DE2636616A1

DE2636616A1 - Monolayer von irreversibel auf einem festen traeger gebundenen zellen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur durchfuehrung immunologischer reaktionen

Info

Publication number: DE2636616A1
Application number: DE19762636616
Authority: DE
Inventors: Shaul Prof Kochwa; Richard E Prof Rosenfield
Original assignee: Mount Sinai School of Medicine
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 1975-08-14
Filing date: 1976-08-13
Publication date: 1977-02-24
Also published as: FR2321127B1; DE2636616C2; NO840135L; IT1076463B; AU510384B2; NL7609061A; CA1089359A; NO153987B; AT357686B; NO153988C; CH631550A5; SE7609089L; FR2321127A1; SE8503429L; NO153987C; NO153988B; SE8503429D0; DK153425B; GB1555142A; BE845201A

Description

MT. SINAI SCHOOL OP MEDICINE OF THE CITY UNIVERSITY OF NEW YORK New York, N.Y., V,St.A,

" Monolayer von irreversibel auf einem festen Träger gebundenen Zellen, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Durchführung immunologischer Reaktionen "

Priorität: 14. 8. 1975, V.St.A., Nr. 6O4 8O8

Viele medizinische Verfahren erfordern die Bestimmung der Kompatibilität von Blutzel'len zwischen Spender und Patienten vor einer Bluttransfusion oder Transplatation. Die Kompatibilität von Blutzellen wird durch das Nichterscheinen einer ummunologischen Reaktion zwischen im Blutserum eines Patienten enthaltenen Antikörpern und einem Antigen, das in den Blutzellen des Spenders enthalten ist, bestimmt. Wenn beispielsweise die Erythrozyten eines Patienten dem Typ A angehören, also die Erythrozyten das Antigen "A" aufweisen, enthält sein Serum anti-B Antikörper, d. h. seine Antikörper vrürden mit "B" Zellen reagieren. Eine derartige Inkompatibilität kann wegen der daraus resultierenden intravasculären Hämolyse schwerwiegende Polgen haben.

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Für die Typisierung und den Nachweis der Kompatibilität von Blutzellen gibt es zwei verschiedene Arten von Testen: 1. Teste, mit deren Hilfe festgestellt wird, ob die Zugabe eines spezifischen Antikörpers die Agglutination der Blutzellen verursacht und 2. Te ste, die nachweisen, daß ein spezifischer Antikörper zusammen mit . Komplement die Lysis der getesteten Blutzellen bewirkt.

Der erste Typ dieser Teste, die Agglutination, basiert auf der Verklumpung der Blutzellen. Wenn die Zellen z. B. Typ A Antigen enthalten, werden sie durch anti-A Antikörper in Abwesenheit von Komplement agglutiniert. Das Α-Antigen und die anti-A Antikörper reagieren spezifisch miteinander durch eine immunologische Re-" aktion, wobei die Antikörper Brücken zwischen den nebeneinanderliegenden Zellen ausbilden. Dies führt zu einer verklumpten Masse von Blutzellen, die durch die zugefügten Antikörper miteinander verbunden sind.

Der zweite Typ der vorgenannten Teste, die Zellysis, basiert auf dem Nachweis der Zerstörung der Zellmembranen und dem daraus resultierenden Zelltod und der Freisetzung des Zellinhalts. Die Zellysis ist das Ergebnis einer Reaktion zwischen Antikörpern, die an die Zellmembran gebunden sind, und einer Gruppe potentiell -destruktiver Proteine des normalen Serums, die "Komplement" genannt werden.

Beide vorstehend beschriebenen Methoden werden für die Typisierung und Kompatibilitätsuntersuchungen der zellulären Blutelemente, Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten und Thrombozyten,

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verwendet. Obwohl sie häufig nur rein qualitativ eingesetzt werden, können sie auch quantitativ verwendet werden und dienen dann dein Nachweis von Antigen, Antikörper und Serumkomplement.

Die Testmethoden, die gegenwärtig in Kliniken routinemäßig zur Blutgruppenbestimmung und Kompatibilitätsuntersuchung von Blut-.zellen verwendet werden, der Agglutinationstest wie der Zellysistest, werden beide in der flüssigen Phase durchgeführt. Antikörperhalt iges Serum mit oder ohne Komplement wird mit einer Blutzellensuspension gemischt, wobei der Blutzell-Typ entsprechend der Fragestellung gewählt wird. Normalerweise werden konstante Volumina verwendet.

Die Bewertung der Resultate von Agglutinationstesten erfordert die Fähigkeit der technischen Assistentin, zwischen spezifischen Agglutinationen, die durch die molekulare Brückenbildung zwischen spezifischen Antigen und Antikörper entstehen, und unspezifischen Zellaggregaten, verursacht durch andersartige Kräfte, die einen gewissen Grad der Verklumpung bewirken, unterscheiden zu können. Die technische Assistentin muß außerdem in der Lage sein, freie, nicht agglutinierte Zellen, die neben verklumpten oder agglutinierten Zellen vorhanden sein können, zu erkennen. Dies erfordert entweder erfahrenes, gut geschultes Personal oder eine präzise Partikelmessung und -zählung durch teure Instrumente. Darüberhinaus ist der Grad einer spezifischen Agglutination entweder nur mäßig halb-quantitativ zu erfassen oder er erfordert kostspielige' und komplizierte Nachweismethoden.

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Obwohl verschiedene Geräte für die Typisierung von Erythrozyten mit Hilfe der Agglutination entwickelt wurden, ist eine derartige Ausstattung stets kostspielig und kompliziert im Gebrauch, So ist zum Beispiel ein Gerät, das für die Typisierung von Erythrozyten empfohlen wird, unter dem Namen "Auto-Analyzer" be-

Nr.6 kannt; vgl. Berkman et al., Transfusion, Bd. 11/(1971), S. 317.

