DE3689557T2

DE3689557T2 - Verfahren zur immunologischen bestimmung einer biologischen substanz in einer probe.

Info

Publication number: DE3689557T2
Application number: DE3689557T
Authority: DE
Inventors: Michel Etienne Canavaggio; Helen Hwai-An Lee
Original assignee: LEE HELEN HWAI AN
Current assignee: Lee Helen Hwai-An Cambridge Gb
Priority date: 1985-03-19
Filing date: 1986-03-19
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2006-03-20
Also published as: WO1986005591A1; JPS62502285A; EP0386854A1; FR2582103A1; DE3650238D1; EP0217845A1; JP2553852B2; FR2582103B1; DE3650238T2; EP0217845B1; DE3689557D1; ATE118618T1; EP0386854B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und unten Umständen der Bestimmung biologischer Substanzen.
Es gibt zahlreiche Verfahren zum Nachweis biologischer Substanzen. Die gebräuchlichsten dieser Verfahren sind die Hämagglutination sowie die Fluoreszenz-, enzymatischen und Radio- Immunoassays.
Die genannten Immunoassays erfordern den Einsatz künstlicher Kopplungsprodukte wie Antikörper-Enzym-Komplexe oder eine radioaktive Markierung.
Zwei europäische Anmeldungen, EP-A-032 204 und EP-A-032 782, betreffen Methoden zum Nachweis von Enzymen mit Hilfe auf einer festen Phase fixierter Antikörper. Im Falle der Anmeldung EP-A-032 204 ist das nachgewiesene Enzym die Alkalische Phosphatase, während das nachgewiesene Enzym im Falle der Anmeldung EP-A-032 782 Hämoglobin ist. In beiden Fällen bestimmt man mit Hilfe eines auf einer festen Phase fixierten Antikörpers ein aktives Enzym und kein Proenzym, das jeder enzymatischen Aktivität entbehrt.
Die Anmeldung WO-A-8403151 betrifft ein Verfahren zum Nachweis in flüssiger, d. h. homogener Phase und umfaßt die Reaktion von Zellen mit spezifischen Antikörpern gegen Oberflächen-Antigene dieser Zellen sowie ihre anschließende Lyse durch einen Zusatz.
Der Nachweis der Reaktion erfolgt mit bloßem Auge und ohne Verstärkung und beruht allein auf der natürlichen Färbung der Zellen. Diese Methode ist daher wenig empfindlich.
Die europäische Anmeldung EP-041426 betrifft ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung des Sandwich-Typs, wobei als Entwickler ein Komplex verwendet wird. Die Anmeldung EP-A-106185 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Blutgruppen, wobei fluoreszierende Komplexe und nicht die Eigenschaften der Zellen selbst verwendet werden.
Diese Verfahren verwenden also keine der Struktur der Zellen innewohnenden Merkmale.
Das Patent US-A-3 990650 bezieht sich auf eine neue Ausführung eines diagnostischen Tests, bei der die Reagenzien einfach auf Reaktionsvorrichtungen aufgetrocknet und nicht fixiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem keine künstlichen Kopplungsprodukte oder radioaktiven Produkte benötigt werden, und das im Gegensatz zur Hämagglutination in fester Phase eingesetzt werden kann. Dieses Verfahren besitzt insbesondere den Vorteil, daß es einfach und schnell ist sowie daß es automatisiert werden kann und gleichzeitig sehr empfindlich ist.
Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Zelle oder eines Mikroorganismus in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß:
a) man auf einer festen Phase einen Liganden immobilisiert, der eine Fixierungsaffinität für die Zelle oder den Mikroorganismus besitzt,
b) man die Probe in Gegenwart der festen Phase, auf der der Ligand immobilisiert ist, bebrütet,
c) man die feste Phase nach dem Bebrüten wäscht und d) man die Gegenwart der Zelle oder des Mikroorganismus, der auf die feste Phase durch die Vermittlung des Liganden fixiert ist, durch das Vorhandensein einer enzymatisch- oder chemisch-endogenen Aktivität der Zelle oder des Mikroorganismus nach der Lyse aufzeigt.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung erlaubt den Nachweis aller Zellen oder Mikroorganismen, die im folgenden als "selbstauffindbar" bezeichnet werden, das heißt alle Zellen oder Mikroorganismen mit einer ihnen innewohnenden Eigenschaft, die direkt oder indirekt durch den Menschen oder eine Maschine nachgewiesen werden kann.
