CN115754311A - 利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测abo血型抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，属于生物检测技术领域。此方法为将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心后，洗涤去除没有吸附的红细胞，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色，加终止液终止反应，在一定波长的滤光片下用酶标仪检测吸光度值，根据OD值的大小判断待分型红细胞的ABO血型抗原；此方法易于自动化操作且稳定性高，此方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果可以通过酶标仪进行定量，灵敏度高且特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，属于生物检测领域。
背景技术
ABO血型可以分为A型、B型、O型和AB型，是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位，其中，临床输血中ABO血型分型的意义最为重要，属于临床输血前检查的必查项目。
ABO血型分型可分正定型和反定型。正定型是用抗A和抗B抗体去鉴定被检者红细胞上有没有相应的抗原，反定型是用A型红细胞和B型红细胞去鉴定被检者血清（血浆）中有无相应的抗体。根据正反定型结果，判断被检者ABO系统的血型。
目前，通用的ABO血型分型方法有玻片法（纸片法）、试管法、微板凝集法、微柱凝胶法等方法（玻片法、试管法、微板凝集法、微柱凝胶法均记载于《全国临床检验操作规程》中）。但是，这些方法均存在缺陷，例如：
玻片法和试管法需要人工操作，费时费力，还容易产生人为误差；
微板凝集法抗体和红细胞的加样量和抗体批间差异会影响结果的稳定性；
微柱凝胶法在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，影响检测结果。
CN113092792A公开了一种检测ABO血型抗原的方法、系统及其应用，该方法基于固相吸附法检测ABO血型抗原的正定型方法，此方法为将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心后，观察待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器底部的吸附情况，根据吸附情况判断待分型红细胞的ABO血型抗原；此方法避免了人工操作，易于自动化操作且稳定性高，此方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果清晰宜读，灵敏度高且特异性强，并且，此方法摆脱对价格较高的凝胶的依赖，两个微孔和微量抗体与样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞的血型抗原，成本低。但该方法通过肉眼或CCD照相来判定吸附情况，不能给出确切的数值，人工判读存在主观因素，通过CCD机器判读也可能产生误差，只能定性，无法定量。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，具有易于自动化操作，且有效降低检测成本的优势，将传统的血型定性检测提升为定量检测，OD值的大小间接反映红细胞上该抗原的多少，有助于临床对红细胞亚型的鉴别。
一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法包含分型步骤；所述分型步骤为：将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心，离心结束后，用生理盐水洗涤微孔板3-6次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干微孔板中残余液体，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色3-20分钟，用酸性溶液终止反应2-10分钟，置酶标仪在特定波长下测定OD值，根据OD值的大小判定被检样本的血型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
进一步的，所述离心的转速为90-360g、时间为1-30min。
进一步的，所述分型步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
进一步的，所述稀释步骤为：用Liss（低离子强度溶液）或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
进一步的，所述稀释步骤为：用生理盐水将待分型红细胞洗涤3-5次后，用Liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
进一步的，所述待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器或包被有抗B抗体的容器中的添加量为10-100μL。
进一步的，所述包被有抗A抗体的容器的制备方法为：将用缓冲液A稀释好的抗A抗体添加至容器后，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有蔗糖、脱脂奶粉、Tween20（吐温-20）的缓冲液B后，于37℃封闭0.5-3h，得到包被有抗A抗体的容器。
进一步的，所述缓冲液B为pH 6.5-8.5的PBS缓冲液；所述蔗糖在缓冲液B中的质量浓度为1-10%；所述脱脂奶粉在缓冲液B中的质量浓度为0.1-3%；所述Tween20在缓冲液B中的体积浓度为0.01-0.5%。
