JPH11248703A - 遊離ハプテンの免疫学的測定法 - Google Patents
遊離ハプテンの免疫学的測定法Info
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- JPH11248703A JPH11248703A JP7129298A JP7129298A JPH11248703A JP H11248703 A JPH11248703 A JP H11248703A JP 7129298 A JP7129298 A JP 7129298A JP 7129298 A JP7129298 A JP 7129298A JP H11248703 A JPH11248703 A JP H11248703A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遊離ハプテンの免疫学的測定法おいて、検体
中のアルブミン濃度の影響を緩和し、正確な遊離ハプテ
ンの濃度を測定すること。 【解決手段】 遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに対す
る抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学的測定法
において、平均分子量５００〜５，０００の蛋白質の存
在下で免疫反応させる。
中のアルブミン濃度の影響を緩和し、正確な遊離ハプテ
ンの濃度を測定すること。 【解決手段】 遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに対す
る抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学的測定法
において、平均分子量５００〜５，０００の蛋白質の存
在下で免疫反応させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遊離ハプテンの免
疫学的測定法に関する。さらに詳しくは、遊離ハプテン
の検体中の濃度値を精度良く測定できる遊離ハプテンの
免疫学的測定法に関する。
疫学的測定法に関する。さらに詳しくは、遊離ハプテン
の検体中の濃度値を精度良く測定できる遊離ハプテンの
免疫学的測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の遊離ハプテンおよび遊離ハプテン
に対する抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学的
測定法では、ウシ血清アルブミン（平均分子量７０，０
００）やゼラチン（平均分子量１００，０００以上）の
存在下で免疫反応させる免疫学的測定法であった。ウシ
血清アルブミンやゼラチンを添加する目的は、蛋白質な
どが非特異的に固相等に吸着することを防ぐためであっ
た「エンザイムイムノアッセイ，石川栄治監訳，（株）
東京化学同人，１９８９年」。具体的には、特公昭６０
−５０１６７４号公報、特開昭６２−１８０２９６号公
報、「ホルモンと臨床，３２巻，ｐ．１２２１，１９８
４年（文献）」、「医学と薬学，２１巻２号，Ｐ．３
４３，１９８９年（文献）」などの免疫学的測定法が
挙げられる。
に対する抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学的
測定法では、ウシ血清アルブミン（平均分子量７０，０
００）やゼラチン（平均分子量１００，０００以上）の
存在下で免疫反応させる免疫学的測定法であった。ウシ
血清アルブミンやゼラチンを添加する目的は、蛋白質な
どが非特異的に固相等に吸着することを防ぐためであっ
た「エンザイムイムノアッセイ，石川栄治監訳，（株）
東京化学同人，１９８９年」。具体的には、特公昭６０
−５０１６７４号公報、特開昭６２−１８０２９６号公
報、「ホルモンと臨床，３２巻，ｐ．１２２１，１９８
４年（文献）」、「医学と薬学，２１巻２号，Ｐ．３
４３，１９８９年（文献）」などの免疫学的測定法が
挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
免疫学的測定法では、遊離ハプテンを含有する検体中の
アルブミン濃度が増減すると測定結果の遊離ハプテン濃
度も増減し、検体中のアルブミン濃度が低い妊娠第III
期や、低アルブミン血症の人の検体中遊離ハプテン濃度
は真値よりも低く測定され、間違った臨床判定をする恐
れがあった。例えば、文献に記載の遊離トリヨードサ
イロニン（以下、ＦＴ3とする）の免疫学的測定方法で
は、血清中のアルブミン濃度と測定結果のＦＴ3濃度間
の相関係数が０．４２８であり、文献に記載の遊離サ
イロキシン（以下、ＦＴ4とする）の免疫学的測定方法
では、血清中のアルブミン濃度と測定結果のＦＴ4濃度
間の相関係数が０．５０５であるため、測定結果の遊離
ハプテン濃度はアルブミン濃度に影響を受けていた。
免疫学的測定法では、遊離ハプテンを含有する検体中の
アルブミン濃度が増減すると測定結果の遊離ハプテン濃
度も増減し、検体中のアルブミン濃度が低い妊娠第III
期や、低アルブミン血症の人の検体中遊離ハプテン濃度
は真値よりも低く測定され、間違った臨床判定をする恐
れがあった。例えば、文献に記載の遊離トリヨードサ
イロニン（以下、ＦＴ3とする）の免疫学的測定方法で
は、血清中のアルブミン濃度と測定結果のＦＴ3濃度間
の相関係数が０．４２８であり、文献に記載の遊離サ
イロキシン（以下、ＦＴ4とする）の免疫学的測定方法
では、血清中のアルブミン濃度と測定結果のＦＴ4濃度
間の相関係数が０．５０５であるため、測定結果の遊離
ハプテン濃度はアルブミン濃度に影響を受けていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決するため鋭意検討した結果、検体中のアルブミン濃