Zu den selbstauffindbaren Substanzen gehören insbesondere Substanzen mit einer natürlichen Färbung, zum Beispiel die roten Blutkörperchen, oder auch solche, die unter einer künstlichen Bestrahlung besonders in Erscheinung treten, oder aber Substanzen, die in der Lage sind, entweder direkt, wenn es sich um ein Makromolekül handelt, oder aufgrund bestimmter darin enthaltener Elemente, zum Beispiel ein endogenes Enzym oder ein chemischer Bestandteil, ein Substrat zu färben oder eine Fluoreszenz oder Lumineszenz hervorzubringen, wie zum Beispiel Protein C.
Selbstverständlich können die "selbstauffindbaren Substanzen" auch anhand zahlreicher anderer chemischer oder physikalischer Eigenschaften aufgefunden werden.
Im allgemeinen ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vor allem zum Nachweis biologischer Substanzen bestimmt, die sich im natürlichen oder künstlichen Licht direkt sichtbar machen lassen. In diesem Fall handelt es sich im allgemeinen um gefärbte oder pigmentierte Verbindungen, die in hoher Konzentration vorliegen.
Das Verfahren ist im übrigen besonders interessant für die Bestimmung biologischer Substanzen, die sich indirekt durch eine Färbung oder eine endogene enzymatische Reaktion sichtbar machen lassen, in Gegenwart eines Substrats und unter Umständen nach enzymatischer Aktivierung oder nach einer Zell-Lyse, wenn es sich um Zellen handelt, wobei endogene Enzyme freigesetzt werden, in erster Linie zum Beispiel Peroxidase, Phosphatase, Galactosidase, Glucose-Oxidase oder Transaminase.
Die selbstauffindbaren biologischen Substanzen können sein:
1.) Zellen, insbesondere:
- rote Blutkörperchen für die Bestimmung der Blutgruppen, des ABH-, Lewis-, P-, Lutheran-, Rhesus-(D, C, c, E, e), Kell-, Duffy-, Kidd- und MNSs-Systems oder anderer, die durch ihre Färbung oder nach Lyse über die Wirkung der Peroxidase auf ein Substrat entdeckt werden können;
- Leukocyten: polynucleare Leukocyten, Lymphocyten, Monocyten;
- Blutplättchen;
- normale oder pathologische Zellen epithelialen oder endothelialen Ursprungs oder aus dem Bindegewebe, die in der Probeflüssigkeit enthalten sind oder die durch Cytopunktion oder Biopsie entnommen und in einem künstlichen Puffer suspendiert worden sind.
2.) Mikroorganismen: Bakterien, Parasiten, Viren, wobei sich Bakterien zum Beispiel nach der Lyse durch die Aktivität endogener Enzyme wie der Galactosidase nachweisen lassen.
Das selbstauffindbare Produkt kann sich direkt in einer aktiven Form befinden oder sekundär durch Zell-Lyse und Freisetzung in das Reaktionsmedium oder in einer Enzymkaskade aktiviert werden.
Die feste Phase kann irgendein Träger sein, der normalerweise für Immunoassays verwendet wird, sei es ein Träger in Form von Kügelchen, Vertiefungen auf Mikrotiterplättchen, Reaktionsstreifen oder andere. Dieser Träger kann aus irgendeinem Polymer natürlichen oder synthetischen Ursprungs oder aus einer amorphen Substanz wie Glas bestehen. Für die Reaktionsstreifen verwendet man vorteilhafterweise Nitrocellulose- oder Nylonmembranen, und für die Kügelchen oder Mikrotiterplättchen die Kunststoffe Polyvinyl, Polypropylen, Polystyrol oder andere. Man kann außerdem Gele oder Partikel auf Agarose-, Acrylamid- oder Latexbasis verwenden.
Die Sensibilisierung der festen Phase durch den Liganden, der eine Affinität für die zu bestimmende Substanz aufweist, erfolgt entweder durch passive Adsorption oder durch kovalente Kopplung je nach der Natur des Trägers und den Erfordernissen des Tests. Die feste Phase kann nach der Adsorption des Liganden mit Proteinen oder Makromolekülen wie Rinderalbumin, fetales Kälberserum oder Gelatine gesättigt oder durch Chemikalien wie Tween® das nichtspezifische Wechselwirkungen unterdrücken kann, chemisch modifiziert werden. Diese feste Phase kann zur Konservierung in getrockneter oder lyophilisierter Form modifiziert werden. Der Ligand kann ein Lectin, ein Antigen oder in den meisten Fällen ein Antikörper sein.