进一步的，所述包被有抗A抗体的容器的制备方法包含如下步骤：
包被步骤：用pH 6.5-8.5的PBS缓冲液A（含一定浓度的NaCl）将抗A抗体倍比稀释16-2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；NaCl的优选浓度为0.3-3 mmol。
第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C进行洗涤，重复洗涤1-5次，得到经洗涤的容器；
封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含PBS缓冲液B后，于37℃封闭0.5-3h，得到经封闭的容器；
第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C（含一定体积浓度的Tween20）进行洗涤，重复洗涤0-5次，得到包被有抗A抗体的容
所述包被有抗B抗体的容器的制备方法为：将抗B抗体添加至容器后，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有蔗糖、脱脂奶粉、Tween20的缓冲液B后，于37℃封闭0.5-3h，得到包被有抗B抗体的容器。
进一步的，所述包被有抗B抗体的容器的制备方法包含如下步骤：
包被步骤：用pH 6.5-8.5的PBS缓冲液A（含一定浓度的NaCl）将抗B抗体倍比稀释16-2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；
第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C（含一定体积浓度的Tween20）进行洗涤，重复洗涤1-5次，得到经洗涤的容器；
封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有重量浓度为1-10%的蔗糖、重量浓度为0.1-3%的脱脂奶粉、体积浓度为0.01-0.5%的Tween20的pH 6.5-8.5的PBS缓冲液B后，于37℃封闭1-6h，得到经封闭的容器；
第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C（含一定体积浓度的Tween20）进行洗涤，重复洗涤0-5次，得到包被有抗B抗体的容器。
进一步的，所述容器为微孔板。
进一步的，所述微孔板为U型微孔板或平底微孔板。
本发明还提供了利用上述方法进行检测的系统，所述系统包括分别包被有抗A抗体和抗B抗体的容器。
本发明还提供了上述系统的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
包被步骤：将抗A抗体或抗B抗体添加至容器中，于2-8℃包被8-16h，洗涤，得到经包被的容器；
封闭步骤：在经洗涤的容器中加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液B后，于37℃封闭0.5-3h，得到经封闭的容器，洗涤，得到包被有抗A抗体或抗B抗体的容器。
所述包被步骤中，先用pH 6.5-8.5的PBS缓冲液A（含一定浓度的NaCl）将抗A抗体或抗B抗体稀释至16-2048倍，得到稀释液，再将稀释液添加至容器中。
所述洗涤步骤为：加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C（含一定体积浓度的Tween20）进行洗涤，重复洗涤1-5次。
本发明还提供了上述方法或上述系统在检测ABO血型抗原中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法可以避免人工操作，具有易于自动化操作和稳定性高的优势，所述方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果的判定客观，具有灵敏度高和特异性强的优势，并且，所述方法摆脱对价格较高的凝胶的依赖，两个包被有抗A和抗B抗体的微孔和微量样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞的ABO血型抗原，具有成本低的优势。此方法与以往红细胞分型方法只能进行定性分析不同，可以通过检测OD值对阳性结果进行定量分析，OD值的大小间接反映包被在微孔板底部的相应抗体吸附红细胞的多少，也可以反映被检红细胞上相应抗原的数量多少，通过OD值的大小可以分析是否属于红细胞亚型以及其合子型。
附图说明
图1为本发明的一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法的检测原理图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法（参见图1），U型微孔板包被抗A或抗B抗体，加入预分型红细胞离心，含有相应抗原的红细胞与抗体结合，均匀地分布在U型微孔板底部，不含相应抗原的红细胞在离心后在U型微孔板底部汇聚成一个细胞扣，经过生理盐水洗板后，均匀吸附在孔底的相应抗原阳性的细胞不被洗掉，而不含相应抗原的阴性细胞被洗掉，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色，终止反应后测定吸光度值（OD值），OD值的大小反映吸附在微孔板底部的红细胞多少，根据OD值的大小判定相应红细胞上是否含有与微孔板上包被抗体对应的抗原以及抗原量的多少。
实施例1：
本实施例方法包括如下步骤：
（1）包被：用pH 7.2的PBS缓冲液A（含1mmol NaCl）分别将效价512的抗A抗体、抗B抗体倍比稀释512倍，得到稀释液A、B；将稀释液A、B分别以每孔100μL的添加量加入微孔板（U型）后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板A、B；