In dem Auto-Analyzer werden die Blutproben und das antikörperhaltige Serum unter bestimmten Bedingungen in Röhrchenschlangen zur Agglutination gebracht. Die Röhrchenschlangen sind verbunden mit einem "T" Verbindungsstück, dessen Fuß nach unten gerichtet ist, wodurch die entstandenen Agglutinate entfernt werden. Die Agglutination kann nun entweder dadurch bestimmt werden, daß man die optische Dichte in dem "T" Stück, das die abfließende Flüssigkeit, die die nicht agglutinierte Fraktion enthält, mißt (Berkman et al., a.a.O.), oder durch das Auffangen der Agglutinate aus dem "T" Stück auf Filterpapier (vgl. Shield et al., Transfusion, Bd. 9 (1969), S. 348). Dieser Apparat ist kostspielig und kompliziert und eignet sich nicht für eine einfache Automatisierung zum routinemäßigen Gebrauch in Blutbanken.

Ein weiteres, sehr kostspieliges Gerät, ist unter der Bezeichnung "Groupamatic" bekannt; vgl.Garretta et al., Vox Sang., Bd. 27 (1974), S. l4l. In dem Groupamatic-Gerät werden Serum und Blutzellen zur Agglutination zusammengebracht. Das Vorhandensein einer Agglutination wird nachgewiesen, indem die Suspension durch zwei Lichtstrahlen geschickt wird. Ein Lichtstrahl geht durch das Zentrum" einer Reaktionskuvette, der andere durch die Peripherie, Die Differenz zwischen der Transmission der Licht-

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strahlen wird als Maß für die Stärke der Agglutination gewertet. Dieses Gerät rentiert sich nur für sehr große Blutbanken.

Die Teste, die auf der Immunolysis beruhen, sind unproblematisch solange die Zelloberflächenantigen-Antikörper-Reaktion ausreichend mit Komplement reagiert, wie bei der Typisierung von Geweben, z. B. HL-A. Leider ist das mit humanen Erythrozyten selten der Fall. Entweder ist die Reaktion zwischen den Zellmembranantigen-Antikörper-Komplexen und dem Komplement nicht ausreichend, oder man muß die. Antikörper-Konzentration begrenzen, um eine zu intensive Agglutination zu verhindern, da diese die Immunolysis mechanisch stört.

Diese Probleme belasten die serologischen Labors von Blutbanken schwer, da sogar die routinemäßige Typisierung von Erythrozyten hierdurch eine zeitaufwendige, manuelle Tätigkeit bleibt, die mehr geübtes und erfahrenes Personal erfordert als vorhanden ist. Darüberhinaus können es sich nur wenige Blutbanken erlauben, lymphocytotoxische Teste für die Typisierung von Geweben durchzuführen, Es gibt außerdem keinen direkten immunologischen Test für den Nachweis der Kompatibilität von Granulozyten vor einer Transfusion und nur einen indirekten Test für Thrombozyten durch

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die Freisetzung von C-Serotonin. Granulozyten und Thrombozyten können durch ausgewählte und geeignete Teste zwar als HL-A Typen bestimmt werden, ihre Kompatibilität kann dadurch aber nicht garantiert werden.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß sowohl der Agglutinations-

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als auch der Zellysis-Test mit humanen Blutzellen signifikant verbessert werden kann, wenn die reaktiven Zellen einen Monolayer bilden und dieser irreversibel an einen festen Träger gebunden wird. Danach wird diese Monolayer-Schicht mit einer Lösung (oder Serum), die potentiell reaktive Antikörper enthält, bedeckt. Das Ausmaß der Immunoadsorption, die an dem Monolayer entsteht, wird danach bestimmt. Unter Verwendung der Grundprinzipien wurde ferner eine Methode entwickelt, durch die das Vorhandensein von immunologischen Paktoren, z. B. Antikörper oder Antigene, an der Oberfläche von Zellen einer bestimmten Zellpopulation unter folgenden Bedingungen festgestellt werden kann:

a) Eine erste Zellsuspension der zu prüfenden Zellpopulation wird auf einen festen Träger unter Bedingungen verbracht, die eine irreversible Schichtbildung dieser Zellen auf dem Träger ermöglichen;

b) die entstandene Zellschicht wird mit einer Lösung (oder Serum) überschichtet, die Antikörper oder Antigen von bekannter Spezifität enthält;

c) anschließend wird die entstandene Immunoadsorption des Antigens oder der Antikörper an die Zellschicht gemessen.

Der Ausdruck "irreversible Bindung von Zellen an einen festen Träger" bezeichnet die Bindung von reaktiven Zellen durch Molekularkräfte, wie die Bildung von kovalenten chemischen Bindungen zwischen der Zelloberfläche und den reaktiven Gruppen von Substraten, oder die Bindung durch schwächere molekulare Kräfte, wie die van der Wäals Kräfte, elektrodische Kräfte oder durch Wasserstoffbrücken, die den Einwirkungen nachfolgender Prozeduren

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widerstehen. Es wird nicht nur die Empfindlichkeit des Testverfahrens erhöht, sondern es ist auch möglich, das Ergebnis der Immunreaktionen leicht durch einfache Geräte zu messen.

Der vorgenannte Test der Blutgruppenbestimmung kann in drei Schritten durchgeführt werden:

.1» Ein Monolayer von Erythrozyten (beispielsweise der Typ A) wird irreversibel an einen festen Träger gebunden;

2. auf die Zellschicht als Immunoadsorbens werden Antikörper, wie anti-A Antikörper, verbracht und spezifisch adsorbiert;

3. die antikörper-umhüllten Zellen können nun getestet werden, entweder auf ihre Empfänglichkeit für die Immunlysis durch Komplement (feste-Phase-Lysis) oder auf ihre Fähigkeit, einen zweiten Monolayer von Zellen, die ein entsprechendes Antigen tragen, zu binden (feste-Phase-Agglutination).