度の影響を受けることなく遊離ハプテン濃度を測定する
ことができる免疫学的測定法を見出し、本発明に到達し
た。すなわち本発明は、遊離ハプテンおよび遊離ハプテ
ンに対する抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学
的測定法において、平均分子量５００〜５，０００の蛋
白質（Ａ）の存在下で免疫反応させることを特徴とする
免疫学的測定法である。
解決するため鋭意検討した結果、検体中のアルブミン濃
度の影響を受けることなく遊離ハプテン濃度を測定する
ことができる免疫学的測定法を見出し、本発明に到達し
た。すなわち本発明は、遊離ハプテンおよび遊離ハプテ
ンに対する抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学
的測定法において、平均分子量５００〜５，０００の蛋
白質（Ａ）の存在下で免疫反応させることを特徴とする
免疫学的測定法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】検体中の遊離ハプテンは、検体中
の蛋白質などに結合したハプテンと平衡関係にある。本
発明の方法では、平均分子量５００〜５，０００の蛋白
質（Ａ）の存在下で免疫反応させるが、蛋白質（Ａ）の
分子量が小さいために、検体中のハプテンと結合しづら
く、上記平衡関係を乱しにくくなると推測される。一
方、従来のウシ血清アルブミン（平均分子量７０，００
０）や、ゼラチン（平均分子量１００，０００以上）の
存在下で免疫反応させる方法では、ウシ血清アルブミン
やゼラチンが検体中のハプテンを結合し、上記平衡関係
を乱す問題があったと考えられる。
の蛋白質などに結合したハプテンと平衡関係にある。本
発明の方法では、平均分子量５００〜５，０００の蛋白
質（Ａ）の存在下で免疫反応させるが、蛋白質（Ａ）の
分子量が小さいために、検体中のハプテンと結合しづら
く、上記平衡関係を乱しにくくなると推測される。一
方、従来のウシ血清アルブミン（平均分子量７０，００
０）や、ゼラチン（平均分子量１００，０００以上）の
存在下で免疫反応させる方法では、ウシ血清アルブミン
やゼラチンが検体中のハプテンを結合し、上記平衡関係
を乱す問題があったと考えられる。
【０００６】本発明の方法では、蛋白質（Ａ）の平均分
子量は、通常５００〜５，０００、好ましくは５００〜
２０００、特に５００〜１０００である。平均分子量が
５００未満では、ブロッキング効果が不十分であるため
非特異的吸着が増大し、平均分子量が５，０００を越え
ると、上記平衡関係を乱す。
子量は、通常５００〜５，０００、好ましくは５００〜
２０００、特に５００〜１０００である。平均分子量が
５００未満では、ブロッキング効果が不十分であるため
非特異的吸着が増大し、平均分子量が５，０００を越え
ると、上記平衡関係を乱す。
【０００７】本発明の方法では、蛋白質（Ａ）の濃度
は、通常０．０５〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜１
０ｇ／Ｌである。また、この濃度は、遊離ハプテンおよ
び遊離ハプテンに対する抗体などが免疫反応する際の液
相（但し、検体液成分を除く）中の濃度である。濃度が
０．０５ｇ／Ｌ未満では、ブロッキング効果が不十分で
あるため非特異的吸着が増大し、５０ｇ／Ｌを越える
と、蛋白質の不溶化の問題が生じる。
は、通常０．０５〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜１
０ｇ／Ｌである。また、この濃度は、遊離ハプテンおよ
び遊離ハプテンに対する抗体などが免疫反応する際の液
相（但し、検体液成分を除く）中の濃度である。濃度が
０．０５ｇ／Ｌ未満では、ブロッキング効果が不十分で
あるため非特異的吸着が増大し、５０ｇ／Ｌを越える
と、蛋白質の不溶化の問題が生じる。
【０００８】本発明の方法において、使用する該蛋白質
（Ａ）として好適なものとしては、アルブミン（血清ア
ルブミン，血漿アルブミン，オバルブミン，コナルブミ
ン，ラクトアルブミンなど）の分解物；乳蛋白質（カゼ
イン，脱脂乳，ホエ蛋白など）やゼラチンの分解物など
が挙げられる。これらのうちさらに好ましいものは、平
均分子量が５００〜５，０００の蛋白質が得られ易い点
で、乳蛋白質（カゼイン，脱脂乳，ホエ蛋白など）の分
解物、特に、カゼイン分解物である。カゼイン分解物
は、カゼインから酸，アルカリ，酵素などで簡単に分解
されて得られる。
（Ａ）として好適なものとしては、アルブミン（血清ア
ルブミン，血漿アルブミン，オバルブミン，コナルブミ
ン，ラクトアルブミンなど）の分解物；乳蛋白質（カゼ
イン，脱脂乳，ホエ蛋白など）やゼラチンの分解物など
が挙げられる。これらのうちさらに好ましいものは、平
均分子量が５００〜５，０００の蛋白質が得られ易い点
で、乳蛋白質（カゼイン，脱脂乳，ホエ蛋白など）の分
解物、特に、カゼイン分解物である。カゼイン分解物
は、カゼインから酸，アルカリ，酵素などで簡単に分解
されて得られる。
【０００９】また、蛋白質（Ａ）として例示したもの
は、単品のみならず組合せによっても使用できる。例え
ば、アルブミン分解物とカゼイン分解物の組合せや、カ
ゼイン分解物とホエ蛋白分解物の組合せなどである。
は、単品のみならず組合せによっても使用できる。例え
ば、アルブミン分解物とカゼイン分解物の組合せや、カ
ゼイン分解物とホエ蛋白分解物の組合せなどである。
【００１０】本発明では、免疫反応の際の反応液中に、
更にポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）を
含有させることが好ましい。免疫反応する際の反応液中
にＰＥＧを含有させると、この水溶性ポリマーの作用に
