KR100896396B1 - 점착성 미세소포의 제거 방법 - Google Patents
점착성 미세소포의 제거 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100896396B1 KR100896396B1 KR1020077004315A KR20077004315A KR100896396B1 KR 100896396 B1 KR100896396 B1 KR 100896396B1 KR 1020077004315 A KR1020077004315 A KR 1020077004315A KR 20077004315 A KR20077004315 A KR 20077004315A KR 100896396 B1 KR100896396 B1 KR 100896396B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microvesicles
- blood
- derived sample
- circulating
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 title description 11
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 title description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 63
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 29
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims 2
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 claims 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 18
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 18
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- UYNCFCUHRNOSCN-FYYLOGMGSA-N N-[(1R,2R)-1-hydroxy-3-(4-morpholinyl)-1-phenylpropan-2-yl]decanamide Chemical compound C([C@@H](NC(=O)CCCCCCCCC)[C@H](O)C=1C=CC=CC=1)N1CCOCC1 UYNCFCUHRNOSCN-FYYLOGMGSA-N 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylpropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001071312 Homo sapiens Platelet glycoprotein IX Proteins 0.000 description 1
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102100036851 Platelet glycoprotein IX Human genes 0.000 description 1
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins
Abstract
본 발명은 혈액 유래 시료의 알부민 전처리에 의한 인위적 조작에 의해 활성화된 혈소판으로부터 방출되는 미세소포만을 배제하여 혈액 중 미세소포만을 측정하는 방법에 관한 것이다.
점착성 미세소포, 혈액 유래 시료, 알부민
Description
본 발명은 미세소포 측정용 혈액 유래 시료 중에서 발생하는 점착성 미세소포(microvesicle)를, 채혈 전의 혈액 중에 존재하는 순환성 미세소포의 측정에 영향을 주지 않도록 전처리하는 방법 및 순환성 미세소포의 적정한 측정 방법, 및 그의 측정 시약 또는 측정 키트에 관한 것이다.
미세소포는 아테롬 경화증, 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군 등의 혈전 형성시에 활성화된 혈소판으로부터 방출된다. 그러나, 상기 미세소포는, 막 표면의 인지질에 대한 응고 인자가 결합ㆍ농축되는 것에 의한 혈액 응고 촉진 작용, 단구ㆍ혈소판ㆍ혈관 내피 세포의 활성화 작용, 또는 백혈구-혈소판ㆍ백혈구-백혈구ㆍ내피 세포-백혈구의 접착 촉진 작용 등이 알려져 있고, 단순한 혈소판 활성화의 마커가 아니라 혈전 형성, 동맥 경화 진전에 깊이 관여하고 있다고 생각되었다(비특허 문헌 1 참조). 따라서, 혈액 중의 미세소포의 양을 측정하는 것은, 상기질환의 병상을 경시적으로 추정하기 위한 유력한 진단 수법 중 하나로서 중요한 위치를 차지하고 있다. 그러나, 혈소판은 물리적 자극 등에 의해 용이하게 활성화되고, 이에 따라 미세소포도 활성화 후의 혈소판으로부터 방출된다. 예를 들면, 채혈시의 물리적 쇼크나 혈장 또는 혈청의 분리 조작 중에, 혼재하는 혈소판의 활성화 등에 의해 임상 상태를 반영하지 않은 미세소포가 채혈 후의 혈액 유래 시료 중에 증가하는 경우가 있다. 이러한 미세소포는 혈액 유래 시료 중의 미세소포량을 상승시켜, 환자의 병상을 정확하게 판정하는 데에 장해가 된다. 따라서, 채혈 후에 발생하는 미세소포의 영향을 배제하여, 채혈 전의 혈액 중 미세소포를 정확하게 측정하는 방법이 요구되었다.