Die Testresultate können auf einfache Weise ausgewertet werden, z, B, durch die mikroskopische Untersuchung. Von besonderer Bedeutung ist aber, daß sich erfindungsgemäß die Testresultate speziell für die Auswertung mit Hilfe der Densitometrie unter Verwendung eines Standards und üblicher Geräte eignen, Für die feste-Phase-Hämagglutination werden die auf die vorstehend beschrie bene Art hergestellten Testplatten entweder nach der statischen . oder der Durchfluß-Dichtebestimmung untersucht. Man arbeitet bei Wellenlängen, bei denen das Hämoglobin der getesteten Erythrozyten das Licht absorbiert; z. B. eignet sich blaues Licht mit einer Wellenlänge'von 415 nm. Die Durchfluß-Dichtebestimmung erfordert lediglich den Gebrauch von bekannten Laborgeräten und

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gestattet quantitative Antworten auf folgende Fragen: 1« Ist ein zweiter Monolayer gebildet worden;

2. wieviel Zellen sind in dem zweiten Monolayer enthalten;

3. wie ist die Verteilung des zweiten Monolayers·

Als "Verteilung" wird hier die Uniformität der zweiten Schicht bezeichnett Ein gleichmäßiger zweiter Monolayer zeigt an, daß 100 % der Zellen in der überschichteten Zellsuspension das nötige Antigen tragen, um eine Bindung an die erste Zellschicht herzustellen· Eine ungleichmäßige zweite Monolayer-Bildung bedeutet dagegen, daß einige "negative" Zellen in der aufgetragenen Suspen sion enthalten waren.

Bei dem vorstehend beschriebenen Alternativ-Verfahren zum Nachweis von immunologischen Paktoren an Zelloberflächen kann das Vorhandensein von Antikörpern oder Antigenen, die durch Immunor adsorption aus einer Lösung gebunden wurden, bequem durch das Aufbringen einer zweiten Suspension von Testzellen geprüft werden, Hat der erste Monolayer mit dem Antigen (oder Antikörper) aus der Lösung reagiert, so kann eine zweite Schicht dadurch gebildet werden, daß das spezifische Antigen (oder Antikörper) von bekannter Spezifität als verbindendes Agens fungiert, die Zellen der zweiten Suspension bindet, und dadurch ein zweiter Monolayer entsteht.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch dazu benutzt werden, die kompetifive Reaktion zwischen Lösungen und Suspensionen von Materialien mit dem Verdacht auf gemeinsame antigene Eigen-

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schäften zu überprüfen. Hierfür wird ein erreversibel an die Matrize gebundener Zellmonolayer wie vorstehend beschrieben hergestellt, Diese Zellschicht wird überschichtet mit einer Mischung aus zwei Lösungen, wovon die erste Antigen oder Antikörper be-

enthSlt

kannter Spezifität/und fähig zur Immunadsorption an den gebundenen Zellmonolayer ist, und die zweite die Test-Lösung bzw. -Suspension ist. Die kompetitive Bindung der bekannten Antikörper oder Antigene durch Paktoren, die in der zweiten Suspension oder Lösung enthalten sind, spiegelt sich wider in einer Reduktion der Immunoadsorption an die irreversibel gebundene Zellschicht.

Entsprechend kann dieses Verfahren auch dazu verwendet werden, • den Grad der Bildung eines zweiten Zellmonolayers zu untersuchen. Hierbei wird eine Zellsuspension, die in der Lage ist, einen zweiten Monolayer zu bilden, mit einer zweiten Lösung oder Suspension, die untersucht werden soll, gemischt. Die kompetitive Bindung zwischen diesen beiden immunologischen Partnern zeigt sich in der Vermischung der zweiten Monolayerbxldung.

Innerhalb dieser Grundverfahren sind verschiedene spezielle Methoden möglich:

1· Der Nachweis von Antigen durch die kompetitive Immunoadsorption

Diese Testmethode beinhaltet als ersten Schritt 1. die Herstellung eines Zellmonolayers, der irreversibel an einem festen Träger gebunden wird.· Dieser Monolayer wird aus einer Zellsuspension gebildet, von der bekannt ist, daß sie ein Antigen trägt; 2. die

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Zellschicht wird mit einem Gemisch in Kontakt gebracht, das (a) aus einer Lösung reaktiver, zur Immunoadsorption mit dem vorgenannten Antigen befähigter Antikörper und (b) einer zweiten Lösung oder Suspension besteht, die ein unbekanntes Antigen enthält, wobei das unbekannte Antigen durch die kompetitive Bindung mit den in der Mischung enthaltenen Antikörpern nachgewiesen werden soll. Danach wird 3« der Grad der Immunoadsorption der Antikörper in der Lösung (a) an dem Zellmonolayer (a) gemessen.

2, Der Nachweis von Antigen durch die kompetitive Inhibierung Bei dieser Methode wird zunächst 1. ein Monolayer aus einer Zellsuspension mit bekanntem Antigen durch irreversible Bindung an einem festen Träger hergestellt. Auf diese Zellschicht wird 2, eine Lösung gegeben, die Antikörper enthält j die mit dem Antigen der Zellschicht reagieren und zur Immunoadsorption führen können. Danach xvird 3· eine Mischung zugegeben, die a) eine Suspension mit den Zellen und b) eine Lösung oder Suspension von Antigen enthält, das kompetitiv mit den immunoadsorbierten Antikörpern der Lösung 2) reagieren kann. Es wird nun der Grad der zweiten Monolayerbildung aus der zweiten Zellsuspension gemessen,

- 3· Nachweis von Antikörpern in einer Zellpopulatiqn In diesem Test wird 1, eine zu testende Zellpopulation an einen festen Träger derart gebunden, daß ein irreversibel gebundener erster Zellmonolayer auf dem Träger entsteht. Der Zellmonolayer wird 2. mit einer Lösung überschichtet, die ein Antigen mit einer bekannten spezifischen Fähigkeit zur Immuncadsorption mit Antikörpern enthält. Schließlich wird 3« der Grad der entstehenden

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Immunoadsorption gemessen.