In einer besonders interessanten Ausführung der Erfindung besteht die feste Phase aus einem Reaktionsstreifen oder einem Plättchen, die durch mindestens zwei unterschiedliche Liganden sensibilisiert sind, welche spezifisch für verschiedene biologische Substanzen sind, von denen man annimmt, daß sie vielleicht in der zu prüfenden Probe vorhanden sind, zum Beispiel ein Ligand für die roten Blutkörperchen der Gruppe A und ein Ligand für die roten Blutkörperchen der Gruppe B. In diesem Fall erlaubt ein Kontakt dieses Streifens oder Plättchens mit einer Blutprobe eine unmittelbare Bestimmung der Blutgruppe, wobei der entsprechende Bereich gefärbt erscheint.
Jeder Bereich mit einem Liganden kann eine Kennzeichnung beinhalten, die es dem Menschen oder der Maschine erlaubt, das Ergebnis abzulesen, zum Beispiel durch alphanumerischen oder Strichcode.
Um die Verwendung solcher Träger zu erleichtern, ist es genausogut möglich, die verschiedenen Liganden nach einem eigenen Schema auf den Streifen zu bringen, zum Beispiel in Form eines Buchstabens oder eines Zeichens, das mit dem betreffenden Phänotyp in einer Beziehung steht.
So kann man etwa Streifen vorsehen, auf denen sich die Antikörper Anti-A in Form eines A, die Antikörper Anti-B in Form eines B und die Antikörper Anti-AB in einer AB-Form befinden. Auf diese Weise erlaubt die Anheftung der roten Blutkörperchen an den spezifischen Antikörper ein direktes Ablesen des Phänotyps, der in Form eines roten Buchstabens erscheint.
Dieses System erlaubt eine Blutgruppenbestimmung in etwa 5 Minuten, was durch keine der bekannten Methoden erreicht werden kann.
Die selbstauffindbaren biologischen Substanzen werden in Gegenwart der festen Phase in wäßrigem Medium bebrütet. Dieses Medium kann eine normale oder pathologische biologische Flüssigkeit sein, wie Blut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Pleuraerguß-, Bauchfell-, Gelenkschmiere- oder andere Flüssigkeit, oder ein künstliches isotones Medium, das unter Umständen Zusätze zur Optimierung des Verfahrens enthält (Proteine, Salze, Makromoleküle, Chemikalien wie Tween®) und in dem die Probe suspendiert ist. Das Bebrüten erfolgt bei Raum- oder einer anderen Temperatur mit oder ohne Rühren während einer Zeit, die von der Natur der Substanz und ihrer Fähigkeit, sich am Liganden anzuheften, abhängen wird. Nach dem Bebrüten wird die flüssige Phase durch Phasentrennung oder durch Waschen zum Beispiel in einer Lösung wie einem Puffer PBS-Tween von 0.05% entfernt.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich insbesondere für den Nachweis der Phänotypen roter Blutkörperchen, die sich auf Oberflächen-Antigene beziehen, mit Hilfe der entsprechenden monoklonalen Antikörper als Liganden.
Der Nachweis der Fixierung der roten Blutkörperchen kann wegen der auftretenden Rotfärbung direkt erfolgen, oder aber, um das Verfahren empfindlicher zu machen, werden die nach dem Waschen fixierten Zellen durch ein Hämolysereagenz lysiert, und man bestimmt eine enzymatische Aktivität, insbesondere die Aktivität der Peroxidase des Lysats. Die Bestimmung der Peroxidase ist bekannt, dabei kann ein chromogenes Substrat wie Orthophenylendiamin (OPD) oder TMB eingesetzt werden.
Der Vorteil der Verwendung der Peroxidase-Aktivität des Hämoglobins beruht auf der Tatsache, daß, auch wenn es in den roten Blutkörperchen noch zahlreiche andere Enzyme gibt,immer Defekte möglich sind, während ein totaler oder weitgehender Hämoglobindefekt tödlich wäre.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf einen Kit zur Bestimmung der Blutgruppe, der folgendes enthält:
- eine feste Phase gemäß der vorliegenden Erfindung, die in verschiedenen Bereichen mit unterschiedlichen Antikörpern versehen ist, wobei jeder spezifisch für eine Blutgruppe ist;
- eine Waschlösung;
- ein chromogenes Substrat;
- sowie ein lytisches Reagenz.
Die nachfolgenden Beispiele sollen weitere Merkmale und Vorteile des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung darlegen.