[비특허 문헌 1] Nomura S. Int. J. Hematol. 74, 397-404, (2001)
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은 상기 채혈 후의 혈액 유래 시료의 제조시에 발생하는 미세소포(점착성 미세소포)에 의한 문제점을 해결하기 위해서, 상기 점착성 미세소포의 제거 방법, 이것을 이용한 혈액 중의 순환성 미세소포의 적정한 측정 방법 및 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 이러한 실정을 감안하여 예의 연구한 결과, BSA(소혈청 알부민)을 대표로 하는 알부민이 채혈 후에 발생하는 미세소포(점착성 미세소포)와 특이적으로 상호 작용하여 면역학적 측정에서의 그의 영향을 배제하고, 채혈 전에 존재한 미세소포(순환성 미세소포)만을 면역학적 수법에 의해 적정하게 측정할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 상술한 성과에 기초하여 완성된 것이고, 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
항 1. 혈액 유래 시료 중에 알부민을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하기 위한 혈액 유래 시료의 전처리 방법.
항 2. 알부민이 BSA인 항 1에 기재된 방법.
항 3. 혈액 유래 시료에 알부민을 첨가하여 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하는 공정, 및 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포를 면역학적으로 측정하는 공정을 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
항 4. 순환성 미세소포에 대한 항체를 미세소포에 특이적인 표면 에피토프에 결합시키고, 그 결과, 결합된 항체 수준을 측정함으로써 순환성 미세소포의 면역학적 측정을 행하는 항 3에 기재된 방법.
항 5. 상기 표면 에피토프가 순환성 미세소포의 당 단백질 상에 있는 항 4에 기재된 방법.
항 6. 상기 표면 당 단백질이 GpIb-IX인 항 5에 기재된 방법.
항 7. 항체의 검출을 항체에 결합된 표지 또는 효소에 기초하여 행하는 것을 특징으로 하는 항 6에 기재된 측정 방법.
항 8. 고정화된 GpIX에 대한 항체에 순환성 미세소포를 결합시킨 후, 상기 미세소포 상의 GpIb를 인식하는 항체를 작용시키는 순서를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 7에 기재된 방법.
항 9. 적어도 알부민, 항-GpIb 표지 항체 및 항-GpIX 항체를 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
항 10. 알부민이 BSA인 항 9에 기재된 키트.
항 11. 항-GpIX 항체를 플레이트에 코팅한 항 9 또는 10에 기재된 키트.
본 명세서에서 환자 혈액 중에 존재하는 미세소포를 「순환성 미세소포」라 부르고, 채혈시 또는 채혈 후에 인위적 조작에 의해 활성화된 혈소판으로부터 방출된 미세소포를 알부민에 대한 친화성 때문에 「점착성 미세소포」라 부른다.
본 발명에서 대상이 되는 혈액 유래 시료란, 혈액 또는 혈액으로부터 제조된 혈액 성분을 포함하는 용액을 가리키고, 혈소판의 제거 조작을 행한 시료가 바람직하다. 구체적으로는 혈장을 들 수 있고, 상기 혈액 분획을 측정상의 관점에서 생리 식염수 또는 완충액 등으로 희석한 용액도 포함한다.
알부민은 인간 또는 인간 이외의 포유 동물 또는 조류 유래 알부민을 가리키고, 인간 이외의 포유 동물로서는, 예를 들면 소, 말, 원숭이, 개, 토끼, 마우스 등을, 조류로서는 닭을 대표예로서 들 수 있다. 특히, 소혈청 알부민(BSA)을 대표예로서 들 수 있고, 이 외에도 인간 혈청 알부민(HSA), 난백 알부민 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, 알부민의 첨가 시기에 대해서는, 측정 전에 혈액 유래 시료에 첨가할 수도 있고, ELISA법을 예로 들면, 플레이트 상에 항체를 고정화시킨 후에 첨가할 수도 있다. 또한, 첨가 형태로서는 특별히 제한은 없지만, 액체 상태로 첨가하는 것이 바람직하고, 미리 생리 식염수 또는 등장 완충액에 용해시킨 후 첨가할 수 있다. 상기 알부민 첨가량으로서는, 최종 농도 5 ％ 이상인 것이 바람직하고, 예를 들면 최종 농도 5 내지 10 ％ 정도가 예시된다. 또한, 첨가 후 점착성 미세소포를 알부민에 흡착시키기 위해서 정치 또는 진탕 처리하는 것이 바람직하고, 처리 시간으로서는 1 시간 이상, 적합하게는 4 시간 이상 알부민 처리를 행하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여, 인위적으로 활성화된 혈소판으로부터 방출된 점착성 미세소포는 알부민과 상호 작용하고, 미세소포 막 표면 항원을 이용한 항체에 의한 면역학적 측정 방법에 대하여, 계밖으로 배제되어 순환성 미세소포의 측정에 실질적으로 영향을 주지 않게 된다.
