DK153425B - Fremgangsmaade til bestemmelse af celletype eller kompatibilitet paa en fast matrix. - Google Patents

Description

DK 153425 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af celletype eller kompatibilitet på en fast matrix.

Til mange medicinske formål er det nødvendigt at bestemme kompatibiliteten mellem blod fra en donor og en patient.

Blodlegemekompatibilitet bestemmes ved den manglende forekomst af en immunologisk reaktion mellem antistoffer indeholdt i en patients blodserum og antigener til stede på blodlegemer fra en donor. Hvis f.eks. en patients røde blodlegemer er af type A (dvs. har "A" antigener på de røde blodlegemer), vil serumet fra en sådan patients blod indeholde anti-B antistoffer, dvs. antistoffer, som vil reagere med "B"-celler. Hvis en sådan patient modtager en transfusion af "B"-blod, vil en immunologisk reaktion indtræffe mellem anti-B antistofferne i patientens serum og B-anti-generne fra donorens røde blodlegemer. En sådan inkompatibilitet

2 DK 153425 B

kan resultere i alvorlige konsekvenser på grund af intravaskulær hæmolyse.

Undersøgelser 'af blodlegemers type og kompatibilitet består sædvanligvis af to typer: (i) en undersøgelse til bestemmelse af, om et specifikt antistof ved tilsætning til blodlegemerne vil bevirke deres agglutinering, og (ii) en undersøgelse til bestemmelse af, om et specifikt antistof ved tilsætning til de undersøgte blodlegemer sammen med serumkomplement vil bevirke blodlegemelysis.

Den første af disse to basisundersøgelser, agglutineringen, refererer til en sammenklumpning af blodlegemer indeholdende f.eks. type A antigener, til hvilke anti-A antistoffer er tilsat i fravær af komplement. A-antigenet og anti-A antistofferne reagerer specifikt med hinanden ved en immunologisk reaktion, hvor antistoffet danner broer mellem tilstødende celler. Dette fører til en tæt sammenknyttet masse af blodlegemer , som er sammenføjet med hinanden ved hjælp af de tilsatte antistoffer.

Den anden af de to undersøgelser, som er omtalt ovenfor, celle-lysis, angår brydningen af cellemembraner, som fører til cellernes død og frigørelse af deres intracellulære indhold. "Cellelysis" er resultatet af en reaktion, som indtræffer mellem cellemembranbundet antistof og en gruppe af potentielt destruktive proteiner i normalt serum (ofte kaldet "komplement").

Begge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder anvendes til typificerings- og kompatibilitetsundersøgelse af de celleformede blodelementer, erythrocytter, granulocytter, lymphocytter og blodplader (thrombocytter). Skønt de ofte kun anvendes kvalitativt, kan begge fremgangsmåder egentlig gøres kvantitative, og de har adskilt være anvendt til bestemmelse af antigen, antistof og serumkomplement.

Ved fremgangsmåderne til blodlegemetypificering og kompatibilitetsundersøgelse, som almindeligvis anvendes inden for det kliniske felt i dag, gennemføres både agglutineringsundersøgelser og celle-lysisundersøgelser i en flydende fase, dvs. at sera indeholdende antistoffer med eller uden komplement, som skal undersøges, blandes med suspensioner af blodlegemerne, for hvilke blodtype eller kompatibilitet skal vurderes. Sædvanligvis anvendes faste volumener .

Vurdering af agglutineringsundersøgelsesresultater kræver, at teknikeren skal skelne agglutinering af celler, som skyldes specifik antigen-antistof molekylær brodannelse fra ikke-specifik celleaggregering , ved hvilken uvedkommende kræfter også bevirker nogen grad

3 DK 153425 B

af sammenklumpning. Teknikeren må altså være i stand til at skelne frie uagglutinerede celler, som kan være til stede, fra sammenklumpede eller agglutinerede celler. Dette kræver yderst erfarent personale eller præcis partikelsortering og -tælling med dyre instrumenter. Tilmed er måling af graden af specifik agglutinering enten dårligt nok semi-kvantitativ eller bekostelig og kompliceret at gennemføre.

Skønt der er blevet udviklet nogle instrumenterede undersøgelser til typificering af røde blodlegemer ved agglutinering, er udstyret til disse fremgangsmåder både bekosteligt og kompliceret at anvende. P.eks. er ét udstyr, som er blevet foreslået til typificering af røde blodlegemer ad instrumentel vej, kendt under betegnelsen "AutoAna-lyzer" og fremstillet af Berkman et al., beskrevet i Transfusion, bind 11, nr. 6, pp. 317, et seq. (1971). I nævnte udstyr kombineres blodprøver og antistofsera under specielle omstændigheder i komplekse rørformede spiraler, som er udformet til at udvirke agglutinering. Reaktionsspiralerne passerer så et "T"-stykke med benet i en nedadrettet stilling, således at agglutinater, som er dannet, har tendens til at blive fjernet. Agglutinering kan påvises ved måling af formindskelsen i optisk tæthed i afgangsstrømmen fra "T"et, som medfører den ikke--agglutinerede fraktion (Berkman et al.), eller ved opfangning af agglutinaterne fra "T"et på filterpapir (Shield et al., Transfusion, bind 9, pp. 348, 1969). Apparaturet er imidlertid komplekst og bekosteligt og lader sig ikke bruge til en simpel automatisk teknik, som er egnet til rutinebrug ved blodbankundersøgelser.

