CN113156143A - 血型不规则抗体特异性鉴定方法及其试剂 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及新的血型不规则抗体特异性鉴定方法及其试剂。所述方法包括以下步骤：(a)制备特异性血型抗体Fab片段；(b)鉴定不完全抗体的特异性。其中，步骤(a)包括取特异性血型抗体IgG，例如抗D、抗E、抗c、抗e、抗K，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行处理，制备出所述特异性血型抗体IgG的Fab片段，对于部分血型系统的特异性鉴定，还可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶制备IgM的Fab片段，或制备IgG与IgM的Fab片段的混合物；步骤(b)包括：(1)发现不规则抗体；(2)初步推断不规则抗体的特异性；(3)制备致敏红细胞；(4)将被检血清与致敏红细胞或相应抗原阳性的红细胞进行反应；(5)判定结果。所述试剂即不规则抗体特异性鉴定方法步骤(a)中制备的特异性血型抗体Fab段。
Description
技术领域
本发明属于血型不规则抗体检测和鉴定技术领域，具体涉及新的血型不规则抗体特异 性鉴定方法以及血型不规则抗体特异性鉴定试剂。
背景技术
血清中不规则抗体又称意外抗体，是指不符合ABO血型系统Landsteiner法则的血型抗 体，也就是抗A、抗B和抗AB以外的血型抗体。在正常的人血型抗体中有IgG与IgM两种类型。现在临床研究所知ABO血型的系统抗A、抗B抗体大多是属于IgM型的，不规则抗体 多为IgG型。抗A、抗B的IgM型的抗体能够在盐水介质中与红细胞表面的A、B抗原出现特 异性结合，并且产生肉眼可见的凝集，临床上传统用这种方法进行人体ABO血型鉴定。但 是，传统的盐水测血型和交叉配血试验只对ABO血型系统有效，对其他多种血型系统无效。 在需要输血或妊娠情况下，就需要检测血液中不规则抗体，防止输血或生产时不规则抗体 与相应抗原结合发生免疫反应。否则，轻则引起发热、寒战，重则导致溶血，危及生命。 不规则抗体会导致新生儿溶血病，影响新生儿脏器、智力的发育，严重者亦可威胁新生儿 生命。因此，输血者、孕妇需要做不规则抗体筛查，献血者也应做好筛查工作，以防将含 有不规则抗体的血液输注给他人。
目前，不规则抗体筛查和鉴定是采用已知抗原表型的O型红细胞组，在不同的温度， 采用不同的反应介质(盐水、抗人球蛋白介质、酶介质、聚凝胺等)筛查被检血清中是否含 有不规则抗体。如果有，要进一步鉴定不规则抗体的特异性，若此抗体具有临床意义，输血时应选用无相应抗原的红细胞，避免输血反应的发生，确保输血安全。如果被检血 清与自身细胞、筛检细胞无反应，说明血清中无不规则抗体。如果被检血清与自身细胞无 凝集，但和一个或几个筛查细胞凝集，则说明含有不规则抗体，判定抗体筛查阳性，需 进一步做不规则抗体特异性的鉴定，将红细胞不规则抗体阳性者血清进一步与标准谱细胞 反应，根据反应格局鉴定抗体特异性。当被检血清与所有的谱细胞均为阴性反应时，则重 复抗体筛查试验，如确与某个筛查细胞呈阳性反应，该抗体可能是低频抗原或私有抗原 的抗体；当被检血清与所有谱细胞均为阳性反应时，则抗体可能是针对高频率抗原或公 共抗原，或者存在混合抗体，有多种特异性，需采用多种方法处理。当被检血清与有的谱 细胞呈阳性反应而与另一些谱细胞呈阴性反应时，则要采取阴性排除、阳性比较、抗原 佐证、概率计算等方法进行判定(《输血免疫血液学实验技术》，编者刘景汉、兰炯采，人 民卫生出版社，2011年，第57-62页)。
结合表1的被检血清与谱细胞反应格局，其抗体特异性判定规则如下：
1.该血清不与7号、9号细胞反应，这两个细胞所含有的抗原相对应的抗体被排除；
2.该血清与1、2、3、4、5、6、8、10号细胞均呈阳性反应，这八个细胞不包含的抗 原对应的抗体也被排除；
3.根据以上排除的结果，可能性最大的是Rh血型系统的抗D或抗E。用抗D和抗E检测 患者细胞上的D、E抗原，如果D抗原为阳性，其不能产生抗D抗体；同样如果E抗原阳性，即可排除抗E；
4.如果D、E抗原同为阴性，仍然不能确定特异性，需再进一步选择两个ccdEe表型的 O型红细胞做补充试验，或者选择另一套有多个ccdEe细胞的谱细胞重新做试验；
5.概率计算：为排除鉴定结果的偶然性，需要根据被检血清与谱细胞阳性反应和阴 性反应的数量，进行统计学处理，P≤0.05时，才可得到明确的结果；当P＞0.05时，是一个 模棱两可的结果，需要再增加谱细胞数量继续试验。Fisher方法计算概率是通过2×2的四格 表计算，被检血清的阳性、阴性反应是和谱细胞上有无特异性抗原相关联的。P＝(a+b)！× (c+d)！×(a+c)！×(b+d)！/n！×a！×b！×c！×d！
表1被检血清与谱细胞反应格局举例
注：10个血型系统、25种抗原(抗体)，引自《输血免疫血液学实验技术》，编者刘景汉、兰炯采，人民卫生出版社，2011 年，第57-62页。
综上所述，现有的方法鉴定不规则抗体的特异性，主要是使用标准谱细胞，而标准谱细胞的建立和保存是非常繁琐和困难的，有很多局限性：