**· Nachweis von Antigen in Anwesenheit von Antikörpern in einer

Zellpopulation

In diesem Test wird 1. auf einen festen Träger eine antikörperhaltige Zellsuspension gegeben, die auf diesem Träger einen irreversibel gebundenen Monolayer bildet. Die entstandene Zellschicht wird 2, mit einer Mischung überschichtet, Diese Mischung enthält a) eine Lösung mit dem zu testenden Antigen und b) eine zweite, antikörperhaltige Zellsuspension oder -lösung, wobei diese Antikörper in der Lage sind, kompetitiv die Immunoadsorption des Antigens zu inhibieren. Anschließend wird 3. das Maß der Immunoadsorption des fraglichen Antigens in der Lösung (a) an den Monolayer gemessen.

Bei jeder dieser Methoden kann der Grad der Immunoadsorption durch eine oder mehrere der vorstehend allgemein beschriebenen Methoden bestimmt werden.

Trotz der schon lange bestehenden Schwierigkeiten der Kliniken, die eine Blutbank-Serologie betreiben, und trotz der Notwendigkeit, die Methoden zu verbessern und durch geeignete Geräte und Automatisierung zu vereinfachen, gibt es nur wenige bekannte Arbeiten auf diesem Gebiet. Viele Jahre hindurch waren die sogenannten "Eldon"-Karten für die Blutgruppenbestimmung bekannt. Diese sind beschrieben worden z. B. in der US-PS 2 770 572. In dieser Patentschrift ist eine Testkarte für die Typisierung von humanem Blut beschrieben. Die Testkarte enthält auf ihrer Ober-

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fläche in verschiedenen Bereichen getrocknetes Serum mit Antikörper-Faktoren gemischt mit Konglutinin oder Konglutinin-Ersatz für die Typisierung von humanem Blut. In den betreffenden Bluttypisierungstesten mit der Eldon-Karte wird die zu typisierende Blutprobe in Tropfen auf die auf der Karte befindlichen verschiedenen Serumfelder gegeben. Nach einer ausreichenden Reaktionszeit wird das Ergebnis anhand der entstandenen Agglutinationen abgelesen. Diese Teste sind allerdings auf den Nachweis von anti-A, anti-B und anti-Rh (Rh_Q oder D) beschränkt und selbst diese besitzen bei ihrer Interpretation signifikante Fehlerquellen.

In der US-PS 3 666 421 ist ein anderer diagnostischer Test beschrieben, bei dem die serologischen Reagentien als Tropfen auf einen Test-Objektträger gebracht und als Fleck angetrocknet werden. Dieses getrocknete Material kann nachfolgend wieder gelöst und für die Reaktion zur Identifizierung von Blutgruppen mit Hilfe der Agglutination oder von anderen durch die Agglutination nachweisbaren Antikörper-Reaktionssystemen verwendet werden. Die Test-Objektträger haben jedoch die Nachteile, die auch bei der gewöhnlichen Agglutination in flüssiger Phase auftreten. Der Test zeigt nämlich lediglich das Vorhandensein oder NichtVorhandensein einer Agglutination an, und es bedarf der geübten Bewertung durch die technische Assistentin, um festzustellen, ob die Agglutination durch eine spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion oder durch unspezifische Zellaggregate entstanden ist. Es ist außerdem schwierig oder sogar unmöglich, festzustellen, ob freie, nicht agglutinier.te Zellen neben den verklumpten Zellen des spezifischen Agglutinats vorhanden sind.

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In der US-PS 3 770 38Ο ist eine Vorrichtung für die Bewertung der Immunadhärenz-Reaktion beschrieben. Es muß an dieser Stelle betont werden, daß die Immunadhärenz-Reaktion, die in dieser Patentschrift beschrieben ist, sich von dem Immunoadsorption-Phänomen unterscheidet, das im erfindungsgemäßen Verfahren benutzt wird. Die Immuna3bärenz beruht auf einer unspezifischen Verklumpung von Partikeln oder Zellen durch die Anwesenheit von Komplement. Bei der Immunadhärenz bewirkt das Komplement die Bindung, Die Immunadhärenz ist charakterisiert durch nicht-spezifische Reaktionen zwischen dem Komplement und den Partikeln oder Zellen, an die es sich bindet. Im Gegensatz dazu wird die Immunoadsorption durch eine spezifische Bindung zwischen den antigenen Determinanten einer Zellmembran und den im Serum enthaltenen Antikörpern verursacht. Aus diesem Grund bezieht sich die Ummunoadsorption, im Gegensatz zu der Immunadhärenz, auf eine spezifische Bindung zwischen Antigenen und Antikörpern.

Bei der in der US-PS 3 770 38Ο beschriebenen Vorrichtung handelt es sich um eine flache, zellähnliche Struktur, die an ihrem Boden mit bakteriellem oder viralem Material beschichtet wird. Die Beschichtung wird mittels einer transparenten getrockneten Proteinzwischenschicht an die Basis der zellähnlichen Struktur gebunden. Die Immunadhärenz-Reaktionen zwischen den derartig mit Bakterien oder Viren präparierten Zellen und den antikörper-tra— genden Erythrozyten sowie dem Komplement in der Testflüssigkeit wird durch den Grad der Adhärenz der spezifisch präparierten Erythrozyten an die Bakterien- oder Virusmaterial enthaltende Beschichtung bewertet. Die in der US-PS 3 770 38Ο beschriebene

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Methode hat keinen praktischen klinischen Wert gefunden, da die Immunadhärenz selbst kaum verwendet wird, und weil die Immunadhärenz unspezifisch und deshalb nicht günstig für den Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen ist.