Et alternativt udstyr kendes under betegnelsen "Groupamatic" og kan koste adskillige hundrede tusinde dollars (se Garretta et al., Vox Sang., bind 27, pp. 141, 1974). I Groupamatic-udstyret kombineres sera og blodlegemesuspensioner til frembringelse af agglutinering. Forekomsten af agglutinering påvises ved, at suspensionen ledes over to lysstråler, hvoraf den ene passerer gennem midten af reaktions-kuvetten, medens den anden passerer gennem periferien. En forskel i transmissionen af strålerne tages som mål for agglutineringsstyrken.

Der kræves imidlertid avanceret elektronisk udstyr, som bringer instrumentet uden for rækkevidde af alle andre end de største blodbanker.

Undersøgelser baseret på immun-lysis frembyder ikke noget problem, når celleoverflade antigen-antistof reaktionen giver effektiv gensidig påvirkning med komplement som til vævs- (f.eks. HL-A) typificering. Uheldigvis er dette sjældent tilfældet med røde menneskeblodlegemer, hvor enten cellemembran antigen-antistof komplekset samvir-

4 DK 153425 B

ker ineffektivt med komplement, eller antistofkoncentrationen må begrænses for at forebygge intens agglutinering, som mekanisk vil interferere med immun-lysen.

Disse problemer påvirker alvorligt driften af blodbanksserologilaboratorier, hvor selv rutinemæssig typificering af røde blodlegemer bliver en tidskrævende manuel operation, som kræver mere faguddannet og erfarent personale, end der kan fås. Ydermere kan relativt få blodbanker påtage sig lymfocytotoxiske undersøgelser, som er nødvendige til vævstypificering. Der er ingen direkte immunologiske undersøgelser tilgængelige til bestemmelse af præ-transfusionskompati-. biliteten af granulocytter og kun en indirekte undersøgelse for blodplader, såsom ^C-serotoninfrigørelse. (Selv cm granulocytter og blodplader kan tildeles HL-A typer ved udvalgte og passende undersøgelser, vil en sådan typificering ikke garantere deres kompatibilitet).

Det har nu overraskende vist sig, at både agglutinering- og cellelysisundersøgelser på menneskeblodlegemer kan forbedres betydeligt, når et monolag af reaktive celler bindes irreversibelt til en fast matrix.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en fremgangsmåde til bestemmelse af celletype eller kompatibilitet på en fast matrix, der er ejendommelig ved at man: (a) danner et første monolag af celler såsom erythrocytter, der irreversibelt bindes til en fast matrix, hvilke celler har iboende eller erhvervede antigener, (b) bringer laget (a) i kontakt med en opløsning indeholdende antistoffer, som kan bindes ved immunoadsorption til det første lag (a) af celler i den grad antistofferne i opløsningen er reaktive med antigenerne i cellerne i det første lag, (c) derefter applicerer en suspension af andre celler, såsom erythrocytter, hvilke andre celler -har antigener derpå, og (d) måler graden af immunoadhærering af laget af andre celler, som bindes med antistof til det første cellelag.

Ved irreversibel binding af celler til en fast matrix menes der binding af reaktive celler ved molekylære kræfter, såsom dannelse af kovalente kemiske bindinger mellem positioner på celleoverfladen og reaktive grupper på substratet, eller dannelse af bindinger ved svagere molekylære kræfter, såsom van der Waals kræfter, colum-biske kræfter eller hydrogenbinding, som vil modstå virkningen af de videre fremgangsmådebetingelser. Ikke blot er følsomheden af

5 DK 153425 B

undersøgelsesfremgangsmåden forøget, men resultaterne af immunreaktionen er lette at måle ved hjælp af simple instrumenter.

Som simpel illustration kan nævnte blodtypificeringsundersøgelse udføres i tre trin: (1) et monolag af erythrocytter (til illustration vil der blive refereret til type A) bindes irreversibelt til en fast matrix; (2) under anvendelse af cellemonolaget som immunoadsorbant kan antistoffer, såsom anti-A antistoffer appliceres og adsorberes specifikt; og (3) de antistof--belagte celler kan nu undersøges for deres evne til at binde et andet monolag af celler, som bærer passende antigener (fastfase agglutinering).

