CN108680756A - 一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不完全抗体检测试剂盒，包括：U型微孔板：其上已包被抗人球蛋白；水性胶层析介质：用于孵育血清或血浆与颗粒性抗原的混合物；颗粒性抗原：与血清或血浆中的不完全抗体反应形成抗原‑抗体复合物。本发明还涉及一种不完全抗体检测方法，通过离心或磁力分离颗粒性抗原‑抗体复合物和游离抗体，代替传统方法中繁琐的洗涤过程。观察结果时，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；如果没有被致敏，则不能被捕获，聚集在底部形成一个小点，呈阴性；介于两者之间的为弱阳性。该方法极大地简化了操作步骤，提高了检测效率，结果易于判读，并且可以同时对大量样本进行检测，易于自动化。

Description

一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，尤其是涉及一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法。

背景技术

不完全抗体是指在盐水介质中虽能与相应的抗原颗粒结合(致敏)，但不能出现肉眼可见的凝集反应的抗体。不完全抗体主要为IgG 类抗体，与红细胞相应抗原结合后(即致敏红细胞)，必须通过特殊的方法，如抗人球蛋白法、聚凝胺法、酶法，才能使致敏红细胞发生凝集反应，从而检出此类抗体。

不完全抗体是造成临床常见迟发性输血反应的主要原因。如果受血者体内存在临床有意义的抗体，就会破坏输入的含有相应抗原的红细胞，发生溶血性输血反应，轻者影响红细胞输注的疗效，重者危及患者生命。如果孕妇体内含有与胎儿红细胞反应的不完全抗体，则会引起新生儿溶血病，产生核黄疸等严重影响新生儿发育的综合征，甚至引起新生儿死亡。因此，在临床常规的抗体筛检、鉴定以及交叉配血中，要求对具有输血史、妊娠史及输用过血液制品的受血者和供血者都应进行不完全抗体检测。临床上保障安全输血，诊断新生儿溶血病、自身免疫性溶血病、药物免疫溶血性疾病等以及血型学研究工作中，对不完全抗体的检测是最重要内容之一。

传统的试管抗人球蛋白试验于1945年被发明，将血清与红细胞混合后并未出现肉眼可见的凝集反应，而当加入抗人球蛋白(二抗) 后，该二抗与致敏红细胞上不完全抗体的Fc段结合，得以搭桥出现凝集反应，即经典的Coombs test。但是，由于试管Coombs test需要用生理盐水离心洗涤至少三次，以避免抗人球被血清中的其他游离免疫球蛋白中和而出现假阴性反应，洗涤过程繁琐且耗时，对操作人员的技术要求较高，所以它不能作为临床输血的常规检测项目，而只是作为确证试验。此后又发展出了一些增强介质，如聚凝胺、聚乙二醇、低离子强度溶液以及酶液等，利用这些介质的技术都可以减少或避免洗涤程序，减少孵育时间，并增强抗原抗体反应，但因为仍存在各种缺点，使其应用受到限制。

90年代发展起来的微柱凝胶试验和固相红细胞吸附试验同样都用于不完全抗体检测。微柱凝胶试验克服了传统试管法的繁琐洗涤过程，也省去了确认阴性结果是否正确的步骤，具有敏感性高、结果易判读、能较长时间保存、样本用量少等优点。凭借这些优势，微柱凝胶试验被广泛应用于血型血清学临床常规检验工作中。但是，当样本中纤维蛋白原含量过高或者白细胞显著增多时，会阻碍红细胞在凝胶中的沉降而呈假阳性。陈旧的红细胞标本中的细胞碎片也会浮于胶中或胶面上呈假阳性。当温度较低时，凝胶颗粒的活动性减少，红细胞较难穿过凝胶，也易出现假阳性结果。此外，原材料凝胶颗粒多为进口，受国外市场的垄断，近年来价格越来越高，间接导致临床检测成本的提高。上述诸多不利因素限制了微柱凝胶试验在临床的进一步广泛应用。而固相红细胞吸附试验中的指示细胞效期较短是影响其临床广泛应用的关键因素。

在抗体检测技术发展过程中，从凝集试验到现在的各种免疫标记技术，如检测颗粒性抗原的ELISA、免疫荧光、流式细胞术等，都没有脱离洗涤过程。洗涤过程操作繁琐费时，在临床应用时受到一定限制。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、指示细胞期效长、不易受样本因素干扰的不完全抗体检测试剂盒及检测方法。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

一种不完全抗体检测试剂盒，包括：U型微孔板：其上已包被抗人球蛋白；水性胶层析介质：用于孵育血清或血浆与颗粒性抗原的混合物；筛查细胞或颗粒性抗原：与血清或血浆中的不完全抗体反应形成抗原-抗体复合物。

