JPH09145714A - 血球付着性抗原の測定方法 - Google Patents
血球付着性抗原の測定方法Info
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- JPH09145714A JPH09145714A JP10635396A JP10635396A JPH09145714A JP H09145714 A JPH09145714 A JP H09145714A JP 10635396 A JP10635396 A JP 10635396A JP 10635396 A JP10635396 A JP 10635396A JP H09145714 A JPH09145714 A JP H09145714A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌疾患において出現し、血液中に見出される
抗原をより高感度に測定することができる方法を提供す
ること。 【解決手段】 癌疾患において出現し、血球表面上に付
着する抗原と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応を
利用した免疫測定により前記抗原を測定することから成
る血球付着性抗原の測定方法を提供した。
抗原をより高感度に測定することができる方法を提供す
ること。 【解決手段】 癌疾患において出現し、血球表面上に付
着する抗原と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応を
利用した免疫測定により前記抗原を測定することから成
る血球付着性抗原の測定方法を提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血球付着性抗原の
測定方法に関する。
測定方法に関する。
【０００２】ハンガナッツゥ−ダイヘル（Hanganutziu-
Deicher)抗原（以下、「ＨＤ抗原」と言うことがある）
は、動物の組織や血液中に存在するが、ヒト及びニワト
リの正常組織や正常血液中には存在しない。しかしなが
ら、癌患者の組織や血清中に見出される。従って、ＨＤ
抗原に対する抗体（以下、「抗ＨＤ抗体」ということが
ある）を用いて血清中のＨＤ抗原を測定することにより
癌の診断を行うことが提案されている（特開平７−５３
５９９号公報）。
Deicher)抗原（以下、「ＨＤ抗原」と言うことがある）
は、動物の組織や血液中に存在するが、ヒト及びニワト
リの正常組織や正常血液中には存在しない。しかしなが
ら、癌患者の組織や血清中に見出される。従って、ＨＤ
抗原に対する抗体（以下、「抗ＨＤ抗体」ということが
ある）を用いて血清中のＨＤ抗原を測定することにより
癌の診断を行うことが提案されている（特開平７−５３
５９９号公報）。
【０００３】しかしながら、抗ＨＤ抗体を用いた通常の
サンドイッチＥＬＩＳＡにより癌患者の血清中のＨＤ抗
原を測定すると、ＨＤ抗原は血清中に存在しているはず
であるにもかかわらず、陽性になるのは癌患者１０人中
２人位であり、癌診断の感度が低かった。
サンドイッチＥＬＩＳＡにより癌患者の血清中のＨＤ抗
原を測定すると、ＨＤ抗原は血清中に存在しているはず
であるにもかかわらず、陽性になるのは癌患者１０人中
２人位であり、癌診断の感度が低かった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、癌疾患において出現し、血液中に見出される抗原を
より高感度に測定することができる方法を提供すること
である。
は、癌疾患において出現し、血液中に見出される抗原を
より高感度に測定することができる方法を提供すること
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、癌患者
の血清中のＨＤ抗原が、サンドイッチＥＬＩＳＡによっ
ては高感度に測定できない原因を鋭意研究した結果、Ｈ
Ｄ抗原が赤血球等の血球の表面上に付着し、その結果、
ＨＤ抗原の濃度が赤血球表面に付着しきれない程度に高
くない限り血清中で遊離の状態では存在しないことが原
因であることを見出した。本願発明者らはさらに、血球
表面上に付着した抗原を該抗原に対する抗体を用いた免
疫測定により測定する方法を開発し、本発明を完成し
た。
の血清中のＨＤ抗原が、サンドイッチＥＬＩＳＡによっ
ては高感度に測定できない原因を鋭意研究した結果、Ｈ
Ｄ抗原が赤血球等の血球の表面上に付着し、その結果、
ＨＤ抗原の濃度が赤血球表面に付着しきれない程度に高
くない限り血清中で遊離の状態では存在しないことが原