Undersøgelsesresultatet kan vurderes på enhver bekvem måde, såsom ved undersøgelse under et mikroskop; af særlig betydning for den foreliggende opfindelse er det imidlertid, at undersøgelsesresultaterne er særlig egnet til at blive vurderet ved densitometriske teknikker under anvendelse af let tilgængelige standardinstrumenter.

Til fast-fase hæmagglutinering kan undersøgelsespladen fremstillet på den foregående måde underkastes statisk eller scannende densito-metri ved bølgelængder, hvor hæmoglobinindholdet i de undersøgte erythrocytter er absorberende over for lys (f.eks, er blåt lys med en bølgelængde på 415 nm egnet). Scanningdensitometri involverer kun brug af veletableret laboratorieudstyr, som er let tilgængeligt og tilvejebringer kvantitative svar på spørgsmål, såsom (1) Er et andet lag dannet?, (2) Hvor mange celler repræsenterer dert andet lag? og ØD Hvordan er fordelingen af det andet lag? (med "fordeling" menes der ensartetheden af det andet lag. Et ensartet andet lag indebærer, at 100% af cellerne i den applicerede suspension bærer det nødvendige antigen til binding til det første lag, hvorimod en ikke-ensartet fordeling indebærer forekomsten af nogle "negative" celler i den applicerede suspension).

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til bedømmelse af immunologiske faktorer på celleoverflader kan tilstedeværelsen af antistoffer eller antigener, som er immunoadsorberet fra opløsningen, bekvemt påvises ved applicering af en anden suspension af cellepopulationen, som skal undersøges, efter at det bundne monolag er blevet omsat med antigen (eller antistof) opløsningen, og måling af dannelsen af et andet cellelag, hvori antigenet (eller antistoffet) med

6 DK 153425 B

kendt specificitet virker som et tværbindingsmiddel.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også anvendes til undersøgelse for konkurrerende reaktioner mellem opløsninger eller suspensioner af materialer, som er mistænkt for at dele antigeniske egenskaber. Der fremstilles således et irreversibelt bundet monolag af celler som beskrevet ovenfor. Dette lag bringes så i kontakt med en blanding af to opløsninger, den ene indeholdende antigener eller antistoffer med kendt specificitet, som er i stand til at inmunoadsorbe-res på det bundne cellemonolag, og en anden opløsning eller suspension, som skal undersøges. Konkurrerende binding af de kendte antistoffer eller antigener med faktorer til stede i den anden opløsning eller suspension vil genspejles ved en reduktion i dannelsen af im-munoadsorberingsreaktion med det irreversibelt bundne cellemonolag.

Parallel med denne fremgangsmåde er fremstillingen af et cellemonolag med et andet lag af antigener bundet dertil som beskrevet ovenfor. Konkurrerende reaktioner kan så måles mellem en suspension af celler, som er i stand til at danne et andet cellemonolag, og en anden opløsning eller suspension indeholdende ukendte faktorer, som skal analyseres. Forekomsten af konkurrerende immunologiske reaktioner mellem disse to suspensioner (eller suspension og opløsning) vil genspejles ved en reduktion i dannelsen af et andet cellemonolag.

Inden for disse generelle retningslinier kan man tænke sig følgende specifikke analysemetoder: 1. Analyse af antigener ved konkurrerende immunoadsorption. Denne analyse omfatter trin, hvor man (a) til en fast matrix applicerer en første suspension af celler, som vides at bære antigener, som skal undersøges, under betingelser, som er effektive til irreversibelt at binde et lag af cellerne til matrixen; (b) bringer laget (a) i kontakt med en blanding af (i) en opløsning af et antistof, som er reaktivt ved immunoadsorption med antigen båret af cellerne på laget (a), og (ii) en anden opløsning eller suspension, som skal analyseres for antigen ved konkurrerende inhibering af antistoffet i opløsningen (i); og (c) derefter måler graden, hvori antistoffet i opløsning-(i) er bundet ved immunoadsorption til laget (a).

2. Analyse af antigener ved konkurrerende inhibering. Denne analyse omfatter trin, hvor man (a) til en fast matrix applicerer en første suspension af celler, som vides at bære antigener, som skal undersøges, under betingelser, som er effektive til irreversibelt at binde et lag af cellerne til matrixen; (b) til laget (a) applicerer en opløsning indeholdende et antistof, som er reaktivt ved immu-

DK 153425 B

7 noadsorption med antigener båret af cellerne i laget (a); og (c) derefter applicerer en blanding af (i) en anden suspension af celler af populationen og (ii) en suspension eller opløsning indeholdende et antigen, som er konkurrerende reaktivt med det immunoadsorberede antistof fra opløsningen (b) og måler den grad, hvori celler fra den anden suspension danner et andet lag af celler på matrixen.