BEISPIEL 1

BESTIMMUNG DER BLUTGRUPPE IM ABH-SYSTEM

Gereinigte monoklonale Antikörper des Typs Anti-A und Anti-B werden auf einem festen Mikrotiterplättchen des Typs Microelisa mit U-Boden aus Immulon der Referenz M 124 B des Laboratoire Dynatech, oder einem weichen PVC-Mikrotiterplättchen mit U-Boden der Referenz M 24 desselben Laboratoriums passiv adsorbiert. Antikörper des Typs Anti-A+B können ebenfalls verwendet werden. Dazu werden die gereinigten monoklonalen Antikörper mit der Konzentration 4 ug/ml in einem Hydrogencarbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) 3 Stunden bei 37ºC bebrütet, in Portionen von 100 ul pro Loch, wobei das Plättchen mit einer Klebefolie abgedeckt wird. Das Plättchen wird 30 Minuten durch eine 10%ige Lösung fetalen Kälberserums gesättigt.
In Röhrchen mit EDTA, Citrat oder Heparin entnommene Gesamtblutproben der Gruppen A, B, AB oder 0 sowie 1%ige Suspensionen von Blutkörperchen der schwachen Gruppen A&sub2;, A&sub3;, Ax, Aend, B&sub3;, A&sub1;Bx und cis-AB werden in Portionen zu 100 ul pro Ansatz verteilt und 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet.
Das Plättchen wird mit einem Multiwash Dynatech in vier Durchläufen mit PBS-Puffer (0,15 M, pH 7,4), der 0,05% Tween 20® enthält, automatisch gewaschen. Die Reaktion der roten Blutkörperchen der Gruppen A und AB mit den Antikörpern Anti-A sowie der roten Blutkörperchen der Gruppen B und AB mit den Antikörpern Anti-B läßt sich unmittelbar ablesen.
Diese positive Reaktion zeigt sich durch makroskopische Adsorption der roten Blutkörperchen auf der Oberfläche der mit Antikörpern versehenen Ansätze, im Falle einer negativen Reaktion ist kein Blutkörperchen zu sehen (zum Beispiel bei den roten Blutkörperchen der Gruppe 0). Um das Ablesen empfindlicher oder objektiv zu machen, kann die Reaktion nach einer Lyse der roten Blutkörperchen durch die Peroxidase-Reaktion des Hämoglobins nachgewiesen werden. Dazu wird eine hämolysierende Lösung, die ein Substrat der Peroxidase enthält, in die Ansätze gegeben: 3 mg/ml Orthophenylendiamin (OPD) in einem Citratpuffer (0,1 M; pH) in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; und mit 0,1% Saponin als Hämolysereagenz. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 50 ul H&sub2;SO&sub4; (1,5 M) abgebrochen. Die Reaktionen werden am Spektrophotometer bei 490 nm abgelesen.
In diesem Beispiel ergeben die Proben der verschiedenen normalen oder schwachen (mit wenigen antigenen Stellen) Gruppen positive Reaktionen mit einer Extinktion von über 1,5, wobei die sehr schwachen Gruppen mit besonders wenigen antigenen Stellen (Ax, Aend, A&sub1;Bx, cis-AB) eine Extinktion ergeben, die zwischen 0,15 und 1,5 liegt oder 1,5 übersteigt. Das Grundrauschen bleibt in allen Fällen unterhalb 0,050.
Tabelle I zeigt ein Beispiel für Ergebnisse im Vergleich mit der klassischen Technik der Agglutination. Die Ergebnisse sind für den Test gemäß der Erfindung als Extinktion bei 490 nm ausgedrückt und als Anzahl von Kreuzen gemäß der Intensität dargestellt, wie es für die Agglutination üblich ist. TABELLE 1 Reaktivität einer Auswahl roter Blutkörperchen verschiedener Phänotypen, gemessen als Extinktion (obere Reihe) und durch als Kreuze dargestellte Agglutination (untere Reihe) Anti-A
Diese Ergebnisse zeigen bei der Technik der Erfindung eine größere Empfindlichkeit; mit dieser Technik lassen sich die Proben der schwachen oder eigentümlichen Gruppen wie Ax, Aend, A&sub1;Bx oder cis-AB eindeutig nachweisen, während sie bei der Agglutination nur schwer nachzuweisen oder negativ sind. Das Verfahren der Erfindung zur Bestimmung der Gruppen ABH wurde anhand von 2000 Blutproben von Blutspendern und anhand von seltenen Proben roter Blutkörperchen, die aufgrund ihrer geringen Dichte antigener Stellen oder ihrer Eigentümlichkeit ausgewählt wurden, im Vergleich mit der Agglutinationsmethode bewertet.