因であることを見出した。本願発明者らはさらに、血球
表面上に付着した抗原を該抗原に対する抗体を用いた免
疫測定により測定する方法を開発し、本発明を完成し
た。
【０００６】すなわち、本発明は、癌疾患において出現
し、血球表面上に付着する抗原と、該抗原に対する抗体
との抗原抗体反応を利用した免疫測定により前記抗原を
測定することから成る血球付着性抗原の測定方法を提供
する。なお、測定すべき抗原が血球表面に付着して存在
する場合があるということは本願発明者らが見出した新
知見であるので、上記本発明の目的自身も新規性がある
ものである。
し、血球表面上に付着する抗原と、該抗原に対する抗体
との抗原抗体反応を利用した免疫測定により前記抗原を
測定することから成る血球付着性抗原の測定方法を提供
する。なお、測定すべき抗原が血球表面に付着して存在
する場合があるということは本願発明者らが見出した新
知見であるので、上記本発明の目的自身も新規性がある
ものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、血液中に存在し、血球
に付着性を持つ抗原の測定方法を初めて提供したもので
ある。従って、本明細書において、「血球の表面に付着
した抗原」とは、本来血液中に遊離の形態で存在する抗
原が血球と接触することにより血球表面に付着した抗原
を意味する。
に付着性を持つ抗原の測定方法を初めて提供したもので
ある。従って、本明細書において、「血球の表面に付着
した抗原」とは、本来血液中に遊離の形態で存在する抗
原が血球と接触することにより血球表面に付着した抗原
を意味する。
【０００８】本明細書において、「測定」とは、定性的
な検出及び定量の両者を包含する。
な検出及び定量の両者を包含する。
【０００９】本発明の方法では、血球の表面に付着した
抗原と、該抗原に対する抗体を抗原抗体反応させる。こ
こで、抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロ
ーナル抗体であってもよい。また、抗体の起源も何ら限
定されるものではなく、ヒト抗体、マウス抗体のような
各種哺乳動物抗体及びニワトリ抗体のような鳥類の抗体
であってもよく、また、これらの混合物であってもよ
い。なお、該抗原に対する抗体溶液は、非特異的反応を
抑えるために、健常人血球により吸収操作を施し反応に
使用することもできる。
抗原と、該抗原に対する抗体を抗原抗体反応させる。こ
こで、抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロ
ーナル抗体であってもよい。また、抗体の起源も何ら限
定されるものではなく、ヒト抗体、マウス抗体のような
各種哺乳動物抗体及びニワトリ抗体のような鳥類の抗体
であってもよく、また、これらの混合物であってもよ
い。なお、該抗原に対する抗体溶液は、非特異的反応を
抑えるために、健常人血球により吸収操作を施し反応に
使用することもできる。
【００１０】本発明の方法では、上記抗原抗体反応を利
用して免疫測定を行う。免疫測定は種々の方法により行
うことができる。本発明の好ましい１態様では、血球の
凝集を測定する。すなわち、本願発明者らは、血球の表
面に付着した抗原と該抗原に対する抗体とを反応させる
ことにより血球が架橋されて凝集することを見出した。
従って、この血球凝集を測定することにより、血球表面
に付着した抗原を測定することができる。以下、この方
法についてさらに説明する。
用して免疫測定を行う。免疫測定は種々の方法により行
うことができる。本発明の好ましい１態様では、血球の
凝集を測定する。すなわち、本願発明者らは、血球の表
面に付着した抗原と該抗原に対する抗体とを反応させる
ことにより血球が架橋されて凝集することを見出した。
従って、この血球凝集を測定することにより、血球表面
に付着した抗原を測定することができる。以下、この方
法についてさらに説明する。
【００１１】(1) 先ず、被験者の血液を採血する。採血
は、ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤の存在
下で行うことが望ましい。また、必要に応じアルセバー
溶液等の保存液を添加し、４℃にて保存することもでき
る。
は、ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤の存在
下で行うことが望ましい。また、必要に応じアルセバー
溶液等の保存液を添加し、４℃にて保存することもでき
る。
