på basis av deres evne til spesifikt å binde seg til lektiner, antistoffer eller antigener som på forhånd var bundet til partielt hydrolyserte nylon-fibre.

Prinsippet med å binde en prostetisk gruppe (i et

antigen, antistoff, enzym, etc.) til en fast matrise, er en velkjent og etablert biokjemisk metode (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), og er meget anvendt i fastfase radioimmunoprøver (se Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974) . Imidlertid har blod eller andre celler ikke vært bundet irre versibelt til en fast matrise for å lette blodtypeprøving eller forenlighetsprøving, etc.

Det er .i det etterfølgende gitt en beskrivelse av oppfinnelsen med hensyn til de nåværende brukte prøver med erytrocytter. Polystyren-prøverør ble belagt med fibrinogen (mengde 0,5 mg/ml) som binder irreversibelt. Etter vasking ble polylysin (0,1 mg)ml) påført den bundne fibrinogen. Etter ytterligere vasking tilførte man en suspensjon av enten normale eller proteasebehandlede erytrocytter (RBC) . Disse erytrocytter ble bundet irreversielt (for det formål at de skulle prøves) som et monolag på den polylysin-fibronogen-belagte polystyren-overflate. Bindingstettheten på 2 x 10 erytrocytter pr. cm 2 er i god overensstemmelse med det som kunne forventes for slike erytrocytter som har en diameter på 7 mikrometer.

Monocellelaget til de bundne erytrocytter er stabilt og vil

i sin tid kunne tjene som et immunadsorpsjonsmiddel for å binde antistoffer fra en påført oppløsning eller et serum som er spesifikt til antigeniske posisjoner på membranene i de bundne erytrocytter.

Metoden for å binde blodceller som et monolag på en fast matrise er ikke nødvendigvis begrenset til ovennevnte formål. Den litteratur som beskriver kobling av proteiner til polymerer (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971), indikerer at man som et alternativ kan bruke preparater av polymerer (flak av polyuretan, polystyren, etc.) som på sine overflater inneholder reaktive grupper som glutaraldehyd, cyanogenbromid, amino eller karboksyl-grupper, og andre som vil tillate en direkte kovalent binding av blodceller til matrisen.

Det er selvsagt at bindestoffet må være immunologisk in-aktivt med hensyn til eventuelle antigener eller antistoffer som kan være til stede i de prøveoppløsninger som skal anvendes .

Andre substrater eller matriser som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, kan være ethvert hensiktsmessig materiale som (1) er av en slik karakter at et monocellelag irreversibelt kan bindes slik det er beskrevet ovenfor, og (2) er egnet for å brukes med hensyn til den påvirningsmetode som skal brukes. Ettersom de fleste hensiktsmessige påvisningsmetoder er basert på lystransmisjon, såsom mikroskopisk telling og scanning med hensyn til tetthetsmåling, så er det foretrukket at man bruker et lystransparent substrat.

Hvis man imidlertid skal bruke måling av radioaktivitet,

så er det selvsagt unødvendig å bruke et lystransparent materiale.

For det foreliggende formål kan substratet eller matrisen ganske enkelt være innersiden av et prøverør. Hvis en densiometrisk scanningmetode skal brukes for å bedømme prøveresultatene, så er det hensiktsmessig å bruke en flat overflate. Hvis man skal bruke prøving i stor skala, kan man bruke striper av matriser med cellebindende egenskaper for å fremstille det første cellelaget. Deretter kan antistoffer merkes og prøves for sin kapasitet til å understøtte en immunlysering i nærvær av komplement.

Det kvantitative resultat kan så bestemmes ved scanning-densiometri ved tap av farge som indikerer lysering.

Det skal bemerkes at i foreliggende oppfinnelse vil bindingen av antistoff ved en immunadsorpsjon til et lag av røde blodceller gi flere viktige fordeler. For det første kan man bruke sera med konsentrasjoner av"antistoffer som er for lave for vanlige væskefaseprøver, fordi deres spesifikke antistoffinnhold kan konsentreres som bundet antistoff på monocellelaget. For det annet, under omstendig-heter hvor ufortynnet sera ikke kan brukes i væskefase-prøver p.g.a. andre forstyrrende serumproteiner, så elimineres slik forstyrrende påvirkning med fast fase ved selektiv adsorpsjon av det antistoff som skal prøves og hvoretter vasking foretas for å fjerne de forstyrrende proteiner. For det tredje er mange sera ubrukbare for væskefaseprøver p.g.a. at de inneholder ikke-fjernbare antistoffer med uønsket spesifisitet. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det ved et passende valg av celler som skal danne et første lag, umulig å adsorbere bare de antistoffer som skal prøves.

Foreliggende oppfinnelse er meget godt egnet for prøving

av både celletype og celleforenlighet. For celletypifise-ring vil man f.eks. konstruere et første lag med sitt bundne antistoff av celler og antistoffer av en kjent type. For a utføre forenlighetsprøver kan blodgiverens celler brukes til å danne det første monocellelag som deretter reageres med hensyn til mulige antistoffer i en pasients serum, som så vil bli bundet ved immunadsorpsjon. Deretter kan disse

påvises ved lysering etter man har tilsatt komple-

ment .