（2）第一次洗板：以每孔250μL的添加量分别在经包被的微孔板A、B中加入pH 7.2的PBS缓冲液C（含0.02%Tween20）进行洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A1、B1；
（3）封闭：以每孔250μL的添加量分别在经洗涤的微孔板A1、B1中加入含有质量浓度为5%的蔗糖、体积浓度为0.02%的Tween20和质量浓度为0.2%脱脂奶粉的pH 7.2的碳酸盐缓冲液B后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板A、B；
（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤3次后，用Liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.2%，得到待分型红细胞悬液；
（5）分型：以每孔40μL的添加量在经洗涤孔板A2、B2中分别加入待分型红细胞悬液后，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板A3、B3；
（6）洗涤：在A3、B3微孔板中每孔加入250μL生理盐水洗涤4次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；
（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物TMB100μL，避光显色10分钟；
（8）终止：每孔加入0.16M H2SO4 50μL避光静置5分钟终止反应。
（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测OD值。
（10）结果判定。Cutoff值=0.2
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
取已知的A型、B型、AB型、O型红细胞各两个样品，作为分别作为待分型红细胞，按照实施例1方法检测OD值，结果如下。
| 样品编号及血型 | 抗A | 抗B | Cutoff值 | 判定结果 |
| 101#（A型红细胞） | 2.401 | 0.09 | 0.2 | A型 |
| 102#（A型红细胞） | 2.484 | 0.088 | 0.2 | A型 |
| 103#（B型红细胞） | 0.121 | 2.512 | 0.2 | B型 |
| 104#（B型红细胞） | 0.101 | 2.551 | 0.2 | B型 |
| 105#（O型红细胞） | 0.013 | 0.085 | 0.2 | O型 |
| 106#（O型红细胞） | 0.078 | 0.065 | 0.2 | O型 |
| 107#（AB型红细胞） | 2.247 | 2.415 | 0.2 | AB型 |
| 108#（AB型红细胞） | 2.141 | 2.446 | 0.2 | AB型 |
通过实施例1方法，A型、B型、AB型、O型红细胞判定结果与已知血型一致。
实施例2
本实施例提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）包被：用pH 6.5的PBS缓冲液A（含2mmol NaCl）分别将效价512的抗A抗体、抗B抗体倍比稀释512倍，得到稀释液A、B；将稀释液A、B分别以每孔100μL的添加量加入微孔板（U型）后，于2℃包被8h，得到经包被的微孔板A、B；
（2）第一次洗板：以每孔250μL的添加量分别在经包被的微孔板A、B中加入pH 6.5的PBS缓冲液C（含0.02%Tween20）进行洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A1、B1；
（3）封闭：以每孔250μL的添加量分别在经洗涤的微孔板A1、B1中加入含有质量浓度为3%的蔗糖、体积浓度为0.02%的Tween20和质量浓度0.2%脱脂奶粉的pH 6.5的碳酸盐缓冲液B后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板A、B；
（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤4次后，用生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.5%，得到待分型红细胞悬液；
（5）分型：以每孔40μL的添加量在经洗涤孔板A2、B2中分别加入待分型红细胞悬液后，于90g的转速下离心30min，得到经离心的微孔板A3、B3；
（6）洗涤：在A3、B3微孔板中每孔加入250μL生理盐水洗涤4次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；
（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物TMB100μL，避光显色5分钟；
（8）终止：每孔加入0.15M H2SO4 50μL避光静置10分钟终止反应。
（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测OD值。
（10）结果判定。Cutoff值=0.2
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
取已知的A型、B型、AB型、O型红细胞各两个样品，作为分别作为待分型红细胞，按照实施例2方法检测OD值，结果如下。
| 样品编号及血型 | 抗A | 抗B | Cutoff值 | 判定结果 |
| 201#（A型红细胞） | 2.305 | 0.122 | 0.2 | A型 |
| 202#（A型红细胞） | 2.37 | 0.064 | 0.2 | A型 |