【００１２】(2) 血液は、生理食塩水或はリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）等で数回洗浄し、最終的に０．３〜
７％の血球濃度となるように生理食塩水等で懸濁する。
理食塩水（ＰＢＳ）等で数回洗浄し、最終的に０．３〜
７％の血球濃度となるように生理食塩水等で懸濁する。
【００１３】(3) 測定すべき抗原と抗原抗体反応を行う
抗体（一次抗体）溶液を試験管に入れ、これに上記血球
懸濁液を加える。抗体溶液の濃度は特に限定されない
が、通常１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度が望ましい。
溶媒としては、ＰＢＳやトリス緩衝生理食塩水等の緩衝
生理食塩水を用いることができる。また、低イオン強度
溶液、ウシアルブミン、ポリエチレングリコール等の凝
集反応増強剤を添加しておいてもよい。血球懸濁液と抗
体溶液との混合比率も特に限定されないが、血球濃度及
び抗体濃度が上記の範囲内にある場合には、等量程度の
比率で混合すればよい。
抗体（一次抗体）溶液を試験管に入れ、これに上記血球
懸濁液を加える。抗体溶液の濃度は特に限定されない
が、通常１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度が望ましい。
溶媒としては、ＰＢＳやトリス緩衝生理食塩水等の緩衝
生理食塩水を用いることができる。また、低イオン強度
溶液、ウシアルブミン、ポリエチレングリコール等の凝
集反応増強剤を添加しておいてもよい。血球懸濁液と抗
体溶液との混合比率も特に限定されないが、血球濃度及
び抗体濃度が上記の範囲内にある場合には、等量程度の
比率で混合すればよい。
【００１４】(4) 次いで、得られた混合液を静置する。
静置は、特に限定されないが、０℃〜３７℃の温度下で
５分〜１時間程度行うことが望ましい。また、定性的な
検出の場合には、静置後、混合液を軽く遠心（１０００
ｒｐｍ１分又は３４００ｒｐｍ１５秒間）し凝集の有無
を観察する。
静置は、特に限定されないが、０℃〜３７℃の温度下で
５分〜１時間程度行うことが望ましい。また、定性的な
検出の場合には、静置後、混合液を軽く遠心（１０００
ｒｐｍ１分又は３４００ｒｐｍ１５秒間）し凝集の有無
を観察する。
【００１５】(5) 上記の段階で凝集が認められない場合
は、血球をＰＢＳ等で３〜４回洗浄後、二次抗体（抗Ｉ
ｇＧ抗体）溶液（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度、抗
血清の場合は１／１０〜５／１０希釈）を添加後マイク
ロタイタープレートに移し、凝集の有無を判定すること
により、抗原の検出を行うことができる。凝集が起きて
いれば検体血液中に抗原が存在し、起きていなければ存
在しない（検出限界未満）。尚プレート上での観察の際
には、二次抗体と共に０．０５〜１％程度のアラビアゴ
ムを添加し感度を高めることもできる。さらに試験管で
の観察の際には、遠心後検体を軽くゆすり凝集塊の有無
を観察する。二次抗体は、一次抗体に対する抗体であれ
ば起源は限定されない。
は、血球をＰＢＳ等で３〜４回洗浄後、二次抗体（抗Ｉ
ｇＧ抗体）溶液（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度、抗
血清の場合は１／１０〜５／１０希釈）を添加後マイク
ロタイタープレートに移し、凝集の有無を判定すること
により、抗原の検出を行うことができる。凝集が起きて
いれば検体血液中に抗原が存在し、起きていなければ存
在しない（検出限界未満）。尚プレート上での観察の際
には、二次抗体と共に０．０５〜１％程度のアラビアゴ
ムを添加し感度を高めることもできる。さらに試験管で
の観察の際には、遠心後検体を軽くゆすり凝集塊の有無
を観察する。二次抗体は、一次抗体に対する抗体であれ
ば起源は限定されない。
【００１６】別の好ましい態様では、測定すべき抗原を
マイクロタイタープレートのウェル表面上に固定化後、
カゼイン、ウシ血清アルブミン等でブロッキングを行
い、これに一次抗体溶液、被検血球懸濁液を加え、混合
溶液を静置（０〜３７℃の温度下で５分〜１時間程度）
した後、プレートの各ウェルを１〜４回洗浄する。これ
にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加
し反応（０℃〜３７℃の温度下で５分〜１時間程度静
置）させ、１〜４回洗浄後、使用した酵素の基質を添加
し反応させ、溶液の吸光度を測定することにより抗原の
定量を行うことができる（競合法）。
マイクロタイタープレートのウェル表面上に固定化後、