よって、分子量が１万以下の被測定物質（遊離ハプテン
など）が水溶性ポリマーのネットワークから押し出され
遊離ハプテンに対する抗体と瞬時に反応するため、平衡
関係（Ｂ）が乱れる前に反応が終了しているものと推測
される。
更にポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）を
含有させることが好ましい。免疫反応する際の反応液中
にＰＥＧを含有させると、この水溶性ポリマーの作用に
よって、分子量が１万以下の被測定物質（遊離ハプテン
など）が水溶性ポリマーのネットワークから押し出され
遊離ハプテンに対する抗体と瞬時に反応するため、平衡
関係（Ｂ）が乱れる前に反応が終了しているものと推測
される。
【００１１】本発明において、ＰＥＧの重量平均分子量
は、好ましくは、１，０００〜２００，０００、特に
４，０００〜７０，０００である。重量平均分子量が
１，０００未満では、前記平衡関係が乱れ、重量平均分
子量が２００，０００を越えると、ＰＥＧの不溶化の問
題が生じる。また、遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに
対する抗体などが免疫反応する際の液相（但し、検体液
成分を除く）中の濃度として、好ましくは、０．０２〜
８重量／容量％（以下、特に明示しなければ単に％とす
る）であり、さらに好ましくは、０．１〜２％含有させ
る。濃度が０．０２％未満では、平衡関係が乱れ、濃度
が８％を越えると、ＰＥＧの不溶化の問題が生じる。
は、好ましくは、１，０００〜２００，０００、特に
４，０００〜７０，０００である。重量平均分子量が
１，０００未満では、前記平衡関係が乱れ、重量平均分
子量が２００，０００を越えると、ＰＥＧの不溶化の問
題が生じる。また、遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに
対する抗体などが免疫反応する際の液相（但し、検体液
成分を除く）中の濃度として、好ましくは、０．０２〜
８重量／容量％（以下、特に明示しなければ単に％とす
る）であり、さらに好ましくは、０．１〜２％含有させ
る。濃度が０．０２％未満では、平衡関係が乱れ、濃度
が８％を越えると、ＰＥＧの不溶化の問題が生じる。
【００１２】本発明において、遊離ハプテンに対する抗
体は、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体の
どちらでも使用できるが、安定的な品質の抗体が永続的
に得られるモノクローナル抗体が好ましく使用される。
体は、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体の
どちらでも使用できるが、安定的な品質の抗体が永続的
に得られるモノクローナル抗体が好ましく使用される。
【００１３】本発明において、遊離ハプテンとは、液体
中の蛋白質などに結合したり遊離したりすることのでき
るハプテンの遊離部分であり、例えば、ＦＴ3、ＦＴ4、
コルチゾル、プロゲステロン、オエストラジオール、テ
ストステロン等がある。これらのうち、好ましくは、Ｆ
Ｔ3とＦＴ4である。
中の蛋白質などに結合したり遊離したりすることのでき
るハプテンの遊離部分であり、例えば、ＦＴ3、ＦＴ4、
コルチゾル、プロゲステロン、オエストラジオール、テ
ストステロン等がある。これらのうち、好ましくは、Ｆ
Ｔ3とＦＴ4である。
【００１４】遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに対する
抗体が免疫反応する際の液相（検体液成分を除く）中
で、蛋白質（Ａ）やＰＥＧ以外の成分としては、例え
ば、緩衝液［トリス塩酸バッファ、バルビタールバッフ
ァ、リン酸系バッファなど］に免疫反応に直接関与する
物質［遊離ハプテン、遊離ハプテンに対する抗体及びこ
れらの付加物など］や塩類［ＮａＣｌ2やＭｇＣｌ2な
ど］等が含有される。
抗体が免疫反応する際の液相（検体液成分を除く）中
で、蛋白質（Ａ）やＰＥＧ以外の成分としては、例え
ば、緩衝液［トリス塩酸バッファ、バルビタールバッフ
ァ、リン酸系バッファなど］に免疫反応に直接関与する
物質［遊離ハプテン、遊離ハプテンに対する抗体及びこ
れらの付加物など］や塩類［ＮａＣｌ2やＭｇＣｌ2な
ど］等が含有される。
【００１５】また、本発明の遊離ハプテンの免疫学的測
定法の測定系としては、例えば、ＦＴ3の測定系の場
合、 不溶性担体に結合した抗トリヨードサイロニン
（Ｔ3）抗体に対して、測定検体中ＦＴ3と、Ｔ3または
その類似体［ジヨードサイロニン（Ｔ2）など）標識物
とを競合的に反応させる測定系（以下、を固相抗体法
とする）、 抗Ｔ3抗体の標識物に対して、測定検体中ＦＴ3と、不
溶性担体に結合させたＴ3またはその類似体［ジヨード
サイロニン（Ｔ2）など）とを競合的に反応させる測定
系（以下、を固相抗原法とする）などを含めいずれも
公知の測定系が使用できる。
定法の測定系としては、例えば、ＦＴ3の測定系の場
合、 不溶性担体に結合した抗トリヨードサイロニン
（Ｔ3）抗体に対して、測定検体中ＦＴ3と、Ｔ3または
その類似体［ジヨードサイロニン（Ｔ2）など）標識物
とを競合的に反応させる測定系（以下、を固相抗体法
とする）、 抗Ｔ3抗体の標識物に対して、測定検体中ＦＴ3と、不
溶性担体に結合させたＴ3またはその類似体［ジヨード
サイロニン（Ｔ2）など）とを競合的に反応させる測定
系（以下、を固相抗原法とする）などを含めいずれも
公知の測定系が使用できる。
【００１６】測定系の不溶性担体としては、例えばケイ
酸質無機担体［ガラス（ポ−ラス、ツヤ消しガラスな
ど）、シリカゲル、ベンナイトなど］、磁性体、有機担
体（プラスチック、デキストラン、ロ紙など）などいず
れも公知のものが使用される。また、これらの不溶性担