BEISPIEL 2

BESTIMMUNG DER BLUTGRUPPEN DES SYSTEMS ABH AUF EINER NITROCELLULOSE- ODER NYLONMEMBRAN

1.) Herstellung der Membranen

Nylon-Membranstreifen des Typs Biodyne TM des Laboratoire Pall werden auf die gewünschte Größe zurechtgeschnitten. Wenn der Test im Kahn-Röhrchen durchgeführt wird, können die Streifen auf die Innenabmessungen des Röhrchens zugeschnitten werden.
Die Membran wird durch monoklonale Antikörper des Typs Anti-A und Anti-B sensibilisiert, die in flüssiger Form entweder mit der Pipette oder mit einem mit der Antikörperlösung getränkten Bausch aufgetragen werden. Damit die aufgetretene Reaktion identifiziert werden kann, wird ein Bausch in Form eines A für Anti- A und in Form eines B für Anti-B auf die Membran gebracht. Die Depots können gleichermaßen in der Form anderer Identifikationszeichen oder in Form von Codes, die der Betreuer oder eine Maschine zu lesen vermag, aufgetragen werden. Wenn man gereinigte Antikörper verwendet, werden diese mit einer Konzentration von 10 ug/ml oder je nach den experimentellen Ergebnissen unter Umständen mit einer anderen Konzentration aufgetragen. Verdünntes Aszites oder Kulturüberstand, die den Antikörper enthalten, können gleichfalls verwendet werden.
Die Membranen werden 2 Stunden bei Raumtemperatur oder 30 Minuten bei 37ºC im Trockenofen getrocknet. Nach der Trocknung wird die Membran in PBS-Puffer bei pH 7,4 gewaschen, dann mit einer Proteinlösung, wie 1% Rinderalbumin in PBS-Puffer oder in 10%igem fetalem Kälberserum oder in 1%iger Gelatine, gesättigt.
In diesem Stadium können die Membranen sofort verwendet oder nach der Trocknung für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden.

2.) Eigentlicher Blutgruppentest

Die sensibilisierten Streifen werden 3 Minuten bei Raumtemperatur mit oder ohne Rühren in ein Röhrchen eingetaucht, das Gesamtblut oder eine Suspension von Blutkörperchen enthält. Nach Abschluß der Bebrütung werden sie mit einer Natriumchloridlösung (0,15 M) abgespült und sofort abgelesen. Wenn es sich um Blut der Gruppe A handelt, erscheint der durch die Fixierung der roten Blutkörperchen in Erscheinung getretene Buchstabe A; wenn es sich um Blut der Gruppe B handelt, erscheint der Buchstabe B; handelt es sich um die Gruppe AB, so erscheinen beide Buchstaben; handelt es sich um Blutkörperchen der Gruppe 0, so bleibt der Streifen völlig weiß (Abbildung 1).
Das Verfahren der Erfindung läßt sich gleichermaßen zum Nachweis anti-erythrantigener Antikörper im menschlichen Blutserum oder - plasma verwenden. Im folgenden wird zunächst eine erste Methode der Ausführung besagten Verfahrens erläutert. Es handelt sich um einen Sandwichtest, bei dem die nachzuweisenden Antikörper auf der durch die Erythrantigene sensibilisierten festen Phase immunoadsorbiert und durch spezifische Fixierung menschlicher roter Blutkörperchen nachgewiesen werden. Diese erste Methode ist in Beispiel 3 veranschaulicht.