カゼイン、ウシ血清アルブミン等でブロッキングを行
い、これに一次抗体溶液、被検血球懸濁液を加え、混合
溶液を静置（０〜３７℃の温度下で５分〜１時間程度）
した後、プレートの各ウェルを１〜４回洗浄する。これ
にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加
し反応（０℃〜３７℃の温度下で５分〜１時間程度静
置）させ、１〜４回洗浄後、使用した酵素の基質を添加
し反応させ、溶液の吸光度を測定することにより抗原の
定量を行うことができる（競合法）。
【００１７】また、別の好ましい態様では、(3) に記載
した一次抗体による抗原抗体反応後の血球をウシ血清ア
ルブミン（０．１％）を含むＰＢＳで１〜４回洗浄し、
アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体
を添加し反応（０℃〜３７℃の温度下で５分〜１時間程
度静置）させ、血球を１〜４回洗浄後、使用した酵素の
基質液を添加し反応させる。遠心後、上清の吸光度を測
定することにより抗原の定量を行うことができる（非競
合法）。
した一次抗体による抗原抗体反応後の血球をウシ血清ア
ルブミン（０．１％）を含むＰＢＳで１〜４回洗浄し、
アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体
を添加し反応（０℃〜３７℃の温度下で５分〜１時間程
度静置）させ、血球を１〜４回洗浄後、使用した酵素の
基質液を添加し反応させる。遠心後、上清の吸光度を測
定することにより抗原の定量を行うことができる（非競
合法）。
【００１８】上記の方法の他にも、種々の方法により免
疫測定を行うことができる。例えば、蛍光標識した二次
抗体を使用し、フローサイトメーターで蛍光を帯びた血
球を測定することにより目的の抗原を測定することがで
きる。また、抗体をラテックス粒子に不動化し、これを
血球と反応させ、抗原抗体反応により凝集を起こさせる
ラテックス凝集法を用いることもできる。さらには、血
球をホモジナイズまたはプレート上に固定化させてから
溶血させ、常法により放射免疫測定、酵素免疫測定、蛍
光免疫測定或は化学発光を用いた免疫測定法により抗原
を測定することができる。これらの方法はこの分野にお
いて周知である。
疫測定を行うことができる。例えば、蛍光標識した二次
抗体を使用し、フローサイトメーターで蛍光を帯びた血
球を測定することにより目的の抗原を測定することがで
きる。また、抗体をラテックス粒子に不動化し、これを
血球と反応させ、抗原抗体反応により凝集を起こさせる
ラテックス凝集法を用いることもできる。さらには、血
球をホモジナイズまたはプレート上に固定化させてから
溶血させ、常法により放射免疫測定、酵素免疫測定、蛍
光免疫測定或は化学発光を用いた免疫測定法により抗原
を測定することができる。これらの方法はこの分野にお
いて周知である。
【００１９】
【実施例】以下本発明を実施例に基づきさらに具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２０】実施例１ 感作血球による凝集 健常人血液を抗凝固剤（ヘパリン）の存在下に採血し、
血球を分離後生理食塩水で３回洗浄し、血球にＨＤ抗原
を添加し、終濃度でＨＤ抗原が０〜１００μｇ／ｍｌ、
血球が５０％となるよう調製した後、３７℃２時間イン
キュベートした。遠心後、上清を除去し生理食塩水で３
回洗浄し、５％血球懸濁液を調製した。２０μｌの１ｍ
ｇ／ｍｌの抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル抗体（特開平
７−５３５９９号、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８５として寄託）または、健常人
血球で吸収処理操作（洗浄した健常人血球が１％終濃度
となるように抗体溶液を添加し、室温１５分放置後遠心
分離し抗体溶液を回収）を施した０．１ｍｇ／ｍｌのト
リポリクローナル抗体（Molecular Immunology, 23, 63
1, 1986)に従って作製）を含む試験管に、先の血球懸濁
液２０μｌを添加し、さらに２７μｌのオーソ社製エン
ハンスメントソリューションを添加混合後、３７℃にて
１０分間静置した。遠心して上清を除去し、ＰＢＳにて
３回洗浄した後、沈殿に２５μｌのオーソ社製抗ヒトＩ
ｇＧ血清または、１００μｇ／ｍｌの抗トリＩｇＧ抗体
（ＺＹＭＥＤ社）を添加し、１２．５μｌの０．２％ア
ラビアゴムを含むオリンパス製円形劇場型プレートに等
量添加混合、室温にて１時間放置後、凝集を観察した。