进一步地，所述筛查细胞为筛查红细胞。

进一步地，所述抗原-抗体复合物为致敏的红细胞。

进一步地，包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

进一步地，所述颗粒性抗原为血小板和指示颗粒。

进一步地，所述颗粒性抗原为包被有血小板抗体的乳胶微粒或磁性微球。

进一步地，所述包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：在U型微孔板上包被抗人球蛋白：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100 μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

进一步地，所述颗粒性抗原为包被有病原微生物抗原的乳胶微粒或磁性微球。

一种不完全抗体检测方法，包括以下步骤：在U形微孔板上包被抗人球蛋白；在所述U形微孔板中加入水性胶层析介质；加入待检测的血浆或血清；再加入筛查细胞或颗粒性抗原；孵育后离心分离或磁力分离，颗粒性抗原-抗体复合物沉降到微孔板底部，而游离抗体仍留在水性胶上层；观察结果。

进一步地，所述结果有以下三种；通过包被的抗人球蛋白捕获颗粒性抗原-抗体复合物，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；如果颗粒性抗原没有被致敏，则不能被抗人球蛋白捕获，聚集在U型微孔板底部形成一个小点，呈阴性；介于两者之间的为弱阳性。

相比现有技术，本发明将待检血清或血浆与颗粒性抗原的混合液加到水性胶层析介质上孵育，由于使红细胞沉降需要的离心力一般小于100g，而抗体等蛋白质复合物沉降分离需要至少3000g的离心力，所以通过低速离心后，颗粒性抗原-抗体复合物沉降到微孔板底部，而游离抗体仍留在水性胶上层，从而代替传统方法中繁琐的洗涤过程。通过包被的抗人球蛋白捕获颗粒性抗原-抗体复合物，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；如果颗粒性抗原没有被致敏，则不能被抗人球蛋白捕获，聚集在U型微孔板底部形成一个小点，呈阴性；介于两者之间的为弱阳性。该方法极大地简化了操作步骤，提高了检测效率，结果易于判读，并且可以同时对大量样本进行检测，易于自动化。

附图说明

图1为本发明一种不完全抗体检测试剂盒的原理示意图；

图2为本发明一种不完全抗体检测方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参阅图1，本发明涉及一种不完全抗体检测试剂盒，包括：

U型微孔板：其上已包被抗人球蛋白；

水性胶层析介质：用于孵育血清或血浆与颗粒性抗原的混合物；

筛查细胞或颗粒性抗原：与血清或血浆中的不完全抗体反应形成抗原-抗体复合物。

当筛查细胞为筛查红细胞时，抗原-抗体复合物为致敏的红细胞。此时包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

当颗粒性抗原为血小板和指示颗粒(包被有血小板抗体的乳胶微粒或磁性微球)。此时包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL 浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3 次，扣干，4℃保存备用。

当颗粒性抗原为包被有病原微生物抗原的乳胶微粒或磁性微球时，此时包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：用pH9.6， 0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

请继续参阅图2，本发明还涉及一种不完全抗体检测方法，包括以下步骤：在U形微孔板上包被抗人球蛋白；在所述U形微孔板中加入水性胶层析介质；加入待检测的血浆或血清；再加入筛查细胞或颗粒性抗原；孵育后离心分离或磁力分离，颗粒性抗原-抗体复合物沉降到微孔板底部，而游离抗体仍留在水性胶上层；观察结果。

上述结果有以下三种：1.通过包被的抗人球蛋白捕获颗粒性抗原 -抗体复合物，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；2.如果颗粒性抗原没有被致敏，则不能被抗人球蛋白捕获，聚集在U型微孔板底部形成一个小点，呈阴性；3.介于两者之间的为弱阳性。