| 203#（B型红细胞） | 0.126 | 2.107 | 0.2 | B型 |
| 204#（B型红细胞） | 0.079 | 2.333 | 0.2 | B型 |
| 205#（O型红细胞） | 0.059 | 0.096 | 0.2 | O型 |
| 206#（O型红细胞） | 0.063 | 0.108 | 0.2 | O型 |
| 207#（AB型红细胞） | 2.251 | 2.656 | 0.2 | AB型 |
| 208#（AB型红细胞） | 2.262 | 2.303 | 0.2 | AB型 |
通过实施例2方法，进行A型、B型、AB型、O型红细胞判定，结果与已知血型一致。
实施例3
本实施例提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）包被：用pH8.5的PBS缓冲液A（含0.8mmol NaCl）分别将效价512的抗A抗体、抗B抗体倍比稀释512倍，得到稀释液A、B；将稀释液A、B分别以每孔100μL的添加量加入微孔板（平底）后，于8℃包被8h，得到经包被的微孔板A、B；
（2）第一次洗板：以每孔250μL的添加量分别在经包被的微孔板A、B中加入pH8.5的PBS缓冲液C（含0.02%Tween20）进行洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A1、B1；
（3）封闭：以每孔250μL的添加量分别在经洗涤的微孔板A1、B1中加入含有质量浓度为1%的蔗糖、体积浓度为0.02%的Tween20和0.2%脱脂奶粉的pH 8.5的碳酸盐缓冲液B后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板A、B；
（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤5次后，用Liss将待分型红细胞稀释至浓度为0.2%，得到待分型红细胞悬液；
（5）分型：以每孔40μL的添加量在经洗涤孔板A2、B2中分别加入待分型红细胞悬液后，于360的转速下离心1min，得到经离心的微孔板A3、B3；
（6）洗涤：在A3、B3微孔板中每孔加入250μL生理盐水洗涤4次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；
（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物TMB100μL，避光显色10分钟；
（8）终止：每孔加入0.16M H2SO4 50μL避光静置10分钟终止反应。
（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测OD值。
（10）结果判定。Cutoff值=0.2
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
取已知的A型、B型、AB型、O型红细胞各两个样品，作为分别作为待分型红细胞，按照实施例1方法检测OD值，结果如下。
| 样品编号及血型 | 抗A | 抗B | Cutoff值 | 判定结果 |
| 301#（A型红细胞） | 2.467 | 0.12 | 0.2 | A型 |
| 302#（A型红细胞） | 2.329 | 0.136 | 0.2 | A型 |
| 303#（B型红细胞） | 0.085 | 2.141 | 0.2 | B型 |
| 304#（B型红细胞） | 0.094 | 2.426 | 0.2 | B型 |
| 305#（O型红细胞） | 0.095 | 0.119 | 0.2 | O型 |
| 306#（O型红细胞） | 0.076 | 0.105 | 0.2 | O型 |
| 307#（AB型红细胞） | 2.648 | 2.356 | 0.2 | AB型 |
| 308#（AB型红细胞） | 2.223 | 2.461 | 0.2 | AB型 |
通过实施例3方法进行A型、B型、AB型、O型红细胞判定，结果与已知血型一致。
实施例4
本实施例提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）包被：用pH7的PBS缓冲液A（含3mmol NaCl）分别将效价512的抗A抗体、抗B抗体倍比稀释512倍，得到稀释液A、B；将稀释液A、B分别以每孔100μL的添加量加入微孔板（U型）后，于5℃包被13h，得到经包被的微孔板A、B；
（2）第一次洗板：以每孔250μL的添加量分别在经包被的微孔板A、B中加入pH7的PBS缓冲液C（含0.02%Tween20）进行洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A1、B1；
（3）封闭：以每孔250μL的添加量分别在经洗涤的微孔板A1、B1中加入含有质量浓度为8%的蔗糖、体积浓度为0.02%的Tween20和0.2%脱脂奶粉的pH 9.6的碳酸盐缓冲液B后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板A、B；
（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤6次后，用Liss将待分型红细胞稀释至浓度为0.2%，得到待分型红细胞悬液；
（5）分型：以每孔40μL的添加量在经洗涤孔板A2、B2中分别加入待分型红细胞悬液后，于200的转速下离心2min，得到经离心的微孔板A3、B3；
（6）洗涤：在A3、B3微孔板中每孔加入250μL生理盐水洗涤4次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；
（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物TMB100μL，避光显色10分钟；