3. Analyse for antigener i nærværelse af antistoffer i en cellepopulation. Denne analyse omfatter trin, hvor man (a) til en fast matrix applicerer en første suspension af celler, som vides at bære antistoffer, under betingelser, som er effektive til irreversibelt at binde et lag af cellerne til matrixen; (b) bringer laget (a) i kontakt med en blanding af (i) en opløsning, som skal analyseres for antigen, og (ii) en anden opløsning eller suspension indeholdende antistoffer, som er reaktive ved immunoadsorption med antigenet, som skal analyseres, ved konkurrerende inhibering; og (c) derefter måler graden, hvori antigenet i opløsning (i) er bundet ved immunoadsorp-tion til laget (a).

Ved hver af de foregående fremgangsmåder kan graden af immunoadsorption bestemmes ved en eller flere af de teknikker ,f SOm er generelt beskrevet ovenfor.

Til trods for at de kliniske problemer, som er forbundet med blodbankserologi, har bestået længe, og til trods for behovet for at forbedre fremgangsmåderne og gøre disse fremgangsmåder egnede til instrumentering og automatiske teknikker har der for fagmanden inden for området været ringe hjælp at hente i den kendte teknik. De såkaldte "Eldon" kort til blodtypificering har været kendt i en række år. Disse kort er f.eks. beskrevet i U.S.A. patentskrift, nr. 2.770.572, som beskriver en testkort til brug ved typificering af menneskeblod, hvor der på forskellige dele af overfladen af et bæreark er anbragt prøver af testsera indeholdende antistoffaktorer i blanding med konglutinin eller konglutininerstatninger.

8 DK 153425B

Ved gennemførelse af blodtypificeringsundersøgelser under anvendelse af Eldon-kortet anbringes blodprøver fra patienten, hvis blod skal typificeres, i små dråber på de forskellige serumpletter, som findes på kortet, og undersøges, efter at en passende reaktionstid er forløbet, for tilstedeværelse eller fravær af agglutinering. Undersøgelserne er imidlertid begrænset til anti-A, anti-B og anti-Rh (RhQ eller D), og selv disse undersøgelser er forbundet med betydelige fortolkningsfej1.

For kortere tid siden er der i U.S.A. patentskrift nr. 3.666.421 beskrevet et andet diagnostisk prøvemedium, hvor serologiske reagenser er anbragt i dråber på et objektglas og tørret til en plet, som senere kan rekonstitueres og omsættes i en agglutineringsreaktion til identifikation af blodtype (eller andre antigen-antistof reaktionssystemer, som kan identificeres ved agglutinering). Disse prøvedbjekt-glas lider imidlertid af de mangler, som er karakteristiske for almindelig flydende-fase agglutinering, idet undersøgelsen i det væsentlige kun viser tilstedeværelse eller fravær af agglutinering, og bestemmelsen af, om agglutineringen er et resultatet af specifik antigen-antistof reaktion eller simpelthen resultatet af en ikke-specifik celleaggregering, afhænger af en kvalificeret teknikers vurdering.

Det er vanskeligt eller umuligt at vurdere, om frie ikke-agglutinere-de celler er til stede sammen med sammenklumpede celler i specifikke agglutinater.

I U.S.A. patentskrift nr. 3.770.380 beskrives et udstyr, som foreslås anvendt til vurdering af immunoadhærensreaktioner. Det skal bemærkes i denne forbindelse, at immunoadhærensreaktionerne, som dette patentskrift angår, afviger fra immunoadsorptionsfænomenet, som den foreliggende opfindelse er baseret på·Immunoadhærens er den ikke-speci-fikke sammenklumpning af partikler eller celler, som skyldes tilstedeværelsen af komplement, og ved denne prøve er det komplementet, som bevirker binding. Immunoadhærens er karakteriseret ved ikke-spe-cifikke reaktioner mellem komplementet og partiklerne og cellerne, til hvilke det binder I modsætning dertil er immunoadsorption en specifik binding mellem antigeniske positioner på en cellemembran og antistoffer, som er til stede i et serum. Immunoadsorption refererer således i modsætning til immuno adhærens til en specifik binding mellem antigener og antistoffer.

Udstyret, som beskrives i dette patentskrift, er en flad cellelignende konstruktion, som på bunden er forsynet med successive belægninger af et bakterie- eller virusmateriale som et toplag, der

9 DK 153425 B

er bundet til cellefundamentet ved hjælp af et transparent tørret proteinunderlag, Immunoadhærensreaktioner mellem bakterie eller virus på den således fremstillede enhed og røde blodlegemer, som bærer antistof og komplement, i et testfluidum, som er tilført dertil, vurderes så ved bestemmelse af den grad, hvori de specielt forbehandlede røde blodlegemer i det tilførte fluidum hænger fast på det bakterieeller virusholdige toplag. Den i patentskriftet beskrevne fremgangsmåde har ikke fundet praktisk klinisk anvendelse, fordi immuno-adhærens i sig selv ikke er blevet særlig udbredt, og fordi immuno-adhærens er en ikke-specifik reaktion, der ikke er egnet til vurdering af specifikke antigen-antistof reaktioner