以下通过实施例一至实施例三分别具体说明：

实施例一：

一种基于水性胶的微孔板红细胞不完全抗体检测方法，具体步骤为：

(1)在U型微孔板上包被抗人球蛋白：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用；

(2)在微孔板中加入200μL水性胶层析介质，然后加入待检血浆或血清，再加入筛检红细胞，37℃孵育30分钟；

(3)进行离心分离，其中离心时的转速为400g，离心时间为6 分钟；

(4)观察结果，红细胞平铺在U型微孔板底部为阳性，聚集在 U型微孔板底部形成一个小点为阴性，介于两者之间的为弱阳性。

同时用传统试管Coombs test做平行对照试验，并比较两种方法检测结果的一致性。

水性胶微孔板不完全抗体检测方法和传统试管法的检测结果一致，敏感性略高于试管法，说明本检测方法是成立的，可以用于检测血浆或血清中的红细胞血型不完全抗体。

实施例二：

一种基于水性胶的微孔板血小板不完全抗体检测方法，具体步骤为：

(1)在U型微孔板上包被抗人球蛋白：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用；

(2)在微孔板中加入200μL水性胶层析介质，然后加入待检血浆或血清，再加入血小板和指示颗粒，即包被有血小板抗体的乳胶微粒或磁性微球，37℃孵育30分钟；

(3)进行离心或磁力分离；

(4)观察结果，指示颗粒平铺在U型微孔板底部为阳性，聚集在U型微孔板底部形成一个小点为阴性，介于两者之间的为弱阳性。

实施例三：

一种基于水性胶的微孔板病原微生物抗体检测方法，具体步骤为：

(1)在U型微孔板上包被抗人球蛋白：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用；

(2)在微孔板中加入200μL水性胶层析介质，然后加入待检血浆或血清，再加入包被有病原微生物抗原的乳胶微粒或磁性微球， 37℃孵育30分钟；

(3)进行离心或磁力分离；

(4)观察结果，指示颗粒平铺在U型微孔板底部为阳性，聚集在U型微孔板底部形成一个小点为阴性，介于两者之间的为弱阳性。

上述不完全抗体检测方法采用的试剂与仪器有：羊抗人球蛋白， pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液，含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液，水性胶层析介质，筛检红细胞/血小板和包被有血小板抗体的乳胶微粒或磁性微球/包被有病原微生物抗原的乳胶微粒或磁性微球，水浴锅，离心机或磁铁。

其中所述水性胶层析介质的组成及其制备方法在专利号为 ZL201310710675.0的发明专利中已经公开，该专利已获得专利权。在以下实施例中所述水性胶层析介质是将5g聚蔗糖和0.1g明胶溶于 100mL的水中得到。

本发明一种不完全抗体检测方法，通过待检血清或血浆与颗粒性抗原的混合液加到水性胶层析介质上孵育，由于使红细胞沉降需要的离心力一般小于100g，而抗体等蛋白质复合物沉降分离需要至少 3000g的离心力，所以通过低速离心后，颗粒性抗原-抗体复合物沉降到微孔板底部，而游离抗体仍留在水性胶上层，从而代替传统方法中繁琐的洗涤过程。通过包被的抗人球蛋白捕获颗粒性抗原-抗体复合物，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；如果颗粒性抗原没有被致敏，则不能被抗人球蛋白捕获，聚集在U型微孔板底部形成一个小点，呈阴性；介于两者之间的为弱阳性。该方法极大地简化了操作步骤，提高了检测效率，结果易于判读，并且可以同时对大量样本进行检测，易于自动化。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：包括

U型微孔板：其上已包被抗人球蛋白；

水性胶层析介质：用于孵育血清或血浆与颗粒性抗原的混合物；

筛查细胞或颗粒性抗原：与血清或血浆中的不完全抗体反应形成抗原-抗体复合物。

2.根据权利要求1所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述筛查细胞为筛查红细胞。

3.根据权利要求2所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗原-抗体复合物为致敏的红细胞。

4.根据权利要求2所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述颗粒性抗原为血小板和指示颗粒。

6.根据权利要求5所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述颗粒性抗原为包被有血小板抗体的乳胶微粒或磁性微球。

7.根据权利要求6所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗人球蛋白U型微孔板的制备包括以下步骤：在U型微孔板上包被抗人球蛋白：用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成15μg/mL浓度，取U型微孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱中过夜包被，次日取出，用含有0.05％吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，扣干，4℃保存备用。

8.根据权利要求1所述的不完全抗体检测试剂盒，其特征在于：所述颗粒性抗原为包被有病原微生物抗原的乳胶微粒或磁性微球。

9.一种不完全抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

在U形微孔板上包被抗人球蛋白；

在所述U形微孔板中加入水性胶层析介质；

加入待检测的血浆或血清；

再加入筛查细胞或颗粒性抗原；

孵育后离心分离或磁力分离，颗粒性抗原-抗体复合物沉降到微孔板底部，而游离抗体仍留在水性胶上层；

观察结果。

10.根据权利要求9所述的不完全抗体检测方法，其特征在于：所述结果有以下三种；

通过包被的抗人球蛋白捕获颗粒性抗原-抗体复合物，如果颗粒性抗原上致敏了不完全抗体，则被抗人球蛋白捕获，平铺在U型微孔板底部，呈阳性；

如果颗粒性抗原没有被致敏，则不能被抗人球蛋白捕获，聚集在U型微孔板底部形成一个小点，呈阴性；

介于两者之间的为弱阳性。