血球を分離後生理食塩水で３回洗浄し、血球にＨＤ抗原
を添加し、終濃度でＨＤ抗原が０〜１００μｇ／ｍｌ、
血球が５０％となるよう調製した後、３７℃２時間イン
キュベートした。遠心後、上清を除去し生理食塩水で３
回洗浄し、５％血球懸濁液を調製した。２０μｌの１ｍ
ｇ／ｍｌの抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル抗体（特開平
７−５３５９９号、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８５として寄託）または、健常人
血球で吸収処理操作（洗浄した健常人血球が１％終濃度
となるように抗体溶液を添加し、室温１５分放置後遠心
分離し抗体溶液を回収）を施した０．１ｍｇ／ｍｌのト
リポリクローナル抗体（Molecular Immunology, 23, 63
1, 1986)に従って作製）を含む試験管に、先の血球懸濁
液２０μｌを添加し、さらに２７μｌのオーソ社製エン
ハンスメントソリューションを添加混合後、３７℃にて
１０分間静置した。遠心して上清を除去し、ＰＢＳにて
３回洗浄した後、沈殿に２５μｌのオーソ社製抗ヒトＩ
ｇＧ血清または、１００μｇ／ｍｌの抗トリＩｇＧ抗体
（ＺＹＭＥＤ社）を添加し、１２．５μｌの０．２％ア
ラビアゴムを含むオリンパス製円形劇場型プレートに等
量添加混合、室温にて１時間放置後、凝集を観察した。
【００２１】以下に示すように、感作させたＨＤ抗原量
に応じて凝集が強くなることを確認した。
に応じて凝集が強くなることを確認した。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例２ フローサイトメーターによる血
球表面上ＨＤ抗原の検出 洗浄した健常人血球にＨＤ抗原を終濃度１００μｇ／ｍ
ｌとなるように添加し、３７℃２時間放置後、洗浄した
ＨＤ感作血球、ＨＤ抗原をもともと有するウマ血球及び
陰性対照として健常人血球を各々リンフォセパールII
（免疫生物研究所社製）にて分別後、試験管当たり１０
6 個の血球となるように分注し、ＰＢＳで３回洗浄し
た。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを添加後、０
℃１０分間放置し、５０μｌの５０μｇ／ｍｌのトリ抗
ＨＤポリクローナル抗体を添加し、０℃３０分放置後Ｐ
ＢＳで３回洗浄した。次に各試験管に５０μｌの５０μ
ｇ／ｍｌの蛍光標識抗トリＩｇＧ抗体を添加後、０℃３
０分放置、ＰＢＳで３回洗浄した。各抗体の希釈には、
５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い
た。これに１ｍｌの２％フォルマリン／ＰＢＳを添加
し、フローサイトメーターにて測定した。図１ないし図
３に示す様に、ＨＤ感作血球及びウマ血球にてＨＤ陽性
血球が認められた。
球表面上ＨＤ抗原の検出 洗浄した健常人血球にＨＤ抗原を終濃度１００μｇ／ｍ
ｌとなるように添加し、３７℃２時間放置後、洗浄した
ＨＤ感作血球、ＨＤ抗原をもともと有するウマ血球及び
陰性対照として健常人血球を各々リンフォセパールII
（免疫生物研究所社製）にて分別後、試験管当たり１０
6 個の血球となるように分注し、ＰＢＳで３回洗浄し
た。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを添加後、０
℃１０分間放置し、５０μｌの５０μｇ／ｍｌのトリ抗
ＨＤポリクローナル抗体を添加し、０℃３０分放置後Ｐ
ＢＳで３回洗浄した。次に各試験管に５０μｌの５０μ
ｇ／ｍｌの蛍光標識抗トリＩｇＧ抗体を添加後、０℃３
０分放置、ＰＢＳで３回洗浄した。各抗体の希釈には、
５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い
た。これに１ｍｌの２％フォルマリン／ＰＢＳを添加
し、フローサイトメーターにて測定した。図１ないし図
３に示す様に、ＨＤ感作血球及びウマ血球にてＨＤ陽性
血球が認められた。
【００２４】実施例３ 血球からのＨＤ抽出 実施例１と同様に調製した１０μｇ／ｍｌＨＤ感作血
球、ウマ血球、健常人血球並びに癌患者血球から以下の
ように糖脂質を粗抽出した。各洗浄血球または血清にク
ロロホルム：メタノール（２：１）を添加し、４０℃３
０分放置後濾過し、Ｎ2 雰囲気下で蒸発乾固し、アセト
ン、冷ジエチルエーテルで洗浄後、沈殿にピリジンを添
加、７０℃３０分放置後、遠心（３０００ｒｐｍ、１５
分）し上澄みを回収、ピリジンを蒸発させ、沈殿をＰＢ
Ｓに溶解し、ニトロセルロースフィルターにスポットし