1.建立困难：标准谱细胞由8～16人份的O型红细胞组成，这些细胞要包含尽可能多 的抗原，至少要包含Rh、MNSs、Kell、Diego、Kidd、P、Duffy及Lewis血型系统的20多 种主要抗原。同时必须含有缺乏某种抗原的红细胞，例如Rh阴性O型红细胞(熊猫血)。此 种血型在汉族献血者中只有不到1‰，而且还要做到让这些稀有血型者定期献血，并且保 持健康的状态，是一件很困难的事情。
2.保存运输困难：经过精心筛选的O型谱细胞供血者捐献出血液后，若长期保存，须 在-80℃以下的温度，这个温度在运输的过程中是很难保持的，特别是现在的谱细胞很多 都是国外的，长途运输想保持-80℃以下的温度，更难做到。国内运输均采用2℃～8℃运输 和保存，尽管温度容易控制了，但在这个温度下，谱细胞只能保存3个月左右。到客户手中，往往储存期还不到3个月。
3.试验结果不稳定：一是有些抗体的血清学行为有剂量效应，即与纯合子细胞反应 比较强，与杂合子细胞反应比较弱或者不反应，容易遗漏一些具有临床意义的弱抗体；谱细胞在2℃～8℃保存过程中，越接近储存期末细胞的抗原性越弱，有些弱抗体或有剂量效应的抗体可能会影响检出率。
4.由于该方法是用已知抗原的谱细胞与含有意外抗体的被检血清反应，主要通过排 除和推理的方法，来鉴定抗体的特异性，而所谓“已知抗原”实际上是做不到的(现在已知 的红细胞就有30多个血型系统，包含几百种抗原)。最终的结果判断只是一个统计学意义上 的结果(P值越小，鉴定结果越可靠)。
利用标准谱细胞法来检测不规则抗体的方法较为繁琐、检测费用也较高。目前也有一 些方法对不规则抗体的检测进行了改进，但尚不完善。为了改进不规则抗体检测方法，本 申请将传统免疫学中经典的技术，引入血型血清学的实验当中，将血型抗体IgG分子做修 饰和处理，建立了一种新的血型不规则抗体特异性鉴定方法及其试剂。
发明内容
本申请涉及一种血型不规则抗体特异性鉴定方法，其包括以下步骤：
(a)制备特异性血型抗体Fab段；
(b)鉴定不完全抗体的特异性。
其中，步骤(a)进一步包括取特异性血型抗体IgG，例如抗D、抗E、抗c、抗e、抗K， 用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行处理，制备出所述特异性血型抗体Fab片段，对于部分血型 系统的特异性鉴定，还可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶制备IgM的Fab片段，或制备IgG与 IgM的Fab片段的混合物，备用。特异性血型抗体IgG选用自行制备的多克隆抗体或单克 隆抗体，或市售的血型试剂。
其中，步骤(b)进一步包括：
(1)发现不规则抗体；
(2)初步推断不规则抗体的特异性的类别；
(3)制备致敏红细胞；
(4)将被检血清与致敏红细胞或相应抗原阳性的红细胞进行反应；
(5)判定结果。
其中，步骤(b)中的子步骤(1)包括在交叉配血、抗体筛检、新生儿溶血病检查及输血反 应检查中发现血液中含有不规则抗体。
其中，步骤(b)中的子步骤(2)包括根据抗体的血型血清学特点来初步推测抗体特异性的 范围；其进一步包括通过检查被检红细胞的相关抗原来推定不规则抗体的特异性。
其中,步骤(b)中的子步骤(3)包括用相应抗体的Fab与已知相应抗原阳性的红细胞共同 孵育，在特定的温度、离子强度、pH值的条件下，使之充分致敏；然后用生理盐水洗涤3 次，配成2％～5％的细胞悬液待用。例如：对于被检红细胞ccdee表型，选择抗D(Fab)与D 抗原阳性红细胞共同孵育、抗E(Fab)与E抗原阳性红细胞共同孵育或抗C(Fab)与C抗原阳性红细胞共同孵育，以制备所述致敏红细胞。
其中，步骤(b)中的子步骤(4)包括取所述被检血清2滴，相应的所述致敏红细胞2％～5％ 悬液一滴，分别加入试管中，在2℃～39℃，在盐水、酶介质、聚凝胺介质或抗人球蛋白的 介质中分别反应，同时用被检血清与相应抗原阳性的红细胞做平行对照实验。
其中，步骤(b)中的子步骤(5)包括：①在被检血清与对照细胞出现凝集同时与致敏红细 胞不出现凝集的情况下，说明红细胞上相应的抗原被Fab封闭，被检血清中抗体的特异性 与Fab的特异性一致；②在被检血清与对照实验出现凝集但与致敏红细胞也出现凝集的情 况下，有两种可能性：一是被检血清的抗体特异性与Fab段特异性不一致；二是被检血清 中含有2个以上的复合抗体，需要做进一步鉴定，即，用不同特异性的Fab组合分别致敏 红细胞，再观察分析结果，做出判断；③在对照实验不出现凝集的情况下，说明实验过程出现差错，实验结果不可靠，需要重新检查各项实验条件，或更换适当的对照红细胞，重 新进行实验。
本申请至少具有以下有益效果：本申请巧妙地将传统免疫学中经典的技术，引入血 型血清学的实验当中，将血型抗体IgG或IgM分子做修饰和处理，创立了一个简单、方便、准确的血型抗体特异性鉴定的新方法，开发出用于血型鉴定的新试剂(抗体Fab片 段)；使得免疫血液学实验中抗体特异性鉴定，从利用已知抗原(相应谱细胞)鉴定未知抗 体，过渡到利用已知抗体鉴定未知抗体；避免谱细胞建立、保存、运输及结果判断等一 系列过程中的局限性。而且，本申请的鉴定方法能够完全确定不规则抗体特异性，该鉴 定方法相比于通过统计学概率的推定(P≦0.05)来确定不规则抗体特异性的现有标准谱细胞 方法具有明显的优越性。此外，新方法的试剂(抗体Fab片段)属于血清抗体类，在2℃～8℃ 储存时间可以达到两年以上，较标准谱细胞试剂的保存时间长，为实验操作带来便利。