본래의 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포에 대해서는, 상기 알부민 처리에 의해서는 실질적으로 영향을 주지 않고, 통상적인 미세소포의 특성을 이용한 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.
면역학적 측정 방법으로서는, 미세소포의 막 표면의 항원성 분자(에피토프)에 기초하고, 상기 에피토프에 대한 항체를 이용하여 상기 분자를 정량하는 것에 의해 미세소포를 측정ㆍ정량하는 수법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, ELISA법, RIA법 또는 응집법을 예시할 수 있다.
본 발명에 의한 바람직한 항체로서는, GpIb-GPIX 복합체 및/또는 개개의 당 단백질 GpIb 및 GpIX를 포함하는 당 단백질에 대한 항체를 들 수 있다. 미세소포 상에 볼 수 있는 다른 혈소판 특이적 당 단백질에는 GpIa-IIa , GpIIb-IIIa 및 GpIIIb가 포함된다.
또한, 순환성 미세소포에 결합하는 항체를 그 자체 표지할 수도 있고, 또는 제2 항체, 예를 들면 마우스 모노클로날 항체(제1 항체)에 특이적으로 결합하는 표지된 항-마우스 면역 글로블린을 이용할 수도 있다. 특히, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 불문하지만, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
사용되는 표지는 신호를 발할 수 있는 임의의 성분, 예를 들면 효소(퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제 등), 발색단, 발형광단(FITC 등), 방사성 동위 원소, 착색 입자, 색소, 콜로이드형 금속 등일 수도 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일양태로서 BSA를 이용한 ELISA법을 예로 들어 이하에 상술한다.
상술한 바와 같이 제조한 혈액 유래 성분을, 미리 항-GpIX 항체를 코팅하여 스킴 밀크 등에 의해 블록킹 조작을 행한 96웰 플레이트의 각 웰 상에, 예를 들면 10 내지 150 ㎕ 첨가하고, 이어서 BSA 용액을 최종 농도 5 ％ 이상이 되도록 첨가한다. 그 후, 새롭게 발생한 점착성 미세소포를 BSA에 흡착시키기 위해서, 실온 또는 37 ℃에서 예를 들면 1 시간 이상, 바람직하게는 4 시간 이상 진탕하에 배양한다. 그 후, 세정액, 예를 들면 0.02 내지 0.1 ％ 정도의 트윈(Tween) 20/PBS로 충분히 세정을 행한다. 이어서, 퍼옥시다아제 표지 항-GpIb 항체를 첨가하고, 동일한 세정액으로 충분히 세정 후, 상기 효소에 대한 기질을 첨가하여 발색 조작을 행한다. 이렇게 하여, 순환성 미세소포의 양을 막 표면 에피토프 GpIb-GpIX 복합체에 기초하는 항체를 이용하여, 효소 반응에 의해 발생하는 발색 기질량으로서, 정량하는 것이 가능해진다. 상기 조작을 통해, 인위적 조작에 의해 발생한 점착성 미세소포는 BSA에 포획된 후에는, 상기 일련의 면역 조작을 통해, 사용 항체에는 미반응이 되고, 목적하는 본래 혈액 중에 존재하는 순환성 미세소포만을 측정하는 것이 가능해진다.
또한, 상술한 조작상 사용되는 각종 항체, 시약 등을 포함하는 순환성 미세소포 측정 키트를 제공할 수 있다. 구체적으로는, 인위적 조작에 의해 발생하는 점착성 미세소포를 효율적으로 제거하기 위해서, BSA를 대표로 하는 알부민, 또는 상기 용액, 또한 GpIb 및 GpIX에 대한 항체로 대표되는 미세소포 막 표면 단백질 복합체에 대한 인식 항체(상기 인식 항체는 어느 한쪽 또는 양쪽이 표지화되어 있음), 또한 필요에 따라서 2차 항체, 효소의 기질(표지로서 효소를 사용한 경우) 등이 상기 키트에 포함된다. 예를 들면, 인식 항체가 비오틴 결합 GpIb이면, 상기 측정 키트에는 2차 항체로서 퍼옥시다아제 표지 아비딘을 포함할 수 있다. 또한, 상기 퍼옥시다아제에 대한 기질 등을 포함하는 순환성 미세소포 측정 키트를 제공할 수 있다.