Eine Schicht von Blutzellen, die in eine feste Unterlage eingebettet ist, ist für wissenschaftliche Zwecke verwendet worden, die nichts mit Blutgruppenbestimmungen und Kompatibilitätstesten zu tun haben. Diese Schichten werden nicht durch kovalente oder andere molekulare Kräfte gebunden, Goodman (Nature, Bd, 193 (1962), S, 350) präparierte Säulen von mit Formaldehyd behandelten Erythrozyten, die in ein Polyurethanharz eingebetten wurden, zur Fraktionierung von humanen anti-Erythrozyten Antikörpern auf der Basis ihrer Bindungsintensität an die Erythrozyten. Edelman et al., Proc. Nat. Acad. Sei,, Bd. 68 (1971), S. 2153, fraktionierte Blutzellen dadurch, daß er ihre Fähigkeit zur spezifischen Bindung von Lectinen, Antikörpern oder Antigegen, die zuvor an partiell hydrolysierte Nylonfasern gebunden wurden, ausnutzte.

Das Prinzip der Bindung von prosthetischen Gruppe^ beispielsweise von Antigenen, Antikörpern oder Enzymen an eine feste Matrix^ ist ein bekanntes Verfahren; vgl. Cuatrecases und Anfinsen, Ann. Rev. Biochem., Bd. 40 (1971), S. 259. Es wird beim Radioimmuntest in der festen Phase verwendet; vgl. Brit. Med. Bull., Bd. 30 (197¹I), S. 1 - 103. Die irreversible Bindung von Blut- oder anderen Zellen an· eine feste Unterlage zum Zwecke der Typisierung von Blut oder Geweben sowie für Kompatibilitätsteste ist L J

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- 15 dagegen noch nicht verwendet worden.

Nachstehend wird die Erfindung im Hinblick auf die gegenwärtig verwendeten Teste zur Bestimmung von Erythrozyten erläutert.

Polystyrol-Teströhrchen werden auf ihrer inneren Oberfläche mit Fibrinogen beschichtet (Konzentration der Pibrinogenlösung 0,5 mg/ml), welches sich irreversibel an das Polystyrol bindet. Nach einem Waschgang wird die Pibrinogenschicht mit einer PoIylysinlösung (Konzentration 0,1 mg/ml) behandelt. Nach einem nochmaligen Waschgang wird eine Suspension von entweder normalen oder mit Protease vorbehandelten Erythrozyten (RBC) zugegeben. Diese RBC werden irreversibel (für Testzwecke) als ein Monolayer an die mit Polylysin und Fibrinogen beschichtete Polystyrol-Oberfläche gebunden. Die Bindungsdichte von 2 χ 10 RBC pro Quadratzentimeter entspricht dem Durchmesser der RBC von 7 Micrometer.

Der Monolayer der gebundenen RBC ist stabil und dient seinerseits als Immunoadsorbens zur Bindung von Antikörpern aus beliebigen Lösungen (oder Serum), wenn die enthaltenen Antikörper spezifisch für die antigenen Determinanten der Zellmembranen der gebundenen RBC sind.

Die Methode der Bindung von Blutzellen als ein Monolayer an einen festen Träger ist nicht auf das vorstehend beschriebene Verfahren beschränkt, Die Literatur über die Koppelung von Proteinen an Polymere (vgl, Cuatrecases und Anfinsen, a.a.O.) zeigt, daß als Alternative auch Präparationen von Polymeren (Folien oder Platten

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von beispielsweise. Polyurethan oder Polystyrol) verwendet werden können, die an ihrer Oberfläche reaktive Verbindungen oder Gruppen, wie Glutardialdehyd, Bromcyan, Amino- oder Carboxylgruppen, tragen, die eine kovalente Bindung der Blutzellen an die Unterlage erlauben. Es ist selbstverständlich, daß die Bindungssubstanzen immunologisch aktiv sein müssen gegenüber allen Antigegen oder Antikörpern, die in den vorgesehenen Testlösungen enthalten sein können.

Andere Substrate oder Träger für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren können alle Stoffe sein, wenn (i) sie so beschaffen sind, daß sich ein Zellmonolayer in der vorstehend be-• schriebenen Weise irreversibel daran binden kann, und (ii) wenn sie im Hinblick auf die verwendete Nachweismethode geeignet sind. Nachdem die bequemste Nachweismethode auf der Durchlässigkeit von Licht basiert - wie das mikroskopische Auszählen und die Durchfluß-Dichtebestimmung - werden Träger bevorzugt, die lichtdurchlässig sind. Wenn die Messung der Radioaktivität benutzt wird, ist der Gebrauch von lichtdurchlässigem Material natürlich nicht nötig.

Für die Zwecke der Erfindung kann das Substrat oder der Träger einfach die innere Oberfläche eines Teströhrchens sein. Wenn die Durchfluß-Dichtemessung zur Bewertung der Testergebnisse herangezogen werden soll, sind plane Oberflächen am besten geeignet'. Für größere üntersuchungsansätze können auch Streifen des zellbindenden·Materials verwendet werden, um die erste Zellschicht herzustellen. Dadurch können die Antikörper erkannt und

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auf ihre Fähigkeit untersucht werden, entweder die Immunolysis in Anwesenheit von Komplement zu unterstützen oder einen zweiten Monolayer von Zellen eines unbekannten Typs zu bilden. Quantitative Resultate gewinnt man einmal mit Hilfe der Durchfluß-Dichtebestimmung, wobei ein Verlust an Farbe Lysis, die Zunahme von Farbe die Bildung eines zweiten Monolayers aus Erythrozyten anzeigt. Für diesen letzteren Zweck ist es günstig, wenn als Teil der punktförmigen Präparation durch hypotonische Lysis der erste Monolayer entfernt wird, so daß dieser als Hintergrund nicht mehr subtrahiert werden muß. Eine hypotonische Lysis entfernt nur eine nicht signifikante Menge der an die Membran gebundenen Antikörper. Die Bildung des zweiten Monolayers kann mit bloßem Auge oder durch die optische Dichtebestimmung mittels des Hämoglobingehalts erkannt werden. Bei Verwendung der Durchfluß-Dichtebestimmung kön nen z. B. bei 415 nm quantitative Antworten auf Fragen wie "wurde ein zweiter Layer gebildet", "wieviel Zellen (im Verhältnis zu einem eindeutigen Maximum) enthält der zweite Monolayer", "wie ist die Verteilung des zweiten Monolayers" gefunden worden.