附图说明
下面结合附图对本申请进行详细说明，但附图仅用于描述和解释本申请，并不限制本 申请的保护范围。其中：
图1说明现有技术中的检测不完全抗体的抗人球蛋白实验方法示意图；
图2说明抗体的重链轻链组成示意图；
图3说明抗体重链和轻链的结构域示意图；
图4说明木瓜蛋白酶水解抗体的示意图；
图5说明胃蛋白酶水解抗体的示意图；
图6说明本申请的方法原理示意图。RBC代表带有D抗原的红细胞。图中白色Y字形结 构物质为抗D抗体，如图6A中注明。图中灰色Y字形与抗D抗体具有相似结构的物质为抗人 球蛋白，如图6A和6B中注明；
图7为抗体筛选红细胞试剂盒抗原格局表(生产批号：20197056)；
图8为抗体筛选红细胞试剂盒抗原格局表(生产批号：20207045)。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请的技术方案进行清楚、 完整的描述，基于本申请中具体实施方式，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提 下，所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明的上述内容及其他 方面将通过下文进一步描述清楚，其中：除非指明或者另外定义，使用的所有术语具有在 本领域中的通用意义，为本领域技术人员所公知(例如，参见《输血学检验》，徐群芳、何 智合编，中国医药出版社，2019年)。
本申请中，术语“抗体”是指一种介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺 激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中。
本申请中，术语“血型抗体”是指机体受到血型抗原的刺激后，B细胞被活化、增殖分 化为浆细胞，产生的能与相应抗原结合，并引发免疫反应的免疫球蛋白。
本申请中，术语“规则抗体”是指红细胞表面存在某种抗原，在血液中规律地出现不针 对该抗原的抗体，称为规则抗体。在全部血型系统中，只有ABO血型抗体的产生是有规律 的。
本申请中，“不规则抗体”是指除ABO血型系统以外，其他血型系统产生的无规律的抗 体，或称意外抗体。
本申请中，“完全抗体”又称为盐水抗体，是指在盐水介质中能够直接凝集红细胞的抗 体，其性质多数为IgM类抗体。
本申请中，“不完全抗体”是指与抗原(红细胞)结合后，在盐水介质中不出现可见的凝 集反应，在特殊的介质中才出现凝集反应的抗体，多数为IgG类抗体。
本申请中，“天然抗体”是指无明确的抗体刺激(例如：输血、妊娠等)而存在于血液中 的血型抗体，如：ABO系统的抗体，天然抗体多为IgM类抗体、完全抗体。
本申请中，“免疫抗体”是指有比较明确的抗原刺激后产生的血型抗体，如：输血、妊 娠、注射等。此类抗体多为IgG类、不完全抗体。
本申请中，抗体的“Fab段”、“Fc段”是指木瓜蛋白酶水解抗体分子后产生的2个完全 相同的抗原结合片段(fragment of antigen binding,Fab)和一个可结晶片段(fragment crystallizable,Fc)。
本申请中，“谱细胞”或“配组细胞”是指用于血型抗体特异性鉴定的一组试剂红细胞，一套谱细胞应包括尽可能多的抗原，以及一些缺乏某种抗原的红细胞。一般由8～16 种红细胞组成，能鉴定Rh、MNSs、Kell、Diego、Kidd、P、Duffy及Lewis血型系统的抗 体。
现有检测不完全抗体试验方法的原理介绍
正常情况下，红细胞膜表面有唾液酸，带有负电荷，使红细胞之间相互排斥，相邻红 细胞保持一定的距离；不完全抗体(IgG)分子跨度较小，不足以直接连接相邻红细胞，发生 肉眼可见的凝集。
酶实验原理：酶可以破坏红细胞表面的唾液酸，使其带有的负电荷减少，缩短了相邻 红细胞之间的距离，使不完全抗体(IgG)可以直接连接相邻红细胞，发生凝集；
聚凝胺介质试验原理：聚凝胺是一种高价阳离子季铵盐多价物，在溶液中有多个阳离 子集团，产生多个正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，缩短了相邻红细胞之间的距离， 使不完全抗体(IgG)可以直接连接相邻红细胞，发生凝集；
抗人球蛋白试验原理：抗人球蛋白试验，是由Coombs等人于1945年发明的经典的方 法，在血液免疫学中主要用于检测不完全抗体(IgG)。IgG为7S单体结构，分子量小，分子跨度短，在盐水介质中只能致敏红细胞，不能出现可见的凝集反应；加入抗人球蛋白试剂后，后者的Fab片段与包被在红细胞表面上的IgG的Fc片段结合，从而通过抗人球蛋 白分子的搭桥作用而产生红细胞凝集(如图1所示)(参见《临床输血学检验技术》，编者胡 丽华等，人民卫生出版社，2015年3月，第34～36页)。
本申请的方法原理