BEISPIEL 3

Nachweis der Antikörper Anti-A, Anti-B oder Anti-AB

1.) Die Erythrantigene A und B werden auf einem festen Mikrotiterplättchen des Typs Microelisa mit U-Boden aus "Immulon" der Referenz M 124B des Laboratoire Dynatech, oder einem weichen PVC-Mikrotiterplättchen mit U-Boden der Referenz M 24 desselben Laboratoriums passiv adsorbiert.
Die Antigene A oder B können unterschiedlicher Herkunft sein:
- lösliche Antigene menschlichen Ursprungs, die im Speichel bestimmter Personen enthalten sind, oder Schleimextrakte insbesondere von Ovarialcysten.
- Antigene tierischen Ursprungs, etwa vom Pferd oder vom Schwein (Extrakte des Magenschleims).
- aus der Membran menschlicher roter Blutkörperchen der Gruppe A&sub1;, A&sub2;, B oder AB extrahierte Antigene. In diesem Fall werden Stromas roter Blutkörperchen hergestellt (zum Beispiel nach der von GARDAS, A. und KOSCISLAK, J. in Vox Sang., 1971, 20, 2, 137-149 beschriebenen Methode). Die Erythrantigene werden im Verlaufe von 15 Minuten bei 4ºC in Gegenwart einer Lösung von 2% (w/v) Octylglucosid (Laboratoire SIGMA) und 5% (v/v) Ammoniak aus der Membran extrahiert. Auch andere Dissoziationsmittel können eingesetzt werden, wie 1%iges Triton X 100. Das Präparat wird 30 Minuten bei 15000 g zentrifugiert, um das unlösliche Material abzutrennen.
Dieses Antigen-Rohextrakt kann direkt nach Verdünnung in Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7,4) verwendet werden, um die Mikrotiterplättchen zu sensibilisieren, oder zusätzlichen Reinigungsschritten unterworfen werden.
- synthetisches Antigen, das an einen makromolekularen Träger wie Rinderalbumin gekoppelt ist oder nicht ist.
- Anti-Idiotypen-Antikörper können gleichermaßen verwendet werden, um die feste Phase zu sensibilisieren.
Zur passiven Adsorption auf den Mikrotiterplättchen werden die Antigene auf eine Konzentration im Bereich 10 ug/ml verdünnt, und zwar in Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7,4) bei aus Erythrocytenmembranen extrahierten Antigenen oder in einem Hydrogencarbonatpuffer (0,1% M, pH 9,6) bei löslichen Antigenen.
Dazu wird die verdünnte Antigenlösung 3 Stunden bei 37ºC in Portionen von 200 ul pro Vertiefung bebrütet, wobei das Plättchen mit einer Klebefolie abgedeckt wird.
Das Plättchen wird 30 Minuten durch eine Lösung von 10% fetalen Kälberserums oder von 1% Rinderalbumin gesättigt. Nach Waschen des Plättchens in PBS-Puffer (0,15 M, pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 werden die zu untersuchenden Plasma- oder Serumproben in Portionen von 150 ul pro Vertiefung verteilt, dann wird eine Blutkörperchenlösung mit 2 der Phänotypen A&sub1;&sub1; A&sub2;, B, AB oder 0 in Portionen von 50 ul pro Vertiefung zugefügt. Um die Reaktion empfindlicher zu machen, können die Blutkörperchen mit Enzymen wie Papain behandelt werden.
Das Plättchen wird 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet, dann in 4 Durchläufen in einem PBS-Puffer (0,15 M, pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 automatisch gewaschen.
Die Reaktionen auf die Seren Anti-A, Anti-B bzw. Anti-AB können bei den roten Blutkörperchen A&sub1; und A&sub2; für Anti-A, B für Anti-B sowie A&sub1;, A&sub2; oder B für Anti-AB unmittelbar abgelesen werden.
Diese positive Reaktion zeigt sich durch makroskopische Adsorption der roten Blutkörperchen auf der Oberfläche der mit Antikörpern versehenen Ansätze, im Falle einer negativen Reaktion ist kein Blutkörperchen zu sehen (zum Beispiel bei den roten Blutkörperchen der Gruppe 0). Um das Ablesen empfindlicher oder objektiv zu machen, kann die Reaktion nach einer Lyse der roten Blutkörperchen durch die Peroxidase-Reaktion des Hämoglobins nachgewiesen werden. Dazu wird eine hämolysierende Lösung, die ein Substrat der Peroxidase enthält, in die Ansätze gegeben: 3 mg/ml Orthophenylendiamin (OPD) in einem Citratpuffer (0,1 M; pH) in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; und mit 0,1% Saponin als Hämolysereagenz. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 50 ul H&sub2;SO&sub4; (1,5 M) abgebrochen. Die Reaktionen werden am Spektrophotometer bei 490 nm abgelesen.
Das Diagramm der Abbildung 2 veranschaulicht die mit der Methode (Methode I) des Beispiels 3 erhaltenen Ergebnisse im Falle der Titration eines Serums, das einen Antikörper Anti-A bzw. einen Antikörper Anti-B enthält. Auf der Abszisse ist die reziproke Verdünnung des Serums aufgetragen, und auf der Ordinate die Extinktion (DO) bei 495 nm. Diese Abbildung 2 macht deutlich, daß die Empfindlichkeit der Bestimmung bei der Erfindung zumindest die gleiche ist wie bei der klassischen Technik der Agglutination in Röhrchen.
Das Verfahren des Nachweises der anti-erythrantigenen Antikörper kann gleichermaßen durch eine zweite Methode ausgeführt werden, bei der es sich um einen Test in zwei Schritten handelt, bei dem die Probe mit den nachzuweisenden Antikörpern gegen rote Blutkörperchen in Gegenwart menschlicher Hämatine verschiedener Phänotypen bebrütet wird. Nach der Entfernung der Antikörper, die nicht mit den Hämatinen reagiert haben (durch Vorbeileiten an einem Makromolekülfilter oder durch Waschen), werden die roten Blutkörperchen mit einer festen Phase bebrütet, die so mit Antikörpern gegen menschliches Immunglobulin versehen ist, daß auf der festen Phase spezifisch nur die Hämatine zurückgehalten werden, die mit den nachzuweisenden Antikörpern reagiert haben. Diese Methode kann den Nachweis der Antikörper gegen rote Blutkörperchen durch einen Coombs-Test, die unter Umständen im Serum bestimmter Kranker oder Blutspender enthalten sind und die, wenn sie nicht gefunden werden, zu hämolytischen Unfällen nach einer Transfusion führen können, mit höherer Empfindlichkeit und einem quantitativen Ergebnis ersetzen. Diese Methode II wird durch Beispiel 4 erläutert.