이하의 실시예로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 의해 종래 혈액 처리 조작의 단계에서, 혼재하는 혈소판의 활성화에 의해 방출되는 점착성 미세소포를 알부민으로 전처리함으로써 효율적으로 면역 측정계로부터 제거할 수 있고, 혈액 중에 원래 존재하는 순환성 미세소포를 측정할 수 있는 것으로 판명되었다.
도 1은 인위적으로 활성화시킨 시료, 미세소포의 값이 높은 환자 유래시료 및 정상 시료를 이용한 BSA에 의한 점착성 미세소포의 흡수 시험을 나타낸 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이상의 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 든다. 또한, 이들 실시예는 단순한 예시 목적으로 기재되어 있고, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 방법:
1. 의양성(擬陽性; pseudopositive)(활성화) 시료의 제조
순환성 미세소포(PDMP) 정상값을 나타내는 건강한 정상 성인 남성으로부터 3.8 ％ 시트르산(시트레이트)으로 채혈한 전혈을 4 ℃의 냉장고에 12 시간 보관하여 신생 PDMP(점착성 미세소포)를 생성시켰다. 냉장 전혈(2 ml)을 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하고, 활성화 시료로 하였다. 활성화 시료는 염수로 x2와 x4배로 희석하여 ELISA 측정을 행하였다.
2. 고가(高値) 검체의 제조
PDMP 고가를 나타내는 피험자(성인 남성)로부터 EDTA/ACD(시트르산-덱스트로스 용액) 채혈(2 ml)을 행하고, 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 실온에서 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하였다. 고가 검체는 염수로 x2와 x4배로 희석하여 ELISA 측정을 행하였다.
3. 정상 검체의 제조
PDMP 정상값을 나타내는 건강한 정상 성인 남성으로부터 EDTA/ACD 채혈(2 ml)을 행하고, 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 실온에서 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하여 ELISA 측정을 행하였다.
4. ELISA 측정
미세소포 막 표면에 존재하는 당 단백질 중, 혈소판 특이적인 분자인 CD42b(GpIb)와 CD42a(GpIX)에 대한 항체(항 CD42b 항체; NNKY5-5, 항 CD42a 항체; KMP-9)를 이용한 샌드위치 ELISA 측정계를 제조하였다. 항 CD42a 항체를 코팅한 ELISA용 96웰 마이크로타이터 플레이트(코닝사 제조: MaxiSorb)에 활성화 시료 및 고가 검체 50 ㎕를 첨가 후, 각 시료에 50 ㎕의 PBS 및 2.5 ％, 5 ％, 7.5 ％, 10 ％의 BSA를 첨가하고, 최종 농도 1.25 ％, 2.5 ％, 3.75 ％, 5 ％의 BSA가 첨가된 웰을 제조하였다. 상기 플레이트를 실온에서 진탕하에 4 시간 인큐베이션한 후, 시료를 세정액(0.05 ％ Tween 20/PBS)으로 세정하였다. 비오틴화한 항 CD42b 항체를 첨가하고, 퍼옥시다아제 표지 아비딘으로 발색시켜 450 nm에서의 흡광도를 이뮤노리더(immunoreader)로 측정하였다(도 1).
결과:
의양성을 나타내는 활성화 시료는, 측정시에 웰에 첨가된 BSA 농도 의존적으로 측정값이 저하되고, 그 값은 BSA의 최종 농도가 5 ％일 때 정상 검체에 가깝게까지 내려갔다. 한편, 원래 높은 PDMP값을 나타내는 고가 검체는 BSA의 농도에 관계없이 일정값을 나타내었다. 이들 결과로부터, 채혈 후의 조작에 의해 생기는 신생 PDMP만을, 측정시 최종 농도 5 ％의 BSA를 첨가함으로써 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (11)
- 혈액 유래 시료 중에 알부민을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포(microvesicle)의 영향을 배제하기 위한 혈액 유래 시료의 전처리 방법.
- 제1항에 있어서, 알부민이 BSA인, 혈액 유래 시료의 전처리 방법.