抗体是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增强分化为浆细胞所 产生的糖蛋白。免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构相识的球蛋白。免疫球蛋白的基 本结构是由四条肽链组成的对称性结构，呈Y字型，由两条重链(H链)和两条轻链(L链) 通过链间的二硫键连接(如图2所示)。每条重链和轻链的一端为氨基端(N端)，另一端为羧 基端(C端)。在N端，轻链的1/2和重链的1/4部分称为可变区(V区)。V区氨基酸的排列顺序随着抗体特异性的不同而有所变化，识别并结合特异性抗原。轻链和重链的其余部分为稳定区(C区)(如图3所示)。
选用不同的蛋白水解酶水解免疫球蛋白分子，可得到不同的片段。例如，用木瓜蛋白 酶水解IgG，可得到三个片段，即2个抗原结合片段Fab段和一个可结晶片段Fc段。一个Fab片段为单价，可与抗原结合但不发生凝集反应或沉淀反应，Fc段无抗原结合活性(如图4所示)。胃蛋白酶作用于二硫键的近C端，水解后得到一个F(ab′)2片段和一些小片段pFc′，如图5所示(具体参见《分子生物学》，主编陈启民、王金忠、耿运琪，南开大学出版社， 2004年12月，第371～374页；《输血免疫血液学实验技术》，总主编刘景汉、兰炯采，人 民卫生出版社，2011年，第5～6页)。
将特异性已知的血型抗体IgG或IgM用酶如木瓜蛋白酶先行处理，将其水解成为Fab 段和Fc段，如图4所示。再用相应抗原阳性的红细胞与抗体的Fab段共同孵育，因Fab 段仍然具有抗体的活性，即与抗原发生结合，产生了Fab段致敏的红细胞。在用此种致敏 红细胞与被检血清在盐水、酶介质、聚凝胺介质或抗人球蛋白介质中发生反应，同时用无 Fab段致敏的同一个细胞做对照，如果被检血清与已知的血型抗体的特异性一致，由于相 应的抗原已经被Fab结合封闭，因此不出现凝集反应，而对照细胞仍然出现可见的凝集反 应。因此断定被检血清中含有与Fab段特异性相同的抗体。以含有D抗原的红细胞RBC 为例，当D抗原红细胞与被检血清中抗D抗体结合后，在抗人球蛋白分子的搭桥作用下， 细胞出现凝集，如图6A所示(图6A显示为对照实验，以抗D为例)；在D抗原红细胞与 抗D(Fab)片段结合后，由于D抗原已被封闭，致敏红细胞RBC不能与抗D抗体结合，也 不能与抗人球蛋白分子结合，也就不能产生凝集，如图6B所示。
本申请方法的具体步骤
1.特异性抗体Fab段的制备：
取特异性血型抗体IgG(可以自行制备多克隆或单克隆抗体或购买市售的血型试剂)， 例如抗D、抗E、抗c、抗e、抗K等，对于部分血型系统的特异性鉴定，还可以用木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶制备IgM的Fab片段，或制备IgG与IgM的Fab片段的混合物。用木瓜 蛋白酶或胃蛋白酶进行处理，制备出特异性血型抗体的Fab，例如抗D(Fab)，备用。方法 参照《抗体制备与使用实验指南》，第二版，编者G.C.霍华德、M.R.凯瑟，科学出版社， 第208～213页。
2.不完全抗体特异性鉴定的具体过程：
(1)意外抗体的发现：在交叉配血、抗体筛检、新生儿溶血病检查及输血反应检查等 发现血液中含有不规则血型抗体，需做进一步鉴定。
(2)根据抗体的血型血清学特点，初步推测抗体特异性的范围，例如2℃～39℃，如4℃、 22℃、37℃，在盐水、酶介质、聚凝胺介质、抗人球蛋白等介质中的反应特点，初步推测血型抗体特异性的大致范围。
(3)检查被检红细胞的相关抗原，进一步推定意外抗体的特异性。被检红细胞上如果 有此种抗原，其血清中就不应产生相应的抗体。例如：后者的红细胞为ccdee，则高度怀疑抗体为抗D，或者抗E和抗C，而不可能是抗c或抗e。
(4)用可能性较大的相应抗体的Fab与已知相应抗原阳性的红细胞共同孵育，在特定 的温度、离子强度、pH值的条件下，使之充分致敏。然后用生理盐水洗涤3次，配成2％～5％ 的细胞悬液待用。如：被检者红细胞为ccdee表型，选择抗D(Fab)与D阳性红细胞共同孵育，抗E(Fab)与E抗原阳性红细胞共同孵育，抗C(Fab)与C抗原阳性红细胞共同孵育，等 等。
(5)取被检血清2滴，相应致敏红细胞2％～5％悬液一滴，分别加入试管中，在 2℃～39℃(例如在4℃、22℃、37℃)，在介质例如盐水、酶介质、聚凝胺介质、抗人球蛋白 中分别反应，同时用被检血清与相应抗原阳性的红细胞做平行对照实验(参见《临床输血学 检验技术》，主编胡丽华，人民卫生出版社，2019年3月，第33～39页)。
(6)结果判定：
①被检血清与对照细胞出现凝集，与致敏细胞不出现凝集，说明红细胞上相应的抗原 被Fab封闭，被检血清中抗体的特异性与Fab的特异性一致。
②对照实验出现凝集，但与致敏细胞也出现凝集，有二种可能性：一是被检血清抗体 特异性与Fab段特异性不一致；二是血清中含有2个以上的复合抗体，需要做进一步鉴定， 用不同特异性的Fab组合分别致敏红细胞，再观察分析结果，做出判断。
③如果对照实验不出现凝集，说明实验过程出现差错，实验结果不可靠，需重新检查 各项实验条件，或更换适当的对照红细胞，重新进行实验。
本申请试剂
本申请试剂为本申请方法步骤1中用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理特异性血型抗体，制 备出的特异性血型抗体的Fab段。