た。フィルターを１０％スキムミルク溶液中でブロッキ
ングさせた後、２０μｇ／ｍｌのトリ抗ＨＤポリクロー
ナル抗体を反応させた。０．０５％ツイーン２０（商品
名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、パーオキシダ
ーゼ標識抗トリＩｇＧ抗体を反応させＰＢＳにて洗浄
後、化学発光法（アマシャム社製ＥＣＬキット）で発光
させＸ線フィルムに感光させた。以下のように癌患者血
球由来の抽出物にもＨＤが含まれていることが確認され
た。
球、ウマ血球、健常人血球並びに癌患者血球から以下の
ように糖脂質を粗抽出した。各洗浄血球または血清にク
ロロホルム：メタノール（２：１）を添加し、４０℃３
０分放置後濾過し、Ｎ2 雰囲気下で蒸発乾固し、アセト
ン、冷ジエチルエーテルで洗浄後、沈殿にピリジンを添
加、７０℃３０分放置後、遠心（３０００ｒｐｍ、１５
分）し上澄みを回収、ピリジンを蒸発させ、沈殿をＰＢ
Ｓに溶解し、ニトロセルロースフィルターにスポットし
た。フィルターを１０％スキムミルク溶液中でブロッキ
ングさせた後、２０μｇ／ｍｌのトリ抗ＨＤポリクロー
ナル抗体を反応させた。０．０５％ツイーン２０（商品
名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、パーオキシダ
ーゼ標識抗トリＩｇＧ抗体を反応させＰＢＳにて洗浄
後、化学発光法（アマシャム社製ＥＣＬキット）で発光
させＸ線フィルムに感光させた。以下のように癌患者血
球由来の抽出物にもＨＤが含まれていることが確認され
た。
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例４ 抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル
抗体を用いた患者血球の凝集 生理食塩水で洗浄した血球から終濃度５％の血球懸濁液
を調製し、２０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗ＨＤ抗原ヒトモノ
クローナル抗体を含む試験管に等量添加し、２７μｇ／
ｍｌのオーソ社製低イオン強度メディウム（オーソエン
ハンスメントソリューション）を添加し、３７℃で１０
分間放置、遠心し上清を除いた後、血球を生理食塩水に
て３回洗浄した。沈殿させた血球を２５μｌの抗ヒトＩ
ｇＧ血清（オーソ社製）に懸濁し、予め１２．５μｌの
０．２％アラビアゴム生理食塩水を含むマイクロタイタ
ープレート（オリンパス社製Ｐ３、円形劇場型）に等量
添加し、室温に１時間放置後、凝集の有無を判定した。
以下に検体当たりの凝集陽性者数を示す。
抗体を用いた患者血球の凝集 生理食塩水で洗浄した血球から終濃度５％の血球懸濁液
を調製し、２０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗ＨＤ抗原ヒトモノ
クローナル抗体を含む試験管に等量添加し、２７μｇ／
ｍｌのオーソ社製低イオン強度メディウム（オーソエン
ハンスメントソリューション）を添加し、３７℃で１０
分間放置、遠心し上清を除いた後、血球を生理食塩水に
て３回洗浄した。沈殿させた血球を２５μｌの抗ヒトＩ
ｇＧ血清（オーソ社製）に懸濁し、予め１２．５μｌの
０．２％アラビアゴム生理食塩水を含むマイクロタイタ
ープレート（オリンパス社製Ｐ３、円形劇場型）に等量
添加し、室温に１時間放置後、凝集の有無を判定した。
以下に検体当たりの凝集陽性者数を示す。
【００２７】
【表３】
【００２８】実施例５ 血球表面上ＨＤ抗原の競合法に
よる測定 (1) 検量線の作製 ９６穴ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno
Plate PolySorp) に１０μｇ／ｍｌＨＤ抗原メタノール
溶液を５０μｌ／well加え室温、常圧で乾固した。次に
４倍希釈のブロックＡ（雪印製）を３００μｌ／well加
え３０℃２時間放置後、０．０５％ツイーン２０（商品
名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。これに
実施例１と同様に調製した３３％感作血球（抗原濃度０
〜２０μｇ／ｍｌ）ＰＢＳ溶液５０μｌ／wellと１０μ
ｇ／ｍｌ抗ＨＤトリポリクローナル抗体ＰＢＳ溶液５０
μｌ／wellを加え、３０℃２時間放置した。ＰＢＳＴで
３回洗浄後、４０００倍希釈のパーオキシダーゼ標識抗
トリＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ製）を１００μｌ加え、３