BEISPIEL 4: Detektion von Antikörpern des Typs Anti-(Rhesus D)

Durch Affinitätschromatographie gereinigte oder monoklonale Antikörper gegen menschliches Immunglobulin, die menschliches IgG und IgM erkennen, oder ein Gemisch aus Anti-Human-IgG und Anti- Human-IgM werden auf einem Mikrotiterplättchen des Typs Microelisa mit V- oder U-Boden passiv adsorbiert. Dazu werden die Antikörper mit einer Konzentration von 10 ug/ml in Hydrogencarbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) 3 Stunden bei 37ºC in Volumina von 100 ul pro Vertiefung bebrütet. Die feste Phase wird in PBS-Puffer (0,15 M, pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 automatisch gewaschen.
Parallel dazu wird ein Gemisch aus gleichen Teilen einer 0,2%igen Suspension von Hämatinen des Phänotyps Rhesus D und dem Plasma oder Serum, in dem man nach Antikörpern des Typs Anti- (Rhesus D) sucht, 5 bis 10 Minuten bebrütet. Die so bebrüteten roten Blutkörperchen werden nach Waschen in Salzlösung oder Filtrieren auf einer Makromoleküllösung mit dem Mikrotiterplättchen, das mit Antikörpern gegen menschliches Immunglobulin versehen ist, in Kontakt gebracht und 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet.
Die Plättchen werden mit PBS (0,15 M, pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 automatisch gewaschen.
Die Reaktionen können bei Seren, die Antikörper gegen Rhesus D enthalten, an den Rhesus-D-Antigen tragenden Hämatinen unmittelbar abgelesen werden.
Die positiven Reaktionen zeigen sich durch makroskopische Adsorption der roten Blutkörperchen auf der Oberfläche der mit Antikörpern versehenen Ansätze; im Falle einer negativen Reaktion ist kein Blutkörperchen zu sehen. Um das Ablesen empfindlicher oder objektiv zu machen, kann die Reaktion nach einer Lyse der roten Blutkörperchen durch die Peroxidase- Reaktion des Hämoglobins nachgewiesen werden. Dazu wird eine hämolysierende Lösung, die ein Substrat der Peroxidase enthält, in die Ansätze gegeben: 3 mg/ml Orthophenylendiamin (OPD) in einem Citratpuffer (0,1 M; pH) in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; und mit 0,1% Saponin als Hämolysereagenz. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 50 ul H&sub2;SO&sub4; (1,5 M) abgebrochen. Die Reaktionen werden am Spektrophotometer bei 490 nm abgelesen.
Das Diagramm in Abbildung 3 veranschaulicht die mit der Methode (Methode II) des Beispiels 4 erhaltenen Ergebnisse. Für die in Abbildung 3 dargestellten Versuche hat man drei Serumproben verwendet, die vorher so weit verdünnt wurden, wie es der letzten noch positiv reagierenden Verdünnung bei der Methode von Coombs entspricht. Wie in Abbildung 2 hat man auf der Abszisse die Werte der Verdünnung und auf der Ordinate die bei 495 nm gemessene Extinktion DO aufgetragen. Die in Abbildung 3 aufgetragenen Kurven zeigen, daß das Verfahren der Erfindung mindestens zweiunddreißig mal so empfindlich ist wie die Methode von Coombs für die Titration der Antikörper gegen Rhesus D.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Zelle oder eines Mikroorganismus in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) man auf einer festen Phase einen Liganden immobilisiert, der eine Fixierungsaffinität für die Zelle oder den Mikroorganismus besitzt,