以上对本发明的具体实施方式作了详细介绍，对于本技术领域的技术人员来说，在不 脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也属于 本发明权利要求的保护范围。
实施例
实施例1.临床送检配血样本发现抗-D一例
2020年1月17日，接收到中国医科大学附属盛京医院(滑翔)送检交叉配血一例，患者 ，男，76岁。配血过程中发现该患者抗体筛选阳性，经鉴定为抗-D，不规则抗体特 异性鉴定过程如下：
1.样本的接收及预处理
(1)实验者审核并检查受血者血标本是否符合要求。
(2)核对血标本标识与送检单是否一致。
(3)实验者确认血标本及送检单符合要求后，填写《输血医学研究所(配血)标本接收、 保存及销毁记录》。
(4)依据输血申请单填写《疑难交叉配血实验记录》。
(5)受血者血标本处理：加入促凝剂的血样经离心、分离，其上层血清可直接用于实 验。将抗凝血离心、分离，取抗凝血红细胞2～3滴，用生理盐水洗涤3次后，配成2％～5％红细胞悬液(1体积压积红细胞加16～40体积生理盐水)，备用。
2.受血者ABO、Rh血型鉴定
(1)ABO血型鉴定(试管法)
正定型：取洁净的试管2支，分别标明抗A、抗B，用滴管分别加入抗A、抗B分型 血清各1滴于试管底部，再以滴管分别加入受血者2％～5％红细胞悬液1滴，混匀。900～1000 g离心15秒，观察结果。
反定型：另取洁净的试管4支分别标明A细胞、B细胞、O细胞以及自身细胞，用滴 管分别向上述已标识的试管中各加入患者血浆2滴，再以滴管分别相应加入A、B、O反 定型红细胞悬液以及患者2％～5％红细胞悬液1滴，混匀。900～1000g离心15秒，观察结 果。
(2)Rh(D)血型鉴定(试管法)
另取三只试管，分别标识受血者，Rh(D)阴性和阳性对照，每管加入1滴IgM+IgG抗Rh(D)血清。向每支试管分别对应加1滴2％～5％受血者红细胞悬液、Rh(D)阴性和阳性标准红细胞悬液，轻轻混匀。室温放置1分钟后，900～1000g离心15秒观察结果。
(3)受血者ABO、Rh(D)血型鉴定结果如表2所示：
表2.试管法ABO及Rh(D)血型鉴定结果
结果表明，该受血者为A型血、Rh(D)阴性。
3.受血者血清抗体筛选(凝胶卡法)
(1)制备I、II、III标准抗体筛查细胞(0.8％)、2号稀释液室温平衡，准备样本并标记 达亚美卡。
(2)三个管中分别加入抗体筛查I、II、III细胞50μl，并加入受检者血浆25μl。37℃孵育15分钟。
(3)使用配套的离心机离心10分钟并判读结果，记录。
实验结果如表3所示：
表3.抗体筛选(凝胶卡法)结果
4.受血者直接抗人球蛋白试验
(1)将EDTA抗凝的血样用生理盐水配置成2％～5％的红细胞。
(2)向测定管和对照管中分别加入1滴2％～5％的红细胞悬液。
(3)生理盐水洗涤3～4次，最后一次洗涤，完全除去上清液。
(4)立即向测定管中加入抗人球蛋白试剂1滴，向对照管中加入1滴盐水或6％白蛋白， 混匀。900～1000g离心15秒。观察凝集情况，评分并记录结果。
(5)若测定管中未观察到凝集情况，向含有抗球蛋白试剂的试管中加入IgG致敏红细 胞，900～1000g离心15秒，观察并记录结果，确认阴性结果的有效性。
直抗结果为阴性。抗筛结果阳性，如图7所附抗体筛选红细胞试剂盒抗原格局表所示， 结合正反定型实验中，受检血清在室温盐水中与O型红细胞呈阴性反应，受检细胞与抗-D 抗体呈阴性反应，揭示受血者血浆中存在不完全抗-D抗体的可能性非常大。需用抗-D(Fab) 抑制实验进一步确认。
5.抗体特异性鉴定(抗-D(Fab)凝集抑制实验)
(1)取已知Rh(D)阳性的O型红细胞1滴，用0.9％生理盐水洗涤3次，配成2％～5％红细胞悬液。
(2)取小试管2支，一支标记为Fab，一支标记为对照。2支试管中各加入上述2％～5％ 红细胞悬液1滴，Fab管中加抗-D(Fab)2滴，对照管中加入0.9％的生理盐水2滴，充分混匀，在37℃水浴中作用30分钟。
(3)将2支试管中的细胞悬液用0.9％生理盐水洗涤3次，最后各加1滴生理盐水，配成2％～5％悬液。
(4)2支试管中各加入待检血清2滴，充分混匀，置于37℃水浴中30分钟。
(5)用0.9％生理盐水洗涤3次，最后1次控干水分，加入抗人球蛋白血清2滴，充分混匀，900～1000g离心15秒，观察是否溶血，轻轻重悬细胞扣，观察凝集反应，记录室 温反应结果。实验结果如表4：
表4.抗-D(Fab)凝集抑制实验结果
上述实验结果表明，被检血清中的抗体被抗-D(Fab)所抑制，说明抗体特异性与抗-D 一致，即被检血清中的抗体就是抗-D。
6.抗体特异性鉴定的结果验证
为进一步证明抗体特异性鉴定(抗-D(Fab)抑制实验)的准确性，结合样本及实验室实际 情况，决定采用上海血液生物医药有限责任公司生产、批号为20191205的谱细胞进行进 一步的抗体鉴定，鉴定方法选用灵敏度较高的标准谱细胞微柱凝胶法。
(1)标记达亚美卡，并将商品化的编号为1-10的谱细胞用已经在室温平衡过的2号稀 释液进行稀释，终浓度为0.8％。
(2)在已经标记好的达亚美卡孔柱中分别加入稀释过且编号为1-10的谱细胞各50μl， 再依次向其中加入受检者血浆25μl。