体は微粒子にされ懸濁の状態で使用される場合もある。
酸質無機担体［ガラス（ポ−ラス、ツヤ消しガラスな
ど）、シリカゲル、ベンナイトなど］、磁性体、有機担
体（プラスチック、デキストラン、ロ紙など）などいず
れも公知のものが使用される。また、これらの不溶性担
体は微粒子にされ懸濁の状態で使用される場合もある。
【００１７】遊離ハプテンや遊離ハプテンに対する抗体
［便宜上合わせてＨ／Ａとする］を不溶性担体に結合さ
せる方法としては、例えば、Ｈ／Ａをガラスに化学的に
結合させる方法（例えば、米国特許第４２８０９９２号
明細書及び同第３６５２７６１号明細書）や、Ｈ／Ａを
プラスチックに物理吸着させる方法（例えば、イ−・エ
ングバル等；バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５
１巻、４２７貢、１９７１年）等がある。さらに、Ｈ／
Ａにビオチンを結合させ不溶化担体にはストレプトアビ
ジンを結合させることによりＨ／Ａを不溶化担体に結合
させる方法や、Ｈ／Ａに対する抗体をあらかじめ不溶化
担体に結合させておくことによりＨ／Ａを不溶化担体に
結合させる方法（例えば、特願平０４−１７４９１１号
明細書）等、間接的にＨ／Ａを不溶化担体に結合させる
方法がある。
［便宜上合わせてＨ／Ａとする］を不溶性担体に結合さ
せる方法としては、例えば、Ｈ／Ａをガラスに化学的に
結合させる方法（例えば、米国特許第４２８０９９２号
明細書及び同第３６５２７６１号明細書）や、Ｈ／Ａを
プラスチックに物理吸着させる方法（例えば、イ−・エ
ングバル等；バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５
１巻、４２７貢、１９７１年）等がある。さらに、Ｈ／
Ａにビオチンを結合させ不溶化担体にはストレプトアビ
ジンを結合させることによりＨ／Ａを不溶化担体に結合
させる方法や、Ｈ／Ａに対する抗体をあらかじめ不溶化
担体に結合させておくことによりＨ／Ａを不溶化担体に
結合させる方法（例えば、特願平０４−１７４９１１号
明細書）等、間接的にＨ／Ａを不溶化担体に結合させる
方法がある。
【００１８】標識物としては、例えば、アイソト−プ
［Ｉ１２５など］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、βガラクトシダーゼなど］、蛍光物
質［ユーロピウム誘導体など］、発光物質［アクリジウ
ム誘導体など］等いずれも公知のものが使用される。
［Ｉ１２５など］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、βガラクトシダーゼなど］、蛍光物
質［ユーロピウム誘導体など］、発光物質［アクリジウ
ム誘導体など］等いずれも公知のものが使用される。
【００１９】Ｈ／Ａを標識物に結合させる方法として
は、例えば、Ｈ／Ａを標識物に結合させる方法（例え
ば、生化学実験法１５、東京化学同人、ｐ．３０８〜３
３０（１９９３））がある。さらに、Ｈ／Ａにストレプ
トアビジンを結合させ標識物にビオチンを結合させるこ
とによりＨ／Ａを標識物に結合させる方法や、Ｈ／Ａに
対する抗体をあらかじめ標識物に結合させておくことに
よりＨ／Ａを標識物に結合させる方法（例えば、特願昭
６３−２６２４７９号明細書）等、間接的にＨ／Ａを標
識物に結合させる方法がある。
は、例えば、Ｈ／Ａを標識物に結合させる方法（例え
ば、生化学実験法１５、東京化学同人、ｐ．３０８〜３
３０（１９９３））がある。さらに、Ｈ／Ａにストレプ
トアビジンを結合させ標識物にビオチンを結合させるこ
とによりＨ／Ａを標識物に結合させる方法や、Ｈ／Ａに
対する抗体をあらかじめ標識物に結合させておくことに
よりＨ／Ａを標識物に結合させる方法（例えば、特願昭
６３−２６２４７９号明細書）等、間接的にＨ／Ａを標
識物に結合させる方法がある。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】平均分子量５００〜５０００の蛋白質含有
の免疫反応用緩衝液の調製；０．０２Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に、塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌの濃
度になるように添加し、免疫反応用緩衝液（ａ）を調製
した。また、（ａ）のカゼイン分解物の濃度が０．０５
ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌになる
免疫反応用緩衝液を調製した。この調製で、 ・カゼイン分解物（平均分子量３０，０００）の場合
は、それぞれ（ａ１），（ａ２），（ａ３），（ａ４）
とし、 ・カゼイン分解物（平均分子量５，０００）の場合は、
それぞれ（ｂ１），（ｂ２），（ｂ３），（ｂ４）と
し、 ・カゼイン分解物（平均分子量１，８００）の場合は、
それぞれ（ｃ１），（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４）と
し、 ・カゼイン分解物（平均分子量７００）の場合はそれぞ
れ（ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）とした。さ
らに、 ・（ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）に、ＰＥＧ
（平均分子量５０，０００）を０．５％の濃度で加えた
場合を、（ｅ１），（ｅ２），（ｅ３），（ｅ４）と
し、 ・ＰＥＧ（平均分子量５，０００）を０．５％の濃度で
加えた場合を、（ｆ１），（ｆ２），（ｆ３），（ｆ
４）とした。