０℃１時間放置した。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＡＢＴＳ
発色剤（SUMILON ペルオキシダーゼ発色キット）１００
μｌを加え３０℃５分放置後の吸光度（４１５ｎｍ）を
測定した。図４に示すように感作させたＨＤ抗原量に応
じて吸光度が減少することを確認した。
よる測定 (1) 検量線の作製 ９６穴ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno
Plate PolySorp) に１０μｇ／ｍｌＨＤ抗原メタノール
溶液を５０μｌ／well加え室温、常圧で乾固した。次に
４倍希釈のブロックＡ（雪印製）を３００μｌ／well加
え３０℃２時間放置後、０．０５％ツイーン２０（商品
名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。これに
実施例１と同様に調製した３３％感作血球（抗原濃度０
〜２０μｇ／ｍｌ）ＰＢＳ溶液５０μｌ／wellと１０μ
ｇ／ｍｌ抗ＨＤトリポリクローナル抗体ＰＢＳ溶液５０
μｌ／wellを加え、３０℃２時間放置した。ＰＢＳＴで
３回洗浄後、４０００倍希釈のパーオキシダーゼ標識抗
トリＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ製）を１００μｌ加え、３
０℃１時間放置した。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＡＢＴＳ
発色剤（SUMILON ペルオキシダーゼ発色キット）１００
μｌを加え３０℃５分放置後の吸光度（４１５ｎｍ）を
測定した。図４に示すように感作させたＨＤ抗原量に応
じて吸光度が減少することを確認した。
【００２９】(2) 患者サンプル測定 抗原感作血球の代わりに胃癌患者（７検体）、大腸癌患
者（６検体）、健常人（７検体）の血球を用い、検量線
作製と同様な操作を行ない、４１５ｎｍの吸光度を測定
した。図５に吸光度プロットを示す。
者（６検体）、健常人（７検体）の血球を用い、検量線
作製と同様な操作を行ない、４１５ｎｍの吸光度を測定
した。図５に吸光度プロットを示す。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、血液中に本来的に存在す
るにもかかわらず、測定することが困難であった抗原を
迅速にかつ正確に測定することができる。
るにもかかわらず、測定することが困難であった抗原を
迅速にかつ正確に測定することができる。
【図１】本発明の実施例２に記載した方法により健常人
血球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサイ
トメトリーである。
血球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサイ
トメトリーである。
【図２】本発明の実施例２に記載した方法によりウマ血
球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサイト
メトリーである。
球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサイト
メトリーである。
【図３】本発明の実施例２に記載した方法によりＨＤ感
作血球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサ
イトメトリーである。
作血球表面上のＨＤ抗原を測定した結果を示すフローサ
イトメトリーである。
【図４】本発明の実施例５に記載した方法により各種濃
度のＨＤ抗原で感作した血球表面上のＨＤ抗原を競合法
に基づくＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図であ
る。
度のＨＤ抗原で感作した血球表面上のＨＤ抗原を競合法
に基づくＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図であ
る。
【図５】本発明の実施例５に記載した方法により健常人
及び癌患者の血球表面上のＨＤ抗原を競合法に基づくＥ
ＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
及び癌患者の血球表面上のＨＤ抗原を競合法に基づくＥ
ＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 門田 明彦 千葉県袖ケ浦市上泉1280番地 出光興産株 式会社中央研究所内