(3)37℃孵育15分钟。
(4)使用配套的离心机离心10分钟，记录并判读分析结果。实验结果如表5所示：经抗体鉴定，疑似为抗-D。
7.Rh表型的进一步鉴定
取5支小试管，分别标记好抗D、抗C、抗c、抗E、抗e，依次加入抗D、抗C、抗 c、抗E、抗e血清各1滴，再分别加入受检者2％～5％红细胞悬液1滴，轻轻混匀。室温 放置1分钟，900～1000g离心15秒观察结果并记录。
Rh表型鉴定结果如表6：
表6.Rh表型鉴定结果
实验结果显示，该受检者红细胞与抗C、抗c、抗E和抗e血清发生凝集，可以判断 其Rh表型为CcdEe。
本实验室室内质控与室间质评结果显示未发生任何失控问题，且各部分实验的阴性对 照与阳性对照结果无异常。经过比较分析，该受检者同种抗体抗-D，不完全排除血浆中存 在其它抗体。配血方法及步骤严格按照输血医学研究所标准操作规程进行，并最终选取与 患者表型一致的献血者血液进行发血。
实施例2.临床送检配血样本发现抗-E一例
2020年12月5日，接收到辽宁中医药大学附属医院送检交叉配血一例，患者，女，74岁。配血过程中发现该患者抗体筛选阳性，经鉴定疑似为抗-E，鉴定过程如下：
1.样本的接收及预处理
与实施例1相同。
2.受血者ABO、Rh血型鉴定
(1)ABO血型鉴定(试管法)
正定型与反定型的方法与实施例1相同。
(2)Rh血型鉴定(试管法)
另取7只试管，分别标识受血者，Rh(D)阴性和阳性对照，每管分别加入1滴IgM+IgG抗Rh(D)、抗-E、抗-C、抗-e、抗-c血清。向每支试管分别对应加1滴2％～5％受血者红细 胞悬液、Rh(D)阴性和阳性标准红细胞悬液，轻轻混匀。室温放置1分钟后，900～1000g 离心15秒观察结果。
受血者ABO、Rh(D)血型鉴定结果如表7所示：
表7.受血者ABO、Rh(D)血型鉴定结果
结果表明，该受血者为A型血、Rh表型为CcDee。
3.受血者血清抗体筛选(凝胶卡法)
(1)制备I、II、III标准抗体筛查细胞(0.8％)、2号稀释液室温平衡，准备样本并标记 达亚美卡。
(2)三个管中分别加入抗体筛查I、II、III细胞50μl，并加入受检者血浆25μl。37℃孵育15分钟。
(3)使用配套的离心机离心10分钟并判读结果，记录。
实验结果如表8所示。
表8.受血者血清抗体筛选(凝胶卡法)结果
4.进行受血者直接抗人球蛋白试验
(1)将EDTA抗凝的血样用生理盐水配置成2％～5％的红细胞。
(2)向测定管和对照管中分别加入1滴2％～5％的红细胞悬液。
(3)生理盐水洗涤3～4次，最后一次洗涤，完全除去上清液。
(4)立即向测定管中加入抗人球蛋白试剂1滴，向对照管中加入1滴盐水或6％白蛋白， 混匀。900～1000g离心15秒。观察凝集情况，评分并记录结果。
(5)若测定管中未观察到凝集情况，向含有抗球蛋白试剂的试管中加入IgG致敏红细 胞，900～1000g离心15秒，观察并记录结果，确认阴性结果的有效性。
实验结果如图8中抗体筛选红细胞试剂盒抗原格局表所示。
直抗结果为阴性，37℃盐水亦为阴性，抗人球蛋白介质中I、III号细胞呈阳性反应， II号细胞呈阴性反应，揭示被检血清中含有特异性同种不完全抗体。根据被检血清抗体的 血清学行为，而且患者红细胞Rh表型为CcDee，因此该抗体为抗-E的可能性非常大，需做进一步确认。
5.抗体特异性鉴定(抗-E(Fab)凝集抑制实验)
(1)取已知表型为CcDEE的O型红细胞(这种细胞可以是自己用相应的标准血清筛选，也可以从市售的标准谱细胞中挑选，但常用的都是自己根据需要筛选即可。本实验选择E抗原阳性的O型红细胞即可，也可不必关注其他抗原)1滴，用0.9％生理盐水洗涤3 次，配成2％～5％红细胞悬液。
(2)取小试管2支，一支标记为Fab，一支标记为对照。2支试管中各加入上述2％～5％ 红细胞悬液1滴，Fab管中加抗-E(Fab)2滴，对照管中加入0.9％的生理盐水2滴，充分混匀，置于37℃水浴中30分钟。
(3)将2支试管中的细胞悬液用0.9％生理盐水洗涤3次，最后各加1滴生理盐水，配成2％～5％悬液。
(4)2支试管中各加入待检血清2滴，充分混匀，置于37℃水浴中30分钟。
(5)用0.9％生理盐水洗涤3次，最后1次控干水分，加入抗人球蛋白血清2滴，充分混匀，900～1000g离心15秒，观察是否溶血，轻轻重悬细胞扣，观察凝集反应，记录室反 应结果。实验结果如表9所示：
表9.抗-E(Fab)凝集抑制实验结果
上述实验结果表明，被检血清中的抗体被抗-E(Fab)所抑制，说明抗体特异性与抗-E一 致，即被检血清中的抗体就是抗-E。
6.抗体特异性鉴定的结果验证
为进一步确认抗体特异性鉴定结果，结合样本情况及实验室实际，决定采用上海血液 生物医药有限责任公司所产、批号为20201113的谱细胞进行进一步的抗体鉴定，鉴定方 法选用灵敏度较高的标准谱细胞微柱凝胶法。
(1)标记达亚美卡，并将商品化的编号为1-10的谱细胞用已经在室温平衡过的2号稀 释液进行稀释，终浓度为0.8％。
(2)在已经标记好的达亚美卡孔柱中分别加入稀释过且编号为1-10的谱细胞各50μl， 再依次向其中加入受检者血浆25μl。
(3)37℃孵育15分钟。
(4)使用配套的离心机离心10分钟，记录并判读分析结果。