Für die Beantwortung der letzten Frage soll die Zellsuspension, die auf den Antikörper-beladenen Monolayer gegeben wird, eine Konzentration haben, die ausreicht, einen zweiten Monolayer zu bilden. Der zweite Monolayer wird danach gewaschen, um nicht gebundene Zellen zu entfernen. Nach dieser Waschung ist die Verteilung der gebundenen Anteile des zweiten Monolayers eine Funktion des Prozentsatzes der "positiven" Zellen, die gebunden werden, und der "negativen" Zellen, welche nicht adsorbiert wurden. Die entstandenen Löcher oder Inseln können durch die mikroskopische

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Durchfluß-Dichtebestimmung erfaßt werden. Ihre Häufigkeit und Intensität wird als Rate der durchmusterten Oberfläche ausgedrückt.

Das erfindungsgemäße Verfahren der Bindung der Antikörper an einen Monolayer von Erythrozyten durch Immunoadsorption hat verschiedene wichtige Vorteile. Seren mit einer Antikörperkonzentration, die zu niedrig für die konventionellen Teste in der flüssigen Phase sind, können durch die Bindung an einen Zellmonolayer konzentriert werden. Für Teste in der flüssigen Phase können meist keine.unverdünnten Seren verwendet werden, da verschiedene Serumproteine stören können. Diese Störung spielt bei Testen in der festen Phase keine Rolle, da die Antikörper selektiv adsorbiert werden und störende Proteine durch das Waschen entfernt werden. Viele Seren sind ungeeignet für Teste in der flüssigen Phase, da sie Antikörper mit einer unerwünschten Spezifität enthalten, die nicht entfernt werden können. Erfindungsgemäß ist es durch entsprechende Auswahl von Zellen für die Bildung des ersten Monolayers möglich, nur die Antikörper zu adsorbieren, die getestet werden sollen.

Die vorliegende Erfindung eignet sich sowohl zur Bestimmung von Zelltypen als auch der Zellkompatibilität. Für die Zelltypisierung wird z. B. der erste Monolayer mit den gebundenen Antikörpern aus Zellen und Antikörper eines bekannten Typs hergestellt. Die Bestimmung des Zelltyps eines Patienten oder Spenders erfolgt dann durch die Beurteilung, ob diese Zellen einen zweiten Monolayer gebildet haben. Für Kompatibilitätsteste werden die Spenderzellen dazu verwendet, den ersten Monolayer zu bilden.

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Diese können dann mit den möglichen Antikörpern des Patientenserums, die durch Immunoadsorption gebunden werden, reagieren. Nachgewiesen wird dies entweder durch die Zugabe von Komplement, wodurch Lysis entsteht, oder durch eine weitere Zugabe derselben Spenderzelle und der Bestimmung der Antikörperkapazität, einen zweiten Monolayer zu bilden (unter der Voraussetzung, daß eine erste Bindung erfolgte).

Die Wahl der erfindungsgemäß geeigneten Bestimmungsmethoden macht keine Schwierigkeiten. Erythrozyten besitzen ihre eigene Markierung durch das pigmentierte Protein Hämoglobin, das bei einer Wellenlänge von 415 nm seine maximale Absorption hat. Das Vorhandensein oder NichtVorhandensein von Erythrozyten kann dadurch einfach und spezifisch in der vorstehend beschriebenen Weise nachgewiesen werden. Andere Methoden der Kennzeichnung können aber ebenso verwendet werden. Solche Methoden sind die radioaktive Markierung, z. B. mit Cr oder ⁵J, biochemische Verfahren, z. B. ein ausgewähltes intrazelluläres Enzym, die Fluoreszenztechnik, z. B, Verwendung einer molekularen Sonde zur Identifizierung von toten oder lebenden Zellen. Für alle diese Verfahren gibt es die entsprechenden Geräte, und sie lassen sich automatisieren. Sie sind in gleicher Weise verwendbar für die Serologie von Blutbanken, für medizinische Blutteste, die Typisierung von Geweben und die Untersuchung der Kompatibilität vor Bluttransfusionen und Transplantationen.

Es 1st bekannt, daß eine ganze Reihe von Methoden, die gegenwärtig in der flüssigen Phase durchgeführt werden, mit gleichem Er-L

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folg auch in der festen Phase angesetzt werden können. Das schließt auch die Verwendung von Zusätzen ein, die bekannt dafür sind, daß sie die Agglutination verbessern, z. B, symmetrische und asymmetrische hydrophile Kolloide, Proteasen, die Ionenkonzentration, Polyelektrolyte, die Tonizität und Puffersysteme zur Kontrolle des pH-Werts. Diese Paktoren sind z. B. von Berkman et al., Transfusion, Bd, 11 (1971), S. 317, beschrieben.

Die Erfindung kann auch bei anderen Problemen angewendet v?erden, bei denen immuno-spezifische zelluläre Reaktionen auftreten. Ein solches Problem ist der Antiglobulin-Test für die Bestimmung von Zellen und ihre Beladung mit IgG, IgM, IgA, IgD und IgE-Immunglobulinen und mit C3, Ck und anderen Komplementkomponenten oder gebundenen Aktivierungsprodukten; vgl. Rosenfield et al., Vox-Sang., Bd. 26 (197²O, S. 289 - 333.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit sind Teste der festen Phase mit der quantitativen Bewertung einer passiven oder einer reversen passiven Hämagglutination. Passive Hämagglutinationsteste können für eine direkte Analyse der Antikörperkonzentration, aber auch für die indirekte Analyse von löslichen Antigenkonzentrationen durch die kompetitive Bindung auf der Basis von gemeinsamen Antigenen herangezogen werden; vgl. Nusbacher et al., J« Immunol., Bd. 108 (1972), S. 893. Reverse passive Teste messen das lösliehe Antigen direkt; vgl. Cook, Immunol., Bd, 8 (1965)» S. 74 und Juji und Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., Bd. 39 (1969), S. 6l5'. Darüberhinaus können aber auch Bakterien, Protozoen, Pilze und Kulturzellen von Zellinien aus Geweben

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oder aus Tumoren auf ihre antigene Determinanten an ihren Oberflächen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in der festen Phase wie die Blutzellen auf ihre Empfindlichkeit für eine antikörpervermittelte Agglutination oder Lysis analysiert werden. Die erfindungsgemäßen Teste in fester Phase können auch zur Lösung von Problemen mit molekularen Antikörper-Konzentrationen, dem K-Wert der Antikörperbindung und dem.Grad der K-Wert-Heterogenität dienen.

Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines Zellmonolayers in der festen Phase eignet sich besonders für die Blutgruppenbestimmung und für Kompatibilitätsteste mit Blut- und an-• deren Zellen,

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Ummunolysis durch human anti-A

Polystyrol-Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Höhe von 75 mm werden auf der inneren Oberfläche 2 Minuten mit 0,2 ml einer Fibrinogenlösung einer Konzentration von 0,5 mg/ml beschichtet, gewaschen und nachfolgend 2 Minuten mit 0,2 ml einer Lösung von Poly-D-lysin-hydrobromid vom Molekulargewicht I¹IO 000 einer Konzentration von 0,1 mg/ml behandelt. Nach einer weiteren Waschung werden 0,2 ml einer 2- bis 5prozentigen (v/v) Suspension von Typ A₁ZeIIeIi in 0,9prozentiger Kochsalzlösung für 2 Minuten .zugegeben. Dadurch entsteht durch Ad-

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härenz ein Monolayer von Erythrozyten mit einer flachen Oberfläche

C ρ

und einer Dichte von 2 χ 10 /cm . Diese Erythrozyten lösen sich auch nach mehrmaligem Waschen nicht mehr von ihrer Unterlage. Auch die Zugabe von starkem humanem anti-A vermag sie nicht mehr zu lösen« Wenn nach der Zugabe von anti-A 0,2 ml Komplement zugefügt werden, wird das Hämoglobin der adhärierten Erythrozyten freigesetzt. Der Grad der Immunlysis wird nun entweder mit Hilfe des verbliebenen Hämoglobins gemessen, oder er wird durch

51 die Freisetzung von Radioaktivität in Form von Cr, das benützt wurde, um die den Monolayer bildenden Zellen zu markieren, bestimmt. Mit einer standardisierten Dosis von Komplement kann das lytische Potential von anti-A quantitativ erfaßt werden. Umgekehrt kann durch eine Standarddosis von anti-A das lysierende Komplement definiert und als Ganzes durch Titration gemessen werden. Dabei kann einmal der klassische Weg der Komplementaktion

unter Verwendung von Meerschweinchen-Erythrozyten (vgl. L. Pillemer et al., Science, Bd. 120 (195²O, S. 279) oder der andere Weg der Properdin-Aktion unter Verwendung von EDTA zur Komplexierung von Calciumionen,aber nicht von Magnesiumionen im humanen Serum beschritten werden.

•Keiner dieser Versuche zum Studium der Immun A-anti-A-Lysis kann so empfindlich und reproduzierbar in einem Test in der flüssigen Phase durchgeführt werden. IgM-, IgG- und IgA-anti-A sind alle sehr wirksame Agglutinine für Typ A^ Zellen und die Agglutination interferiert mit der Immunlysis. In feste-Phase-Versuchen gemäß der Erfindung war das lytische Potential von anti-A nicht nur meßbar, sondern 50mal besser wahrnehmbar als

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in Testen in der flüssigen Phase, Die diagnostischen Möglichkeiten sind deshalb mit dem Verfahren der Erfindung erheblich verbessert.

Beispiel 2 Bestimmung von Blutgruppen

Das Problem der Typisierung von humanen Erythrozyten und der Nachweis von humanen anti-Erythrozyfcen Antikörpern vor einer Transfusion zur Bestimmung der Kompatibilität ist beträchtlich,' In der Tat sind die einzigen Mittel zum Nachweis einiger humaner Blutgruppen durch die direkte Agglutination sehr teuer und erfordern komplizierte Geräte; vgl. Berkman et al., Transfusion, Bd. 11 (1971), S. 317. Erfindungsgemäß ist es gelungen, die komplizierten Methoden in der flüssigen Phase auf ein Testsystem in der festen Phase zu adaptieren und mit dieser Technik eine spezifische Typisierung für Rh, Kell, Kidd, Duffy, Xg^a, Lewis, Lutheran und MNSs mit einer Empfindlichkeit zu entwickeln, die die in der flüssigen Phase weit übertrifft.

Für die Blutgruppenbestimmung wird ein Monolayer aus Erythrozyten nach der gleichen Methode hergestellt, wie für die Immunolysis in Beispiel 1 beschrieben wurde. Nur wurde zunächst dieser Monolayer einem bekannten spezifischen Antikörper (0,2 ml) ausgesetzt und danach hypotonisch mit Aqua dest. lysiert. An diesem Punkt wurde eine zweite Gabe von Erythrozyten (0,1 ml) in 0,2prozentiger Suspension (v/v) in das Teströhrchen gebracht. Man läßt die Suspension absetzen, so daß ein leichter zweiter L

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Monolayer entsteht» Es ist nun möglich, die spezifische Bindung der Antikörper an diesen zweiten Monolayer auf verschiedene Arten zu verstärken. Z. B. wurde die Methode der niedrigen Ionen nach Berkman et al., a.a.O., erfolgreich verwendet. Dabei wird als erstes die überstehende Flüssigkeit durch eine Lösung (pH-Wert 6,0) ersetzt, die 5 % Mannit und 0,0025 % Protaminsulfat enthält. Als zweites wird der Monolayer nach 5 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 0,001*} M phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (O,85prozentig) (pH-Wert 7>3) gewaschen, Hierdurch werden nicht-antikö.rper-gebundene, bekannt negative Zellen entfernt. Andere Methoden zur Verstärkung der Antikörper-Bindung der Zellen waren noch vorteilhafter. Manche von diesen konnten nicht erfolgreich für die instrumenteile Methode von Berkman in der flüssigen Phase verwendet werden.