Et lag af blodceller indlejret i et fast bæremateriale er blevet anvendt til videnskabelige formål, som ikke har relation til blodtypificering og kompatibilitetsundersøgelse. Sådanne lag er ikke bundet ved kovalente eller andre molekylære kræfter. Goodman (Nature, 193:350, 1962) fremstillede således kolonner af formalinbehandlede røde menneskeblodlegemer indlejret i polyurethan, som anvendtes til fraktionering af anti-antistoffer for humane røde blodlegemer på basis af styrken af deres binding til de tilbageholdte røde blodlegemer. Edelman et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. 68:2153, 1971) fraktionerede blodceller på basis af deres kapacitet til specifikt at bindes til lectiner, antistoffer eller antigener, som forud var blevet bundet til delvis hydrolyserede nylonfibre.

Princippet med binding af en prosthetisk gruppe (af et antigen, antistof, enzym, etc.) til en fast matrix er en veletableret biokemisk metode (Cuatrecases and Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), og det er vidt anvendt ved fast-fase radioimmunoanalvsefrem-gangsmåder (Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974). Blod- eller andre celler er imidlertid ikke blevet bundet irreversibelt til en fast matrix for at lette blod- eller vævstypificering, kompatibilitetsundersøgelse, etc.

Opfindelsen beskrives i det efterfølgende i relation til de i øjeblikket anvendte undersøgelser af erythrocytter. Polystyren-prøverør belægges med fibrinogen (der anvendes 0,5 mg/ml), som bindes irreversibelt. Efter udvaskning anbringes polylysin (0,1 mg/ml) på det bundne fibrinogen. Efter yderligere udvaskning indføres en suspension af enten normale eller proteasebehandlede erythrocytter (RBC). Disse RBC bindes irreversibelt (til undersøgelsesformål) som et monolag til den polylysin-fibrinogenbelagte polystyrenoverflade. Bindingstætheden på 2 x 10 RBC pr. cm er i god overensstemmelse med

10 DK 153425B

ctet, son kunne forventea for sådanne erythrocytter, som har en diameter rå 7 jj m.

Monolaget af bundne RBC er stabilt og vil på sin side tjene som immunoadsorbant for binding af antistoffer fra en tilført opløsning (eller serum), som er specifik for antigeniske positioner på membranerne af de bundne RBC.

Fremgangsmåden til binding af blodceller som et monolag på en fast matrix er ikke nødvendigvis.begrænset til ovennævnte formål. Litteraturen angående kobling af proteiner til polymere (Cuatrecases ,og Anfinsen, Annu. Rev. Bichem., 40:259, 1971) viser, at man som et alternativ kan anvende polymerpræparater (lag af polyurethan, polystyren, etc.), som på deres overflade indeholder reaktive grupper, såsom glutaraldehyd, cyanogenbromid, amino- eller carboxylgrupper og andre, som vil tillade direkte kovalent kobling af blodcellerne til matrixen. Det er indlysende, at den bindende substans må være immunologisk inaktiv med hensyn til ethvert af antigenerne eller antistofferne, som kan være til stede i undersøgelsesopløsningerne, som påtænkes brugt.

Andre substrater eller matricer til brug ifølge opfindelsen kan være ethvert bekvemt materiale, som er (i) af en sådan karakter, at et cellemonolag irreversibelt kan bindes til det som beskrevet ovenfor, og (ii) egnet til brug, når påvisningsmåden, som anvendes, tages i betragtning. Da de mest bekvemme påvisningsmåder er baseret på lystransmission, såsom mikroskopisk tælling og densitometrisk scanning, foretrækkes det, at der anvendes et lystransparent substrat.

Hvis imidlertid tælling af radioaktivitet anvendes, er det indlysende, at anvendelse af materiale, som er transparent over for lys, er unødvendig.

For opfindelsens formål kan substratet eller matricen simpelthen være den indre overflade af et prøverør. Hvis en densitometrisk scanningsfremgangsmåde skal anvendes til vurdering af undersøgelsesresultaterne, er en flad overflade hensigtsmæssig. Til formål, hvor der foretages undersøgelse i stor målestok, kan strimler af matricer med cellebindende egenskaber anvendes til fremstilling af det første cellelag. Derefter kan antistoffer anbringes i pletter og undersøges for deres kapacitet til enten at understøtte immunlysis i nærværelse af komplement eller til binding af et andet lag af celler af ukendt type. Det kvantitative resultat af begge undersøgelser kan så bestemmes ved scanningdensitometri, idet tab af farve indicerer lysis og tilvækst af farve indicerer binding af et andet lag af røde celler. For det sidste formål kan det være hensigtsmæssigt

11 DK 153425B

som en del af pietforbehandlingen hypotonisk at lysere det første cellelag/ således at baggrunden, som skyldes det første lag, ikke behøver at blive subtraheret, Hypotonisk lysis fjerner ikke signifikant meget membranbundet antistof, og dannelse af et andet lag kan påvises visuelt eller ved optisk densitometri ved hjælp af dets haano-globinindhold. Ved anvendelse af scanningdensitometri, f.eks. ved 415 nm kan kvantitative svar fås på spørgsmål, såsom "Er der dannet et andet lag?", "Hvor mange celler (udtrykt som et åbentbart maksimum) repræsenterer det andet lag?", "Hvad er fordelingen i det andet lag?".