Claims (8)
- 【請求項１】 癌疾患において出現し、血球表面上に付
着する抗原と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応を
利用した免疫測定により前記抗原を測定することから成
る血球付着性抗原の測定方法。 - 【請求項２】 測定は、血球凝集の測定、フローサイト
メトリー、ＥＬＩＳＡ又はラテックス凝集法により行わ
れる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 血球の表面に付着した前記抗原と、該抗
原に対する抗体を反応させて血球を凝集させ、該凝集を
測定することにより行われる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 測定は、競合ＥＬＩＳＡ法により行われ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記抗原と前記抗体とを反応させた後、
前記抗体に対する抗体をさらに反応させる請求項２ない
し４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 前記抗原が糖脂質である請求項１ないし
５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 前記抗原がガングリオシドである請求項
６記載の方法。 - 【請求項８】 前記抗原がハンガナッツゥ−ダイヘル抗
原である請求項７記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10635396A JPH09145714A (ja) | 1995-09-20 | 1996-04-03 | 血球付着性抗原の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26649095 | 1995-09-20 | ||
| JP7-266490 | 1995-09-20 | ||
| JP10635396A JPH09145714A (ja) | 1995-09-20 | 1996-04-03 | 血球付着性抗原の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09145714A true JPH09145714A (ja) | 1997-06-06 |
Family
ID=26446463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10635396A Pending JPH09145714A (ja) | 1995-09-20 | 1996-04-03 | 血球付着性抗原の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09145714A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003011337A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Keio University | MEDICINAL COMPOSITIONS CONTAINING Fc RECEPTOR Ϝ-CHAIN ACTIVATOR |
-
1996
- 1996-04-03 JP JP10635396A patent/JPH09145714A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003011337A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Keio University | MEDICINAL COMPOSITIONS CONTAINING Fc RECEPTOR Ϝ-CHAIN ACTIVATOR |
| JPWO2003011337A1 (ja) * | 2001-07-30 | 2004-11-18 | 学校法人慶應義塾 | Ｆｃ受容体γ鎖活性化物質を含有する医薬組成物 |
| US7901678B2 (en) | 2001-07-30 | 2011-03-08 | Keio University | Medicinal compositions containing Fc receptor γ chain activator |
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