の免疫反応用緩衝液の調製；０．０２Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に、塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌの濃
度になるように添加し、免疫反応用緩衝液（ａ）を調製
した。また、（ａ）のカゼイン分解物の濃度が０．０５
ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌになる
免疫反応用緩衝液を調製した。この調製で、 ・カゼイン分解物（平均分子量３０，０００）の場合
は、それぞれ（ａ１），（ａ２），（ａ３），（ａ４）
とし、 ・カゼイン分解物（平均分子量５，０００）の場合は、
それぞれ（ｂ１），（ｂ２），（ｂ３），（ｂ４）と
し、 ・カゼイン分解物（平均分子量１，８００）の場合は、
それぞれ（ｃ１），（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４）と
し、 ・カゼイン分解物（平均分子量７００）の場合はそれぞ
れ（ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）とした。さ
らに、 ・（ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）に、ＰＥＧ
（平均分子量５０，０００）を０．５％の濃度で加えた
場合を、（ｅ１），（ｅ２），（ｅ３），（ｅ４）と
し、 ・ＰＥＧ（平均分子量５，０００）を０．５％の濃度で
加えた場合を、（ｆ１），（ｆ２），（ｆ３），（ｆ
４）とした。
【００２２】比較例１〜４および実施例１〜２０ ＦＴ3免疫学的測定法（固相抗体法） 全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリン
パス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、 （ａ１），（ａ２），（ａ３），（ａ４）， （ｂ１），（ｂ２），（ｂ３），（ｂ４）， （ｃ１），（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４）， （ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）， （ｅ１），（ｅ２），（ｅ３），（ｅ４）， （ｆ１），（ｆ２），（ｆ３），（ｆ４） 各々［以下、（ａ１）〜（ｆ４）とする］の０．３ｍＬ
と、標準ＦＴ３液または健常人血清検体の０．０５ｍＬ
と、抗Ｔ３モノクローナル抗体結合ガラスビーズ（以下
Ｇ１とする）１個とを、反応管中で３７℃，１５分間免
疫反応させ、ＦＴ３＋Ｇ１複合体を形成させた。反応
後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を
行った。
パス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、 （ａ１），（ａ２），（ａ３），（ａ４）， （ｂ１），（ｂ２），（ｂ３），（ｂ４）， （ｃ１），（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４）， （ｄ１），（ｄ２），（ｄ３），（ｄ４）， （ｅ１），（ｅ２），（ｅ３），（ｅ４）， （ｆ１），（ｆ２），（ｆ３），（ｆ４） 各々［以下、（ａ１）〜（ｆ４）とする］の０．３ｍＬ
と、標準ＦＴ３液または健常人血清検体の０．０５ｍＬ
と、抗Ｔ３モノクローナル抗体結合ガラスビーズ（以下
Ｇ１とする）１個とを、反応管中で３７℃，１５分間免
疫反応させ、ＦＴ３＋Ｇ１複合体を形成させた。反応
後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を
行った。
【００２３】第二反応として、反応管中のＦＴ3＋Ｇ１
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ3（以下Ｐ１と
する）を０．２ｍｇ／Ｌ含有する（ａ１）〜（ｆ４）各
々を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間
免疫反応させ、ＦＴ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／
Ｆ分離を行った。
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ3（以下Ｐ１と
する）を０．２ｍｇ／Ｌ含有する（ａ１）〜（ｆ４）各
々を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間
免疫反応させ、ＦＴ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／
Ｆ分離を行った。
【００２４】第三反応として、反応管中のＦＴ3＋Ｇ１
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよび
テトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸
緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１
５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオ
ン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよび
テトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸
緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１