For at besvare det sidste spørgsmål bør cellesuspensionen, som appliceres på det antistof-belagte monolag, have lige netop tilstrækkelig koncentration til at tillade udfældning af et andet monolag.

Det andet lag vaskes så til fjernelse af ikke-bundne celler, og efter denne udvaskning bliver fordelingen af de bundne dele af det andet lag en funktion af procentdelen af "positive" celler, som hænger ved, og af "negative" celler, som ikke hænger ved. Hullerne eller øerne, som er resultatet deraf, kan påvises ved mikroskopisk scanningdensitometri, og deres hyppighed og udstrækning kan udtrykkes som en relativ del af den scannede overflade.

Det skal bemærkes, at bindingen af antistof ved immuno-adsorption til et lag af røde blodlegemer frembyder talrige betydningsfulde fordele. For det første kan sera med antistofkoncentrationer, som er for lave til konventionelle flydende-fase undersøgelser,anvendes med succes, fordi deres specifikke antistofindhold kan koncentreres som bundet antistof på monolaget af celler. For det andet ophæves, under omstændigheder, hvor ufortyndede sera ikke kan anvendes til flydende-fase undersøgelser på grund af andre forstyrrende serumproteiner, sådan forstyrrelse i fast-fase undersøgelser ved selektiv adsorption af antistoffet, som skal undersøges, og udvaskning til fjernelse af de forstyrrende proteiner. For det tredie er mange sera nytteløse til flydende-fase undersøgelser, fordi de indeholder antistoffer med uønsket specificitet, som ikke kan fjernes. Ifølge den foreliggende opfindelse er det ved passende udvælgelse af cellerne, som danner det første lag, muligt udelukkende at a'dsorbere de antistoffer, som skal undersøges.

Den foreliggende opfindelse er egnet til undersøgelse af både celletype og cellekompatibilitet. Til celletypificering f.eks. kan det første lag med dets bundne antistof være konstrueret af celler og antistoffer af kendt type. Typen af ukendte celler fra en patient

12 DK 153425 B

eller donor vil så kunne bestemmes ud fra deres evne til at danne et andet cellelag. Til det formål at gennemføre kompatibilitetsundersøgelser kan der anvendes donorceller til dannelse af det første monolag, som dernæst ansættes med mulige antistoffer i en patients serum, som vil bindes ved immunoadsorption. Dette kan derefter påvises ved bestemmelse af evnen af..de bundne antistoffer fra patientens serum til dannelse af' et andet lag af de samme donorceller efter endnu en applicering (og den grad, hvori en sådan binding indtræffer).

Påvisningsmetoder, som er egnede til brug ved den foreliggende opfindelse, vil være indlysende for fagmanden. Erythrocytter indeholder deres egen mærkat, nemlig pigmenteret protein (hæmoglobin), som har en maksimum absorption ved 415 nm. Tilstedeværelsen eller fraværet af erythrocytter kan derfor bekvemt påvises specifikt som beskrevet ovenfor. Andre markeringsteknikker kan imidlertid om ønsket anvendes lige så godt. Sådanne teknikker omfatter brugen af radioaktive atomer (f.eks. ^Cr, ^½) , biokemisk teknik (f.eks. et udvalgt intracellulært enzym), eller fluorescens-påvisning (f.eks. under anvendelse af en molekylær prøve til identificering af enten en levende eller død celle). Alle disse metoder kan let instrumenteres og derfor underkastes automatisering. De er lige anvendelige til blodbankserologi, retsmedicinsk blodundersøgelse, vævstypificering samt præ--transfusions- og præ-transplantationsundersøgelse for kompatibilitet.

Som det er velkendt inden for området, er der et antal fremgangsmåder, som nu anvendes ved flydende-fase undersøgelser, som vil være lige så velegnede til fast-fase undersøgelser. Disse indbefatter den optimale brug af additiver, som vides at potentiere agglutinering (f.eks. symmetriske og asymmetriske hydrofile kolloider, proteaser, ionkoncentration, polyelektrolytter, tonicitet og puffersysterner til kontrol af pH-værdi). Disse faktorer beskrives f.eks. af Berkman et al., i Transfusion, 11:317, 1971.