So konnte die spezifische Antikörper-Bindung an den zxveiten Zellmonolayer dadurch verbessert werden, daß man nacheinander die überstehende Flüssigkeit zuerst durch einen Puffer (pH-Wert 7,0) ersetzt, der 2,5 % PVP enthält. Danach wird dieser durch den gleichen Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 und einem Gehalt von 0,01 % Protaminsulfat ersetzt. Die Teste werden zum Schluß mit einem 0,2 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,3) gewaschen. Es ist klar, daß die Möglichkeiten für den Nachweis einer Agglutination in der festen Phase sehr zahlreich sind', weil diese Methode viele Probleme vermeidet, die mit den Testen in der flüssigen Phase verbunden sind.

Die Teste in der festen Phase sind nachgewiesenermaßen außer-

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ordentlich empfindlich für den Nachweis von Rh-Antikörpern vom IgG-Typ. Es wurde ungefähr die gleiche Empfindlichkeit für ein Antikörpermolekül pro rote Blutzelle erreicht, wie sie kürzlich für den Nachweis im Auto-Analyzer beschrieben wurde (vgl, Rosenfield et al», a.a.O.), nämlich 10 Antikörpermoleküle pro Zelle bei einer 50prozentigen Hämagglutination. Mit der Methode in der festen Phase benötigt man aber nur 1/1000 Erythrozyten wie sie im Auto-Analyzer verwendet werden und hat eine lOOOmal stärkere Empfindlichkeit, die ungefähr 1 pg Antikörper-Protein/ml erfaßt. Dadurch wird.die'Empfindlichkeit aller bisher beschriebenen Teste, einschließlich der, die die Überlebensrate der Zellen "in vivo" benützen, übertroffen.

Erfolgreich durchgeführt wurden auch Teste mit anti-Rh und Protease-vorbehandelten Erythrozyten. Diese Teste sind in Mikrotiter-Polystyrol-Platten mit flachen Böden angesetzt worden. Durch die flachen Böden war es möglich, die spezifische Adhärenz der Erythrozyten mikroskopisch zu untersuchen. Gebundene Zellen waren nur dann vorhanden, wenn sie Rh-positiv waren. In künstlichen Mischungen von Rh-positiven und Rh-negativen Zellen konnten "Löcher" beobachtet werden, die dadurch zustande kamen, daß in diesen Bezirken nicht-adhärierende Zellen vorlagen. Sie entsprachen dem Prozentsatz der enthaltenen Rh-negativen Zellen in der künstlichen Mischung. Dieses Ergebnis zeigt, daß erfindungsge- . maß quantitativ der Anteil an ungebundenen Zellen in einer Blutprobe bestimmt werden kann. Das ist das entscheidend wichtige Problem beim Nachweis der Überlebensrate transfundierter Zellen nach der Ashby Methode (Arch. Int. Med., Bd. 35 (1925), S. 516)

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und bei der Charakterisierung von menschlichen Chimären; vgl.

Race und Sanger, "Blood Groups in Man", Öavis, 1968, S. 475 -

Beispiel 3 Direkte Antiglobulinteste

Diese Teste wurden wie die Teste bei der Blutgruppenbestimmung durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die gewaschenen Erythrozyten von einem Patienten mit Verdacht auf eine erworbene hämolytische Anämie stammten. Diese wurden für die Herstellung des ersten und zweiten Zellmonolayers verwendete Der erste Monolayer (gebunden durch Polylysin-Fibrinogen) wurde mit einem einzelnen xenogenen anti-human Globulin-Serum und sieben (Serum-) Spezifitäten ausgewertet. Diese Seren waren individuell spezifisch für IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, C3 und Ch, Der antikörperbeschichtete Zellmonolayer wurde dann hypotonisch lysiert, gewaschen und ein zweites Mal mit einer Zellsuspension für die Bildung des zweiten Monolayers beschickt. Die Bindung dieses zweiten Monolayers wurde dadurch verstärkt, daß eine Iprozentige Polyvinylpyrrolidon (PVP, durchschnittliches Molekulargewicht 300 000 IK-Wert 90) enthaltende 0,9prozentige Kochsalzlösung zugefügt wurde. Der zweite Monolayer wurde zum Schluß mit reiner, 0,9prozentiger Kochsalzlösung gewaschen. Diese Prozedur ähnelt der von Hsu et al., Vox-Sang., Bd. 26 (197¹O, S. 305, beschriebenen Methode. Die in der festen Phase gewonnenen Ergebnisse waren aber denen von Hsu, die aus Testen in der flüssigen Phase stammten, deutlich überlegen. Ein Patient mit einer aktiven erworbenen, hämolytischen Anämie, dessen adhäsierende Proteine

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wegen einer ausgeprägten spontanen Agglutination in der flüssigen Phase in PVP nicht typisiert werden konnten, war mit der Methode der Erfindung eindeutig positiv für IgG, IgM, IgA, IgE, C3 und

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Claims

e η t a η s ρ r 1U c h e

1. Monolayer von irreversibel auf einem festen Träger gebundenen Zellen,

2. Verfahren zur Herstellung des Monolayer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen festen Träger zunächst mit einer Fibrinogenlösung behandelt, dann wäscht, hierauf mit einer Poly-D-lysin-hydrobromid-Lösung behandelt, nochmals wäscht und hierauf mit Zellen beschichtet.

3. Verwendung des I4onolayersnach Anspruch 1 zur Durchführung immunologischer Reaktionen auf der Basis von Immunagglutination oder Immunolysis, insbesondere Blutgruppenbestimmung, Kompatibilitätsteste mit Zellen verschiedener Herkunft und quantitativem Antigen- und Antikörpernachweis.

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