实验结果进一步确认，该患者血清中所含有的抗体为抗-E，见表10。
本实验室室内质控与室间质评结果显示未发生任何失控问题，且各部分实验的阴性对 照与阳性对照结果无异常。经过比较分析，该受检者为抗-E，不完全排除血浆中其他抗体 的存在。配血方法及步骤严格按照输血医学研究所标准操作规程进行，并最终选取与患者 表型一致的献血员进行发血。
实施例3.献血者ABO血型送检发现抗-M一例
2020年12月28日，接收到检验科站内送检ABO血型鉴定一例，检测标本献血码为0080120031492(X-20-986)，经鉴定疑似为抗-M，鉴定过程如下：
1.样本的接收及预处理
(1)实验者审核血标本及送检单，确认标本状态符合要求后接收标本，填写相关记录。
(2)准备实验试剂及器材，检查实验设备是否运转正常。
(3)分离血浆与红细胞：将抗凝血离心、分离。用吸管将受检者血浆吸出，放入已标识清楚的试管中，备用。
(4)受检者实验用红细胞的制备：取抗凝血红细胞2～3滴，用生理盐水洗涤3次后，配成2％～5％红细胞悬液(1体积压积红细胞加16～40体积生理盐水)，备用。
1.ABO血型鉴定(试管法)
正定型：取洁净的试管4支分别标明抗A、抗B、抗AB及抗H，用滴管分别加入抗 A、抗B、抗AB及抗H分型血清各1滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者2％～5％红 细胞悬液1滴，混匀。900～1000g离心15秒，观察结果。
反定型：另取洁净的试管4支分别标明A细胞、B细胞、O细胞以及自身细胞，用滴 管分别向上述已标识的试管中各加入受检者血浆2滴，再以滴管分别相应加入A、B、O 反定型红细胞悬液以及受检者2％～5％红细胞悬液1滴，混匀。900～1000g离心15秒，观 察结果。
2.抗体筛选(盐水法)
(1)取试管4支，分别编号为1、2、3、自身，在这4支试管中各加入2滴受检者血浆，并分别加入1滴筛选细胞I、II、III和自身红细胞，混匀后室温孵育10～15分钟，900～1000g离心15秒，观察是否溶血，轻轻重悬细胞扣，观察凝集反应，记录室温盐水法的结果。
(2)将试管置于37℃水浴30分钟。900～1000g离心15秒，观察是否有溶血和凝集，记录37℃盐水法结果。
3.抗体筛选(凝胶卡法)
(1)制备I、II、III标准抗体筛查细胞(0.8％)、2号稀释液室温平衡，准备样本并标记 达亚美卡。
(2)三个管中分别加入抗体筛查I、II、III细胞50μl，并加入受检者血浆25μl。37℃孵育15分钟。
(3)使用配套的离心机离心10分钟并判读结果，记录，实验结果如表11所示：
表11.抗体筛选(凝胶卡法)结果
注：北京是指北京金豪制药股份有限公司生产的标准血清和红细胞；长春是指长春博德生物技术有限责 任公司生产的标准血清和红细胞。
结果表明，红细胞定型试验与血清定型试验结果不一致，在受检者自身红细胞与自身 血浆无凝集的情况下，受检者血浆与A、B、O反定型红细胞普遍凝集，但A1c与受检者血浆的凝集强度最高，达到3+。且在37℃条件下，受检者血浆与B、O反定型红细胞凝 集强度明显减弱。抗筛阳性，揭示受检者血浆中有ABO系统以外的同种盐水室温抗体存 在。
根据以往经验，盐水室温抗体多为MNSs系统，经进一步检定，受检者红细胞表型为NNSs，因此初步推断此抗体为天然抗-M。
4.抗体特异性鉴定(抗-M(Fab)凝集抑制实验法)
(1)取已知表型为MM的O型红细胞1滴，用0.9％生理盐水洗涤3次，配成2％～5％红细胞悬液。
(2)取小试管2支，一支标记为Fab，一支标记为对照。2支试管中各加入上述2％～5％ 红细胞悬液1滴，Fab管中加抗-M(Fab)2滴，对照管中加入0.9％的生理盐水2滴，充分混匀，在室温中作用15分钟。
(3)将2支试管中的细胞悬液用0.9％生理盐水洗涤3次，最后各加1滴生理盐水，配成2％～5％悬液。
(4)2支试管中各加入待检血清2滴，充分混匀，900～1000g离心15秒，观察是否溶血， 轻轻重悬细胞扣，观察凝集反应，记录室温盐水法的结果。
实验结果如表12所示
表12.抗-M(Fab)凝集抑制实验法结果
上述实验结果表明，被检血清中的抗体被抗-M(Fab)所抑制，说明抗体特异性与抗-M 一致，即被检血清中的抗体就是抗-M。
5.抗体特异性鉴定的结果验证
为进一步证明本实验结果的准确性，结合样本情况及实验室实际，补充采用上海血液 生物医药有限责任公司所产、批号为20201113的谱细胞进行进一步的抗体鉴定，鉴定方 法选用灵敏度较高的微柱凝胶法。
(1)标记达亚美卡，并将商品化的编号为1-10的谱细胞用已经在室温平衡过的2号稀 释液进行稀释，终浓度为0.8％。
(2)在已经标记好的达亚美卡孔柱中分别加入稀释过且编号为1-10的谱细胞各50μl， 再依次向其中加入受检者血浆25μl。
(3)37℃孵育15分钟。
(4)使用配套的离心机离心10分钟，记录并判读分析结果。实验结果如表13所示。
6.MN血型的进一步鉴定
取两支小试管，分别标记为抗M、抗N，依次加入抗M、抗N血清1滴，再分别加入 受检者2％～5％红细胞悬液1滴，轻轻混匀。室温放置1分钟，900～1000g离心15秒观察 结果并记录。
MN血型鉴定结果如表14所示：
表14MN血型鉴定结果