５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオ
ン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００２５】最後に、各標準ＦＴ3液の濃度値と測光値
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
【００２６】比較例５〜８および実施例２１〜４０ ＦＴ3免疫学的測定法（固相抗原法） 第一反応として、ペルオキシダーゼ標識抗Ｔ3モノクロ
ーナル抗体（以下、Ｐ２とする）を０．１ｍｇ／Ｌ含有
する（ａ１）〜（ｆ４）各々の０．３ｍＬと、標準ＦＴ
3液または健常人血清検体の０．０５ｍＬと、Ｔ3結合ガ
ラスビーズ（以下、Ｇ２とする）の１個とを反応管中で
３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ２＋Ｐ２複合体を形
成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄さ
せＢ／Ｆ分離を行った。
ーナル抗体（以下、Ｐ２とする）を０．１ｍｇ／Ｌ含有
する（ａ１）〜（ｆ４）各々の０．３ｍＬと、標準ＦＴ
3液または健常人血清検体の０．０５ｍＬと、Ｔ3結合ガ
ラスビーズ（以下、Ｇ２とする）の１個とを反応管中で
３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ２＋Ｐ２複合体を形
成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄さ
せＢ／Ｆ分離を行った。
【００２７】第二反応として、反応管中のＧ２＋Ｐ２複
合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメ
チルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を
０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間
発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオン水を混合
させ、３８０ｎｍで測光させた。
合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメ
チルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を
０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間
発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオン水を混合
させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００２８】最後に、各標準ＦＴ3液の濃度値と測光値
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
【００２９】比較例９〜１２および実施例４１〜６０ ＦＴ4免疫学的測定法（固相抗体法） 第一反応として、（ａ１）〜（ｆ４）各々の０．３ｍＬ
と、標準ＦＴ4液または健常人血清検体の０．０５ｍＬ
と、抗Ｔ4モノクローナル抗体結合ガラスビーズ（以下
Ｇ３とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫
反応させ、ＦＴ4＋Ｇ３複合体を形成させた。反応後、
装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行っ
た。
と、標準ＦＴ4液または健常人血清検体の０．０５ｍＬ
と、抗Ｔ4モノクローナル抗体結合ガラスビーズ（以下
Ｇ３とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫
反応させ、ＦＴ4＋Ｇ３複合体を形成させた。反応後、
装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行っ
た。
【００３０】第二反応として、反応管中のＦＴ4＋Ｇ３
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ4（以下Ｐ３と
する）を０．４ｍｇ／Ｌ含有する（ａ１）〜（ｆ４）各
々を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間
免疫反応させ、ＦＴ4＋Ｇ３＋Ｐ３複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／
Ｆ分離を行った。
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ4（以下Ｐ３と
する）を０．４ｍｇ／Ｌ含有する（ａ１）〜（ｆ４）各
々を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間
免疫反応させ、ＦＴ4＋Ｇ３＋Ｐ３複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／
Ｆ分離を行った。
【００３１】第三反応として、反応管中のＦＴ4＋Ｇ３
＋Ｐ３複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよび
テトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸
緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１
５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオ
ン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
＋Ｐ３複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよび
テトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸
緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１
５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオ
ン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００３２】最後に、各標準ＦＴ4液の濃度値と測光値
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
【００３３】比較例１３〜１６および実施例６１〜８０ ＦＴ4免疫学的測定法（固相抗原法） 第一反応として、ペルオキシダーゼ標識抗Ｔ4モノクロ
ーナル抗体（以下、Ｐ４とする）を０．３ｍｇ／Ｌ含有
する(a1)〜(f4)各々の０．３ｍＬと、標準ＦＴ4液また
は健常人血清検体の０．０５ｍＬと、Ｔ4結合ガラスビ
ーズ（以下、Ｇ４とする）の１個とを反応管中で３７
℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ４＋Ｐ４複合体を形成さ
せた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ
／Ｆ分離を行った。
ーナル抗体（以下、Ｐ４とする）を０．３ｍｇ／Ｌ含有
する(a1)〜(f4)各々の０．３ｍＬと、標準ＦＴ4液また
は健常人血清検体の０．０５ｍＬと、Ｔ4結合ガラスビ
ーズ（以下、Ｇ４とする）の１個とを反応管中で３７
℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ４＋Ｐ４複合体を形成さ
せた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ
／Ｆ分離を行った。
【００３４】第二反応として、反応管中のＧ４＋Ｐ４複
合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメ
チルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を
０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間
発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオン水を混合
させ、３８０ｎｍで測光させた。
合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメ
チルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を
０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間
発色反応させ、反応後、０．７ｍｌの脱イオン水を混合
させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００３５】最後に、各標準ＦＴ4液の濃度値と測光値
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回
帰させ、その検量線から、健常人血清検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
【００３６】比較例１〜８および実施例１〜４０の評価 検体中のアルブミン濃度の影響を受けることなく遊離ハ
プテン濃度を測定することができる免疫学的測定法であ
ることを確かめるため、比較例１〜８および実施例１〜
４０のＦＴ3免疫学的測定法で健常人血清検体の１００
検体分のＦＴ3濃度を測定し、Ａ／Ｇ Ｂ−テストワコ
ー（和光純薬工業株式会社）で健常人血清検体の１００
検体分のアルブミン濃度を測定し、ＦＴ3濃度とアルブ
ミン濃度の相関係数を求めた。比較例１〜４および実施
例１〜２０のＦＴ3免疫学的測定法（固相抗体法）の結
果を表１に示し、比較例５〜８および実施例２１〜４０
のＦＴ3免疫学的測定法（固相抗原法）の結果を表２に
示す。
プテン濃度を測定することができる免疫学的測定法であ
ることを確かめるため、比較例１〜８および実施例１〜
４０のＦＴ3免疫学的測定法で健常人血清検体の１００
検体分のＦＴ3濃度を測定し、Ａ／Ｇ Ｂ−テストワコ
ー（和光純薬工業株式会社）で健常人血清検体の１００
検体分のアルブミン濃度を測定し、ＦＴ3濃度とアルブ
ミン濃度の相関係数を求めた。比較例１〜４および実施
例１〜２０のＦＴ3免疫学的測定法（固相抗体法）の結
果を表１に示し、比較例５〜８および実施例２１〜４０
のＦＴ3免疫学的測定法（固相抗原法）の結果を表２に
示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】比較例９〜１６および実施例４１〜８０の
評価 さらに、検体中のアルブミン濃度の影響を受けることな
く遊離ハプテン濃度を測定することができる免疫学的測
定法であることを確かめるため、比較例９〜１６および
実施例４１〜８０のＦＴ4免疫学的測定法で健常人血清
検体の１００検体分のＦＴ4濃度を測定し、Ａ／Ｇ Ｂ
−テストワコー（和光純薬工業株式会社）で健常人血清
検体の１００検体分のアルブミン濃度を測定し、ＦＴ4
濃度とアルブミン濃度の相関係数を求めた。比較例９〜
１２および実施例４１〜６０のＦＴ4免疫学的測定法
（固相抗体法）の結果を表３に示し、比較例１３〜１６
および実施例６１〜８０のＦＴ4免疫学的測定法（固相
抗原法）の結果を表４に示す。
評価 さらに、検体中のアルブミン濃度の影響を受けることな
く遊離ハプテン濃度を測定することができる免疫学的測
定法であることを確かめるため、比較例９〜１６および
実施例４１〜８０のＦＴ4免疫学的測定法で健常人血清
検体の１００検体分のＦＴ4濃度を測定し、Ａ／Ｇ Ｂ
−テストワコー（和光純薬工業株式会社）で健常人血清
検体の１００検体分のアルブミン濃度を測定し、ＦＴ4
濃度とアルブミン濃度の相関係数を求めた。比較例９〜
１２および実施例４１〜６０のＦＴ4免疫学的測定法
（固相抗体法）の結果を表３に示し、比較例１３〜１６
および実施例６１〜８０のＦＴ4免疫学的測定法（固相
抗原法）の結果を表４に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【発明の効果】従来は、健常人血清検体のアルブミン濃
度と遊離ハプテン測定濃度間の相関係数は０．４５以上
であったが、本発明によって、健常人血清検体のアルブ
ミン濃度と遊離ハプテン測定濃度間の相関係数は０．３
０以下となった。したがって、本発明の遊離ハプテンの
免疫学的測定法では、検体中のアルブミン濃度の影響を
受けにくい。さらに、遊離ハプテン濃度が臨床診断に利
用される場合には、検体中のアルブミン濃度が低い妊娠
第III期や低アルブミン血症の検体であっても従来より
も極めて正確な測定と診断が可能となり、さらには極め
て正確な治療も可能となる。
度と遊離ハプテン測定濃度間の相関係数は０．４５以上
であったが、本発明によって、健常人血清検体のアルブ
ミン濃度と遊離ハプテン測定濃度間の相関係数は０．３
０以下となった。したがって、本発明の遊離ハプテンの
免疫学的測定法では、検体中のアルブミン濃度の影響を
受けにくい。さらに、遊離ハプテン濃度が臨床診断に利
用される場合には、検体中のアルブミン濃度が低い妊娠
第III期や低アルブミン血症の検体であっても従来より
も極めて正確な測定と診断が可能となり、さらには極め
て正確な治療も可能となる。
Claims (2)
- 【請求項１】遊離ハプテンおよび遊離ハプテンに対する
抗体を免疫反応させる遊離ハプテンの免疫学的測定法に
おいて、平均分子量５００〜５，０００の蛋白質（Ａ）
の存在下で免疫反応させることを特徴とする免疫学的測
定法。 - 【請求項２】ポリエチレングリコールの存在下で免疫反
応させる請求項１記載の免疫学的測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7129298A JPH11248703A (ja) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | 遊離ハプテンの免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7129298A JPH11248703A (ja) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | 遊離ハプテンの免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11248703A true JPH11248703A (ja) | 1999-09-17 |
Family
ID=13456476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7129298A Pending JPH11248703A (ja) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | 遊離ハプテンの免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11248703A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005121790A1 (ja) * | 2004-06-11 | 2005-12-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 測定感度を向上させるための組成物 |
| JP2013019888A (ja) * | 2011-06-16 | 2013-01-31 | Fujifilm Corp | 高感度なイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ用キット |
| JP2014209123A (ja) * | 2008-04-29 | 2014-11-06 | サイケメディクス コーポレイション | 固相多分析物アッセイ法 |
-
1998
- 1998-03-04 JP JP7129298A patent/JPH11248703A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005121790A1 (ja) * | 2004-06-11 | 2005-12-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 測定感度を向上させるための組成物 |
| JP2014209123A (ja) * | 2008-04-29 | 2014-11-06 | サイケメディクス コーポレイション | 固相多分析物アッセイ法 |
| JP2013019888A (ja) * | 2011-06-16 | 2013-01-31 | Fujifilm Corp | 高感度なイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ用キット |
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