（8）终止：每孔加入0.16M H2SO4 50μL避光静置10分钟终止反应。
（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测OD值。
（10）结果判定。Cutoff值=0.2
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
取已知的A型、B型、AB型、O型红细胞各两个样品，作为分别作为待分型红细胞，按照实施例1方法检测OD值，结果如下。
| 样品编号及血型 | 抗A | 抗B | Cutoff值 | 判定结果 |
| 401#（A型红细胞） | 2.507 | 0.099 | 0.2 | A型 |
| 402#（A型红细胞） | 2.669 | 0.066 | 0.2 | A型 |
| 403#（B型红细胞） | 0.082 | 2.542 | 0.2 | B型 |
| 404#（B型红细胞） | 0.083 | 2.299 | 0.2 | B型 |
| 405#（O型红细胞） | 0.068 | 0.125 | 0.2 | O型 |
| 406#（O型红细胞） | 0.076 | 0.069 | 0.2 | O型 |
| 407#（AB型红细胞） | 2.28 | 2.197 | 0.2 | AB型 |
| 408#（AB型红细胞） | 2.249 | 2.488 | 0.2 | AB型 |
通过实施例4方法进行A型、B型、AB型、O型红细胞判定，结果与已知血型一致。
综上，本发明实施例1-4共进行32个已知血样的血型判定，其结果均与已知结果一致。
Claims (12)
1.一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述方法包含分型步骤；所述分型步骤为：将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心，离心结束后，洗涤，去除残液，再加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色3-20分钟，加入酸性溶液终止反应，然后置于酶标仪，在合适的光波下检测吸光度值，即OD值；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；
若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；
若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；
若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
2.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述离心的转速为90-360g、时间为1-30min。
3.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述容器为微孔板，所述微孔板为U型微孔板或平底微孔板。
4.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述洗涤采用生理盐水进行3-6次洗涤。
5.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述 Cutoff值=0.2。
6.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述分型步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
7.如权利要求6所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述待分型红细胞采用Liss或生理盐水进行稀释。
8.利用权利要求1-7任一项所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法进行检测的系统，其特征在于，所述系统包括分别包被有抗A抗体和抗B抗体的容器。
9.基于权利要求8所述的系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
包被步骤：将缓冲液A稀释的抗A抗体或抗B抗体添加至容器中，于2-8℃包被8-16h，用缓冲液C洗涤，得到经包被的容器；
封闭步骤：在经包被的容器中加入含有脱脂奶粉、蔗糖、Tween20的缓冲液B，于37℃封闭0.5-3h，洗涤，得到包被有抗A抗体或抗B抗体的容器。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液A为含一定浓度NaCl的pH6.5-8.5 的 PBS缓冲液，NaCl的浓度为0.3-3mmol；所述缓冲液B为pH 6.5-8.5的PBS缓冲液，其中Tween20在缓冲液中的体积浓度为0.01-0.5%、脱脂奶粉的质量浓度为0.1-3%、蔗糖的质量浓度为1-10%；所述缓冲液C为含有Tween20的pH 6.5-8.5的PBS缓冲液，所述Tween20在缓冲液中的体积比为0.01-0.5%。
11.如权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述包被步骤中，先用PBS缓冲液A将抗A抗体或抗B抗体稀释至16-2048倍，得到稀释液，再将稀释液添加至容器中；
所述洗涤步骤为：加入pH 6.5-8.5的PBS缓冲液C进行洗涤，重复洗涤1-5次。
12.权利要求1-7任一项所述的一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法在检测ABO血型抗原中的应用。
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