b) man die Probe in Gegenwart der festen Phase, auf der der Ligand immobilisiert ist, bebrütet,

c) man die feste Phase nach dem Bebrüten wäscht, d) man die Gegenwart der Zelle oder des Mikroorganismus, der auf die feste Phase durch die Zwischenstufe des Liganden fixiert ist, durch das Vorhandensein einer enzymatischen Aktivität oder chemisch-endogenen Aktivität der Zelle oder des Mikroorganismus nach der Lysis aufzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ein rotes Blutkörperchen, ein Leukozyt, ein Blutplättchen, eine Zelle epithelialen, endothelialen, Ursprungs ist oder aus der normalen oder pathologischen Bindehaut stammt und der Mikroorganismus eine Bakterie, ein Parasit oder ein Virus ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ausgewählt ist aus Lectinen, Antigenen und Antikörpern.

4. Verfahren zur Bestimmung eines Oberflächenantigens einer Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) man auf einer festen Phase einen dem betreffenden Antigen entsprechenden Antikörper immobilisiert,

b) man die Probe, die die Zelle enthält, in Gegenwart der festen Phase, auf der der Antikörper immobilisiert ist, bebrütet,

c) man die feste Phase nach der Bebrütung wäscht,

d) man die Gegenwart der Zelle mit Hilfe einer ihr innewohnenden Eigenschaft aufzeigt, insbesondere durch das Aufzeigen einer enzymatischen Aktivität der Zelle nach ihrer Lysis.

5. Verfahren zur Bestimmung der Blutgruppe in einer Zelle, die sich auf die Oberflächenantigene der roten Blutkörperchen bezieht, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) man auf einer festen Phase einen spezifischen Antikörper der zu bestimmenden Gruppe immobilisiert,

b) man die Probe in Gegenwart der festen Phase, auf der der Antikörper immobilisiert ist, bebrütet,

c) man die feste Phase nach dem Bebrüten wäscht,

d) man die Anwesenheit der roten Blutkörperchen, die durch das niedergeschlagene Zwischenprodukt des Antigens fixiert sind, mit Hilfe einer den roten Blutkörperchen innewohnenden Eigenschaft aufzeigt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Probe Gesamtblut oder verdünntes Blut darstellt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen durch ihre eigene Farbe angezeigt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen durch das Vorhandensein einer enzymatische Aktivität oder einer chemisch-endogenen Aktivität nach der Lysis angezeigt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch-endogene Aktivität die Peroxydase-Aktivität des Hämoglobins ist, die durch ein chromogenes Substrat aufgezeigt wird.

11. Feste Phase zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehrere fixierte Liganden enthält und daß sie modifiziert ist, damit sie in getrockneter oder lyophilisierter Form aufbewahrt werden kann.

12. Feste Phase zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Mikrotitrierstreifens oder -plättchens oder von Kügelchen vorliegt.

13. Feste Phase nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Ligand auf dem Streifen oder Plättchen gemäß einer bestimmten Konfiguration abgeschieden wird.

14. Feste Phase nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Streifen einen Anti-A-Antikörper enthält, der in Form eines A niedergeschlagen wird, einen Anti-B- Antikörper, der in Form eines B und/oder einen Anti-AB- Antikörper, der in Form eines AB für die Blutgruppe abgeschieden wird.

15. Feste Phase nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß jeder einen Liganden enthaltende Bereich einen Hinweis ergibt, gemäß dem es dem Menschen oder der Apparatur möglich ist, die Art des Resultats zu erkennen, z. B. insbesondere einen alpha-numerischen Code oder einen Strichcode.

16. Kit zur Bestimmung der Blutgruppe gemäß dem Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

- eine feste Phase, ausgestattet mit verschiedenen Antikörpern für verschiedene Bereiche, wobei jeder spezifisch für eine Blutgruppe ist;

- eine Waschlösung

- ein chromogenes Substrat

- ein Mittel für die Lysis.