Det må bemærkes, at den foreliggende opfindelse også kan anvendes i forbindelse med andre problemer, som involverer immuno-specifikke cellereaktioner. Et sådant er antiglobulinundersøgelser til vurdering af celler med hensyn til deres belægning med IgG, IgM, IgA,

IgD og IgE immunoglobuliner og med C3, C4 og andre komplementkomponenter eller bundne aktiveringsprodukter (Rosenfield et al., Vox--Sang., 26:289-333, 1974). Et andet anvendelsesområde ville være fast-fase undersøgelser med kvantitativ vurdering af både passive og omvendt passive hæmagglutineringsundersøgelser. Passive hæmagglu-

13 DK 153425B

tineringsanalyser kan anvendes til direkte analyse af antistofkoncentration og også til indirekte analyse af koncentration af opløseligt antigen ved konkurrerende binding på basis af fælles antigener (Nusbacher et al./ J. Immunol./ 108:893, 1972). Omvendte passive undersøgelser måler opløseligt antigen direkte (Cook, Immunol., 8:74, 1965 og Juji and Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39:615, 1969). Ligesom blodceller kan undersøges for deres modtagelighed for antistof--formidlet agglutinering eller lysis ved fast-fase undersøgelser, kan ydermere bakterier, protozoer, fungi og dyrkede cellelinier fra enten væv eller tumorer analyseres for antigenkomponenter på deres overflade ved de heri beskrevne fast-fase undersøgelser. Dét forventes endog, at fast-fase undersøgelser til sidst kan anvendes til at løse problemer i forbindelse med molekylær antistofkoncentration, K-værdi for antistofbinding og grad af K-værdi heterogenitet.

Det erkendes, at mange af de til grund liggende kemiske principper, som anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er velkendte. Opfindelsen er imidlertid unik, fordi det ikke tidligere har været erkendt, at disse principper kunne udnyttes til konstruktion af fast-fase cellemonolag til effektiv gennemførelse af blodcelletypificering og kompatibilitetsundersøgelser for blod- og andre celler.

Opfindelsen beskrives i det efterfølgende nærmere ved eksempler.

Eksempel l·

Blodtypificering

Problemet med typificering af.røde menneske blodlegemer og påvisning af Køde menneskeblodlegeme anti-antistoffer patidspunktet for præ-transfusionskompatibilitetsundersøgelse er betragteligt. De eneste midler til påvisning af viese blodtyper af røde menneske blodlegemer ved direkte agglutinering har således været bekostelige og komplicerede instrumenter (Berkman, E.M. et al., Transfusion, 11:317, 1971). Nu er det imidlertid lykkedes at tilpasse instrumenterede flydende-fase fremgangsmåder til fast-fase undersøgelse, og det er lyk- g kedes at opnå specifik typificering for Rh, Kell, Kidd, Duffy, Xg , Lewis, Lutheran og MNSs, alle med en følsomhed, som overstiger den, der opnås med de beskrevne instrumenterede flydende-fase undersøgelser.

14

DK 153425 B

Til blodtypificering konstrueredes et monolag af røde blodlegemer på følgende måde: under anvendelse af "Falcon" polystyren prøverør (10 mm'I.D. x 75 mm) appliceredes 0,2 ml fibrinogenopløs-ning (0,5 mg/ml) i 2 minutter efterfulgt, efter udvaskning, af applicering af 0,2 ml 140.000 molvægt poly-D-lysin HBr opløsning (0,1 mg/ml) i 2 minutter. Efter yderligere udvaskning appliceredes 0,2 ml 2-5% (vol/vol) suspension af type A^ celler i 0,9% NaCl i 2 minutter. Dette resulterede i adhæsion af et fladt monolag af røde 6 2 blodlegemer med en densitet på 2 x 10 celler/cm . Disse røde blodlegemer forblev adhærerede på trods af talrige udvaskninger.

Det således opnåede monolag eksponeredes først for kendt specifikt antistof (0,2 ml) og lyseredes dernæst hypotonisk med destilleret vand. På dette punkt tillodes en anden applicering af 0,1 ml røde blodlegemer i 0,2% (vol/vol) styrke at udfældes ved tyngdekraftens indvirkning som et let andet monolag. Det var nu muligt at forøge den specifikke antistofbinding af dette andet monolag på forskellige måder. F.eks. anvendtes Berkman et al.’s lavion metode med held ved først at erstatte ovenstående fluidum med en opløsning af 5% mannitol og 0,0025% prot-aminsulfat ved pH-værdien 6,0, og dernæst efter 5 minutter ved stuetemperatur at vaske det andet monolag med 0r0014M phosphat med 0,85% NaCl som puffer med pH-værdien 7,3. Dette fjernede ikke-antistof-bundne kendte negative celler, men ikke antistofbundne kendte positive celler. Men andre fremgangsmåder til forøgelse af antistofbindingen af cellerne viste sig at være endog mere fordelagtige, og nogle af disse kunne ikke anvendes med held ved Berkman"s instrumenterede flydende-fase metode. Den specifikke antistofbinding af det andet monolog kunne således forøges ved sekventiel erstatning af ovenstående fluidum først med en puffer med pH-værdien 7,0 indeholdende 2,5% PVP, og dernæst med en lignende puffer med pH-værdien 6,0 indeholdende 0,01% protaminsulfat. Disse prøver udvaskedes endelig med 0,2M phosphatpuffer med pH-værdien 7,3. Det er klart, at mulighederne for forstærkning af fast-fase agglutineringen er talringe, fordi fremgangsmåden undgår mange af de problemer, som: er forbundet med flydende-fase undersøgelser.