- 혈액 유래 시료에 알부민을 첨가하여 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하는 공정, 및 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포를 면역학적으로 측정하는 공정을 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제3항에 있어서, 순환성 미세소포에 대한 항체를 미세소포에 특이적인 표면 에피토프에 결합시키고, 그 결과 결합된 항체 수준을 측정함으로써 순환성 미세소포의 면역학적 측정을 행하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 표면 에피토프가 순환성 미세소포의 당 단백질 상에 있는 것인, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표면 당 단백질이 GpIb-IX인, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제6항에 있어서, 항체의 검출을 항체에 결합된 표지 또는 효소에 기초하여 행하는 것을 특징으로 하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제7항에 있어서, 고정화된 GpIX에 대한 항체에 순환성 미세소포를 결합시킨 후, 상기 미세소포 상의 GpIb를 인식하는 항체를 작용시키는 순서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 적어도 알부민, 항-GpIb 표지 항체 및 항-GpIX 항체를 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
- 제9항에 있어서, 알부민이 BSA인, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 항-GpIX 항체를 플레이트에 코팅한, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JPJP-P-2004-00217387 | 2004-07-26 | ||
| JP2004217387A JP4029298B2 (ja) | 2004-07-26 | 2004-07-26 | 粘着性マイクロベシクルの除去方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070051284A KR20070051284A (ko) | 2007-05-17 |
| KR100896396B1 true KR100896396B1 (ko) | 2009-05-08 |
Family
ID=35786114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020077004315A KR100896396B1 (ko) | 2004-07-26 | 2005-07-13 | 점착성 미세소포의 제거 방법 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080014570A1 (ko) |
| EP (1) | EP1780543A4 (ko) |
| JP (1) | JP4029298B2 (ko) |
| KR (1) | KR100896396B1 (ko) |
| CN (1) | CN1989412A (ko) |
| AR (1) | AR054974A1 (ko) |
| CA (1) | CA2573311A1 (ko) |
| TW (1) | TW200606429A (ko) |
| WO (1) | WO2006011363A1 (ko) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2644855C (en) * | 2006-03-09 | 2019-11-19 | Aethlon Medical, Inc. | Extracorporeal removal of microvesicular particles |
| WO2010134567A1 (ja) * | 2009-05-22 | 2010-11-25 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 血中遊離核酸の検出方法 |
| JP6210004B2 (ja) * | 2013-04-09 | 2017-10-11 | 株式会社Ｊｖｃケンウッド | 試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法 |
| JP6210009B2 (ja) * | 2013-09-30 | 2017-10-11 | 株式会社Ｊｖｃケンウッド | 試料分析用基板及び基板分析装置 |
| JP6201856B2 (ja) * | 2013-11-29 | 2017-09-27 | 株式会社Ｊｖｃケンウッド | 分析用基板及び分析用基板の製造方法 |
| CN111386122A (zh) * | 2017-09-20 | 2020-07-07 | 分子听诊器公司 | 用于检测组织状况的方法和系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19990007857A (ko) * | 1995-04-19 | 1999-01-25 | 프란시스 제이. 메이어 | 혈소판의 미생물 정화방법 |
| KR20040021768A (ko) * | 2002-09-04 | 2004-03-11 | 바디텍메드 주식회사 | 면역분석법을 이용한 혈청 효소의 정량적 측정방법 및 이방법을 이용한 간질환 검사방법 |
| KR20040065208A (ko) * | 2001-08-09 | 2004-07-21 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 진핵 세포 및 세포 보존 방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2187616A1 (en) * | 1994-04-15 | 1995-10-26 | Hoechst Celanese Corporation | Biocompatible coated article |
| US6391575B1 (en) * | 1999-03-05 | 2002-05-21 | Idun Pharmaceuticals, Inc. | Methods for detecting membrane derived caspase activity and modulators thereof |
| FR2809181B1 (fr) * | 2000-05-16 | 2002-10-25 | Biocytex | Monoreactif pour le dosage des microparticules plaquettaires |
| WO2005110494A2 (en) * | 2004-05-04 | 2005-11-24 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for the inhibition of thrombus formation |
-
2004