Påvisningsmetoder .som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse, vil være innlysende for fagfolk. Erytrocytter inneholder sin egen etikett, nemlig pigmentert protein (hemoglobin) som har en maksimal adsorpsjon ved 415 nm. Nærvær eller fravær av erytrocytter kan derfor hensiktsmessig påvises slik det er beskrevet ovenfor. Man kan imidlertid også bruke annen påvisningsteknikk hvis dette er ønskelig. Slik teknikk innbefatter at man bruker radio-aktive atomer (f.eks. Cr, I) biokjemisk teknikk

(f.eks. ved hjelp av et utvalgt intracellulært enzym)

eller påvisning ved hjelp av fluorescens (f.eks. ved å bruke en molekylære forbindelse for å identifisere enten en levende eller død celle) . Alle disse metoder kan lett instrumenteres og derfor gjøres automatiske. De kan enten anvendes for serologiske prøver i blodbanker, medisinsk blodprøve-typifisering, vevstypifisering og prøver for blodoverføring eller før transplantering for forenlighet.

Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse også har anvendelse på andre problemer som innbefatter immuno-spesifikke cellereaksjoner. En slik prøve er anti-globulinprøver for å bedømme celler for deres belegg av IgG, IgM, IgA, IgD og IgE immunoglobiner, og ved C3, C4 og

andre komplementkomponenter eller bundne aktiveringsproduk-ter (se Rosenfield et al., Vox-Sang, 26: 289-333, 1974). Et

annet anvendelsesområde vil være fastfase-prøver med kvantitativ bedømmelse, av både passive og reversert passive hemagglvtineringsprøver. Passive hemagglutinerings-prøver kan brukes for direkte analyse av antistoff-konsentra-sjon og også for indirekte analyse av oppløselige antigen-konsentrasjoner ved konkurrerende binding på basis av felles antigener (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893,

1972). Reverserte passive prøver måler oppløselig antigen direkte (Cook, Immunol. 8:74, 1965 og Juji og Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39: 615, 1969). På lignende måte som blodceller kan prøves for deres følsomhet overfor antistoff-styrt lysering ved prøver i faste faser, så kan bakterier, protozoer, sopp og dyrkede cellelinjer enten fra vev eller svulster', analyseres for antigeniske bestanddeler på sin overflate ved de fastfase-prøver som heri er beskrevet.

Man kan endog forutse at man kan bruke fastfase-prøver

for å løse problemer som angår molekylær antistoff-konsentrasjon, K-verdien for antistoffbindingen og graden av K-verdiens heterogenitet.

Det er underforstått at mange av de underliggende kjemiske prinsipper som er brukt i foreliggende oppfinnelse, er vel-kjente. Oppfinnelsen er enestående fordi man ikke tidligere har forstått at disse prinsipper kunne brukes for å konstruere et fastfase-monocellelag som effektivt kan utføre blodcelletypifisering og prøver for å undersøke forenligheten mellom blodceller og andre celler.

Det følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.

Eksemp el

Imm unlys ering ved anti- A fra mennesker

Ved å bruke "Falcon" polystyren-prøverør (10 mm indre diameter x 75 mm) påførte man 0,2 ml av en fibronogenoppløs-ning (0,5 mg/ml) i 2 min., hvoretter man etter vasking på-førte 0,2 ml 140.000 molekylvekt poly-D-lysin HBr-oppløsning (0,1 mg/ml) i 2 min. Etter ytterligere vasking påførte man 0,2 ml av en 2-5% (volum/colum) suspensjon av type A^-celler i 0,9% NaCl i 2 min. Dette resulterte i at man fikk festet et flatt monolag av røde celler med en tethet på 2 x 10 6 celler/cm 2. Disse røde celler forble til-festet til tross for tallrike vaskinger, og til tross for påføring av sterk anti-A fra mennesker. Hvis man etter å

ha påført anti-A tilførte 0,2 ml komplement, så ble hemoglobin i de adherende røde celler frigjort, og graden av immunoppløsning kunne observeres ved måling, enten ved tilbakeholdt hemoglobin eller som tilbakeholdt eller fri-51

gjort radioaktivitet i form av Cr som ble forbrukt for å merke de celler som ble anvendt i monolaget. Med en standarddose av komplement kunne den oppløsende evne for anti-A måles kvantitativt. Alternativt kunne man ved hjelp av en standarddose av anti-A definere det oppløsende komplement og måle dette ved titrering in toto, via en klassisk vei ved komplementvirkningen (ved at man brukte marsvin RP (Pillemer, L. et al., Science 120: 279, 1954)), eller via den alternative properdin-vei (ved å bruke EGTA for å chelatere Ca<++>, men ikke Mg<++> i menneskeserum (upubli-serte observasjoner)).

Ingen av disse metoder for å studere immun A-antilysering kan utføres sensitivt og reproduserbart ved å bruke væske-faseprøver. IgM, IgG og IgA anti-A er alle meget effektive agglutininer for A-^celletyper, og agglutineringen for-styrrer immunlyseringen. Ved en prøve i fastfase kan den lytiske evne for anti-A bare måles, men også påvises ved en fortynning på 50X, noe som ikke er mulig i de andre typer prøver. De diagnostiske muligheter man har med foreliggende fremgangsmåter, er følgelig enorme.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, karakterisert ved at man (a) danner et første monolag av celler som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet nevnte celler har egne eller ervervede antigener; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoadsorpsjon til nevnte første lag av celler, i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i nevnte første lag; og (c) deretter måler graden av immunoadsorpsjon av nevnte antistoffer ved å påføre en annen oppløsnning inneholdende lytisk komplement som lyserer cellene i laget (a) effektivt i nærvær av immunoadsorbert antistoff, og observerer graden av immunlysis som forekommer .