Disse fast-fase undersøgelser har vist sig at være ekstraordinært følsomme til påvisning af IgG Rh antistof. Der er opnået omtrent samme følsomhed på et antistofmolekyle pr.rød blodlegemebasis som beskrevet tidligere for forbedrede AutoAnalyzer-analyser, dvs.

15 DK 153425 B

«» 10 antistofmolekyler pr. blodlegeme ved 50% hæmagglutinering (Rosenfield et al., Ann. N.Y. Acad, Sc., 190:519, 1971). Ved fast--fase undersøgelserne anvendes imidlertid 1/1000 færre røde blodlegemer, og der opnås 1000 gange stærkere følsomhed , således at der påvises ca. 1 pg antistof protein/ml, hvilket overstiger følsomheden af alle tidligere beskrevne undersøgelser, inklusive undersøgelserne for celleoverlevelse in vivo.

Undersøgelser med anti-Rh gennemførtes også med held med pro-tease-behandlede røde blodlegemer. Sådanne undersøgelser gennemførtes på fladbundede mikrotiter polystyren skåle, som tillod mikroskopisk undersøgelse af specifikt adhærerede røde blodlegemer. Bundne celler var kun til stede, hvis de var Rh-positive, og ved undersøgelser af kunstige blandinger af Rh-positive og Rh-negative røde blodlegemer iagttoges "huller" fra ikke-adhærerende celler i areal at svare til procentdelen af Rh-negative celler i den kunstige blanding. Dette resultat viser, at man ifølge opfindelsen kvantitativt kan fastslå forholdet af ikke-bundne celler i en blodprøve, hvilket er et særdeles betydningsfuldt problem både ved analyse af transfusionscelleoverlevelse ved Ashby-fremgangsmåden (Arch. Int, Med., 35:516, 1925) og ved karakterisering af humane.chimærer (Race and Sanger, "Blood Groups in Man", Davis, 1968, pp. 475-490).

Eksempel 2

Direkte antiglobulinundersøgelser

Disse undersøgelser gennemførtes på lignende måde som blodtypificeringsundersøgelser bortset fra, at vaskede røde blodlegemer fra en patient med formodet erhvervet hæmolytisk anaemia anvendtes til opbygning af både det første og det andet cellemonolag. Første monolag (bundet med polylysin-fibrinogen) eksponeredes for et enkelt xenogenisk anti-humant globulinserum, og syv specificiteter vurderedes. Disse sera var individuelt specifikke for IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, C3 og C4. Det antistof-belagte første monolag .lyseredes dernæst hypotonisk og vaskedes før applicering af celler til det andet monolag. Bindingen af det andet monolag forstærkedes ved tilsætning af 1% K-90 polyvinylpyrrolidon (PVP, middel molvægt 300.000) i 0,9% NaCl. Det andet monolag vaskedes endelig med almindelig 0,9% NaCl. Fremgangsmåden ligner meget den af Hsu et al. (Vox Sang., 26:305, 1974) beskrevne, men positive resultater ved fast-fase undersøgelse var

Claims (1)

16 DK 153425 B klart bedre end resultaterne af Hsu's instrumenterede flydende-fase undersøgelser. En patient med aktiv erhvervet hæmolytisk anaemia, som på grund af intens spontan flydende-fase agglutinering med PVP ikke kunne typificeres for adhærerende proteiner, fandtes at være klart positiv for IgG, IgM, IgA, IgE, C3 og C4. Fremgangsmåde til bestemmelse af celletype eller kompatibilitet på en fast matrix kendetegnet ved, at man (a) danner et første monolag af celler, såsom erythrocytter, der irreversibelt bindes til en fast matrix, hvilke celler har i-boende eller erhvervede antigener, (b) bringer laget (a) i kontakt med en opløsning indeholdende antistoffer, som kan bindes ved immunoadsorption til det første lag (a) af celler i den grad antistofferne i opløsningen er reaktive med antigenerne i cellerne i det første lag, (c) derefter applicerer en suspension af andre celler, såsom andre erythrocy tter, hvilke andre celler har antigener derpå,' og (d) måler graden af immunoadhærering af laget af andre celler, som bindes med antistof til det første cellelag.