实验结果显示，该受检者红细胞仅与抗N试剂发生凝集，可以判断为NN血型。
受检者血浆存在着与B、O反定型红细胞普遍凝集这一情况，且经鉴定其血浆中存在 着抗-M。因此，实验者决定加做B、O反定型红细胞的MN血型鉴定。实验方法同步骤6.MN血型的进一步鉴定。该部分实验结果显示，B、O反定型红细胞与抗M分型血清能够在试 管法条件下产生凝集。说明B、O反定型红细胞表面存在着M抗原，室温条件下能够与受 检者血浆中存在的抗-M发生反应。本实验室室内质控与室间质评结果显示，未发生任何失 控问题，且各部分实验的阴性对照与阳性对照结果无异常。因此，受检者血浆中同种抗体 的存在，是造成受检者室温条件下正反定型不符的主要原因。
通过各部分实验综合比较分析，受检者为B型，血浆中为抗-M同种抗体，不完全排除血浆中其他抗体的存在。
Claims (11)
1.一种血型不规则抗体特异性鉴定方法，其包括以下步骤：
(a)制备特异性血型抗体Fab段；
(b)鉴定不完全抗体的特异性。
2.根据权利要求1所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(a)进一步包括取特异性血型抗体IgG，例如抗D、抗E、抗c、抗e、抗K，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行处理，制备出所述特异性血型抗体Fab片段；对于部分血型系统的特异性鉴定，还可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶制备IgM的Fab片段，或制备IgG与IgM的Fab片段的混合物。
3.根据权利要求2所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(a)中所述特异性血型抗体IgG可选择自行制备的多克隆抗体或单克隆抗体，或市售的血型试剂。
4.根据权利要求1所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)进一步包括：
(1)发现不规则抗体；
(2)初步推断不规则抗体的特异性的类别；
(3)制备致敏红细胞；
(4)将被检血清与致敏红细胞或相应抗原阳性的红细胞进行反应；
(5)判定结果。
5.根据权利要求4所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)中的子步骤(1)包括在交叉配血、抗体筛检、新生儿溶血病检查及输血反应检查中发现血液中含有所述不规则抗体。
6.根据权利要求4所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)中的子步骤(2)包括根据抗体的血型血清学特点来初步推测抗体特异性的范围；其进一步包括通过检查被检红细胞的相关抗原来推定不规则抗体的特异性。
7.根据权利要求4所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)中的子步骤(3)包括用由子步骤(2)推出的可能性较大的不规则抗体的Fab片段，与已知相应抗原阳性的红细胞共同孵育，在特定的温度、离子强度、pH值的条件下，使之充分致敏；然后洗涤，配成2％～5％的细胞悬液待用。
8.根据权利要求7所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中对于红细胞ccdee表型，其可能性较大的不规则抗体为抗D、抗E与抗C，可以选择抗D(Fab)与D抗原阳性红细胞共同孵育、抗E(Fab)与E抗原阳性红细胞共同孵育或抗C(Fab)与C抗原阳性红细胞共同孵育，以制备所述致敏红细胞。
9.根据权利要求4所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)中的子步骤(4)包括取所述被检血清，相应的所述致敏红细胞2％～5％悬液，分别在2℃～39℃、优选在4℃、22℃、37℃，于盐水、酶介质、聚凝胺介质或抗人球蛋白的介质中反应，同时用所述被检血清与所述相应抗原阳性的红细胞做平行对照实验。
10.根据权利要求4所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法，其中步骤(b)中的子步骤(5)包括：①在所述被检血清与对照细胞出现凝集同时与所述致敏红细胞不出现凝集的情况下，说明红细胞上相应的抗原被Fab封闭，所述被检血清中抗体的特异性与Fab的特异性一致；②在所述被检血清与对照实验出现凝集但与所述致敏红细胞也出现凝集的情况下，有两种可能性：一是所述被检血清的抗体特异性与Fab段特异性不一致；二是所述被检血清中含有2个以上的复合抗体，需要做进一步鉴定，即，用不同特异性的Fab组合分别致敏红细胞，再观察分析结果，做出判断；③在对照实验不出现凝集的情况下，说明实验过程出现差错，实验结果不可靠，需要重新检查各项实验条件，或更换适当的对照红细胞，重新进行实验。
11.一种血型不规则抗体特异性鉴定试剂，其为根据权利要求1所述的血型不规则抗体特异性鉴定方法的步骤(a)中制备的特异性血型抗体Fab段。
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