- 2004-07-26 JP JP2004217387A patent/JP4029298B2/ja active Active
-
2005
- 2005-07-13 CA CA002573311A patent/CA2573311A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-13 EP EP05765777A patent/EP1780543A4/en not_active Withdrawn
- 2005-07-13 CN CNA2005800253451A patent/CN1989412A/zh active Pending
- 2005-07-13 US US11/632,946 patent/US20080014570A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-13 WO PCT/JP2005/012932 patent/WO2006011363A1/ja active Application Filing
- 2005-07-13 KR KR1020077004315A patent/KR100896396B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-07-20 TW TW094124488A patent/TW200606429A/zh unknown
- 2005-07-26 AR ARP050103083A patent/AR054974A1/es unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19990007857A (ko) * | 1995-04-19 | 1999-01-25 | 프란시스 제이. 메이어 | 혈소판의 미생물 정화방법 |
| KR20040065208A (ko) * | 2001-08-09 | 2004-07-21 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 진핵 세포 및 세포 보존 방법 |
| KR20040021768A (ko) * | 2002-09-04 | 2004-03-11 | 바디텍메드 주식회사 | 면역분석법을 이용한 혈청 효소의 정량적 측정방법 및 이방법을 이용한 간질환 검사방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006038567A (ja) | 2006-02-09 |
| CN1989412A (zh) | 2007-06-27 |
| TW200606429A (en) | 2006-02-16 |
| CA2573311A1 (en) | 2006-02-02 |
| EP1780543A1 (en) | 2007-05-02 |
| AR054974A1 (es) | 2007-08-01 |
| EP1780543A4 (en) | 2007-11-28 |
| JP4029298B2 (ja) | 2008-01-09 |
| US20080014570A1 (en) | 2008-01-17 |
| KR20070051284A (ko) | 2007-05-17 |
| WO2006011363A1 (ja) | 2006-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5768371B2 (ja) | 血液試料の複数分析 | |
| Verloo et al. | Comparison of serological tests for Trypanosoma evansi natural infections in water buffaloes from north Vietnam | |
| CN103620409B (zh) | 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂 | |
| JP3022930B2 (ja) | 移植片受容の改良された評価 | |
| KR100896396B1 (ko) | 점착성 미세소포의 제거 방법 | |
| JP3887340B2 (ja) | ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液及びウイルス検出試薬 | |
| EP0311492B1 (fr) | Trousse et méthode de dosage immunométrique applicables à des cellules entières | |
| JPH08509806A (ja) | 方法およびアッセイ | |
| JP4464048B2 (ja) | 血液細胞抗原および該抗原に対して指向される抗体の検出方法 | |
| JP2004504818A (ja) | 末梢血液からの胎児細胞の温和な高富化およびその使用 | |
| JP3186831B2 (ja) | 血液型試薬としての凝集複合体 | |
| TWI387751B (zh) | 用於ＲｈＤ血型檢驗之套組及使用該套組以檢驗ＲｈＤ血型之方法 | |
| WO1986005591A1 (fr) | Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon | |
| US9658227B2 (en) | Recombinant GRA antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis | |
| CA1149737A (en) | S-alkylated igg antibody for immunoassay | |
| JPH11502307A (ja) | 競合的結合アッセイ | |
| NL2016301B1 (en) | Method for detecting a marker for active tuberculosis. | |
| JPH05346428A (ja) | 顆粒球の迅速なカウントのためのキット及び前記キットを使用する方法 | |
| US20130203085A1 (en) | Antigenic structure and uses thereof for screening trypanosomiases in humans and animals | |
| EP1635691A4 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN THE DIAGNOSIS AND CHARACTERIZATION OF DISEASES INVOLVING ABNORMAL APOPTOSIS | |
| JP3936678B2 (ja) | 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 | |
| JP2002168865A (ja) | 全身性エリテマトーデスの診断用試薬、診断用キット及び全身性エリテマトーデス由来の免疫グロブリンｇの存在確認方法 | |
| JPH09145714A (ja) | 血球付着性抗原の測定方法 | |
| JP2005214840A (ja) | 全身性炎症反応症候群患者における臓器障害の発症又は予後の予測方法及び予測用試薬 | |
| JPH08233819A (ja) | 感作標識担体、抗原又は抗体の検出方法及び検出用検査セット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |