JPH11287801A - 免疫学的測定法および免疫学的測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中に存在する非特異因子による影響を受
けることなく、抗原を正確に測定することができる免疫
学的測定法およびそれに用いることができるキットを提
供する。 【解決手段】 試料中に存在する非特異因子に対する抗
体を免疫測定系に添加することにより、該非特異因子に
よる非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測
定法。試料中に存在しうる非特異因子に対する抗体を含
む免疫学的測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定法に
関し、より詳細には、試料中に存在する非特異因子によ
り生じる非特異反応を抑制する免疫学的測定法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】免疫学的測定法は抗原抗体反応を利用し
た測定法で、特異性が非常に高い測定法であることが知
られている。免疫学的測定法としては、蛍光抗体法、間
接血球凝集法、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイ
ムノアッセイ法などが知られている。最近は、より高感
度な化学発光免疫測定法、一般の生化学用分析装置で測
定可能な免疫比濁法、ラテックス凝集光学的測定法など
が開発され、特に医学分野においては頻繁に利用されて
いる。

【０００３】しかし、このような特異性の高い免疫学的
測定法であっても、試料によっては測定しようとする抗
原が存在しなくても陽性の測定値を示したり、真値とは
異なった測定値を示したりする問題があった。すなわ
ち、非特異反応と呼ばれる現象である。たとえば、測定
しようとする抗原に対する抗体を固相化するような免疫
学的測定法であるエンザイムイムノアッセイ法やラテッ
クス凝集光学的測定法などでは、固相化抗体を認識して
これと反応する因子（非特異因子）が試料中に存在する
場合があり、このような場合には試料中に測定しようと
する抗原が存在しなくても陽性の測定値になったり、真
値とは異なった測定値を示してしまうという問題があっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、試料中に存在する非特異因子による影響を受けるこ
となく、抗原を正確に測定することができる免疫学的測
定法およびそれに用いることができるキットを提供する
ことである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、免疫学的測定法において、試料中に存在する非
特異因子に対する抗体を免疫測定系に添加することによ
り、該非特異因子による非特異反応を抑制し、その結果
として、抗原を正確に測定できることを見出し、本発明
を完成させるに至った。すなわち、本発明は、試料中に
存在する非特異因子に対する抗体を免疫測定系に添加す
ることにより、該非特異因子による非特異反応を抑制す
ることを特徴とする免疫学的測定法を提供する。試料中
に存在する非特異因子としては、測定しようとする抗原
に対する抗体を認識して、この抗体と反応するものであ
れば、特に限定されないが、ＩｇＭ型またはＩｇＧ型の
自然抗体を挙げることができる。非特異因子に対する抗
体としては、非特異因子を認識して、これと反応するも
のであれば、特に限定されないが、抗ヒトＩｇＭ抗体、
抗ヒトＩｇＧ抗体を挙げることができる。免疫学的測定
法としては、蛍光抗体法、間接血球凝集法、ラジオイム
ノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法、化学発光
免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集光学的測定法
などが挙げられるが、ラテックス凝集光学的測定法が効
果的である。

【０００６】また、本発明は、試料中に存在しうる非特
異因子に対する抗体を含む免疫学的測定用キットを提供
する。試料中に存在しうる非特異因子およびそれに対す
る抗体としては、上記のものが挙げられる。本発明のキ
ットは、さらに、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝
する薬剤、たとえば、グリシン、Tris、Hepes などを含
んでもよい。本発明の方法およびキットは、臨床検査分
野を始めとする医学分野、特に免疫学的手法に関係する
分野に有用なものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】免疫学的測定にかける試料として
は、種々の生体試料、例えば、被験者の血液、血清、血
漿、尿、唾液などの体液、各種の細胞、組織を挙げるこ
とができる。試料中に存在する非特異因子は、測定しよ
うとする抗原に対する抗体を認識して、この抗体と反応
するものである。たとえば、ラテックス凝集光学的測定
法において、ラテックス粒子に結合させた測定しようと
する抗原に対する抗体がウサギ免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）である場合には、ラテックス粒子表面上に結合した
ウサギＩｇＧを非特異因子が認識してこれと反応する。
この非特異因子は、測定しようとする抗原で全く免疫さ
れていない正常ウサギのＩｇＧも認識してこれと反応す
る。試料中に存在するこのような非特異因子は免疫など
によって産生されたものでないため、自然抗体と呼ばれ
ている。このような自然抗体は、免疫グロブリンＭ（Ｉ
ｇＭ）であったり、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であっ
たりする。すなわち、非特異因子は、試料がヒト体液、
たとえば血清や血漿の場合には、測定しようとする抗原
に対する抗体を作製した動物のＩｇＧに対する抗動物Ｉ
ｇＧ抗体ヒトＩｇＭ型あるいは抗動物ＩｇＧ抗体ヒトＩ
ｇＧ型である。この他にも、非特異因子としては、リウ
マチ因子、異好抗体などが知られている。

【０００８】非特異因子に対する抗体は、非特異因子を
認識して、これと反応するものであり、ＩｇＭ型の非特
異因子の場合には、抗ヒトＩｇＭ抗体であり、ＩｇＧ型
の非特異因子の場合には、抗ヒトＩｇＧ抗体であるが、
これは一例である。非特異因子に対する抗体は、いずれ
の動物に免疫して作製されたものでも良いが、好ましく
は測定しようとする抗原に対する抗体と同種の動物によ
り作製されたものである。

【０００９】本発明の方法において、非特異因子に対す
る抗体は、免疫測定系に添加される。具体的には、非特
異因子に対する抗体の溶液を用意して、測定しようとす
る抗原に対する抗体を抗原と反応させる前に、あらかじ
め試料に前記の溶液を添加して、非特異因子とそれに対
する抗体を反応させることによって、非特異因子による
非特異反応を抑制してもよいし、測定しようとする抗原
に対する抗体の溶液中に非特異因子に対する抗体を含ま
せ、この溶液を試料に添加して、非特異因子とそれに対
する抗体を反応させることによって、非特異因子による
非特異反応を抑制してもよい。前者の方法において、非
特異因子に対する抗体の溶液中の該抗体の量は、特に限
定されないが、好ましくは抗体蛋白量0.1mg/mLから10mg
/mLである。この溶液の組成は、特に限定されることは
なく、抗体活性に安定なもので（すなわち、抗体の活性
を失活させない）しかも測定しようとする抗原の測定系
に影響を与えないものであればよい。また、後者の方法
において、測定しようとする抗原に対する抗体の溶液中
に含ませる非特異因子に対する抗体の量は、特に限定さ
れないが、好ましくは抗体蛋白量0.1mg/mLから10mg/mL
である。

【００１０】本発明の免疫学的測定用キットは、試料中
に存在しうる非特異因子に対する抗体をひとつの要素と
して含むが、その他にも、試料のイオン強度や浸透圧な
どを緩衝する薬剤、たとえば、グリシン、Tris、Hepes
などの要素を含んでもよい。これらの要素は、バイア
ル、チューブなどのような容器に収納され、区画化され
た担持手段中にこれらの容器をひとまとめにして納めら
れるとよい。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。実施例１ 試料として、数名の急性心筋梗塞患者からの血清を用意
し、これらの試料における非特異反応の有無を以下のよ
うにして確認した。

【００１２】血清試料を生理食塩液にて５段階希釈し、
各々の試料10μLに第１試薬である0.17Mグリシン緩衝
液、pH7.0を160μＬ添加したのち、Massonらの方法（Me
thodsin enzymology, vol.74, 106-140）により抗ミオ
グロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させたラテックス試薬
である第２試薬を100μL添加して反応させ、各々の試料
中のミオグロビン濃度を測定した。結果を図１に示す。
図１に示されるように、希釈系列とミオグロビン濃度に
比例関係があるものは非特異反応の無い試料であり、こ
のような試料では、正確にミオグロビン濃度が定量でき
る。これに対して、希釈系列とミオグロビン濃度に比例
関係が無いものは非特異反応のある試料であり、このよ
うな試料では、非特異因子が測定に影響を及ぼすため
に、正確なミオグロビン濃度の定量ができないことは明
らかである。

【００１３】実施例２ 実施例１の非特異反応のある試料または非特異反応の無
い試料を生理食塩液にて５段階希釈し、各々の試料10μ
Lに、抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）1.0 mg/mLを含
む第１試薬（0.17Mグリシン緩衝液、pH7.0）を160μＬ
添加したのち、第２試薬（Massonらの方法により抗ミオ
グロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させたラテックス試
薬）を100μL添加して反応させ、各々の試料中のミオグ
ロビン濃度を測定した。結果を図２に示す。図２に示さ
れるように、非特異反応の無い試料では、第１試薬に抗
ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）が含まれていても希釈
系列とミオグロビン濃度には比例関係があり、正確にミ
オグロビン濃度を定量していることがわかる。また、非
特異反応のある試料でも、第１試薬に抗ヒトＩｇＭ抗体
（ウサギＩｇＧ）を含ませれば、実施例１の場合とは異
なり希釈系列とミオグロビン濃度には比例関係があり、
正確にミオグロビン濃度を定量していることがわかる。

【００１４】実施例１および２の結果から、次のことが
言える。非特異因子による非特異反応が無い試料中のミ
オグロビン濃度は正確に定量できるが、実施例１では非
特異反応のある試料では希釈系列とミオグロビン濃度に
は比例関係が無く、明らかに非特異因子による測定への
影響があり、正確にミオグロビン濃度を定量できなかっ
た。しかし、非特異因子に対する抗体、この実施例では
抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）を第１試薬に含ませ
て試料に添加すれば、試料中の非特異因子の非特異反応
を抑制することにより非特異反応のある試料でも希釈系
列とミオグロビン濃度には比例関係が成立し、正確にミ
オグロビン濃度を定量できる。

【００１５】実施例３ 非特異因子の分画 実施例１の非特異反応のある試料200μLをSuperose 6に
チャージし、ゲル濾過分画を行った。次に、各画分のミ
オグロビン濃度を実施例１の第１試薬（抗ＩｇＭ抗体を
含まない）及び第２試薬のラテックス試薬を用いて実施
例１と同様に測定した。ピークはミオグロビンの分子量
的に分画される位置とそれより高分子側の分画位置とに
確認された。この高分子側の分画を非特異因子分画とし
た。

【００１６】非特異因子と抗ＩｇＭ抗体添加の効果 非特異反応のない試料として、健常人の血清を用意し
た。この非特異反応のない試料の少量をとり、これを試
料Ａとした。また、同じ試料から別に少量とり、これに
非特異因子分画を約１mg/mL（最終蛋白質量）添加し
て、試料Ｂとした。

【００１７】試料ＡおよびＢの各10μLに、第１試薬
（0.17Mグリシン緩衝液、pH7.0）を160μＬ、または抗
ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）1.0 mg/mLを含む第１
試薬を160μＬ添加したのち、第２試薬（Massonらの方
法により抗ミオグロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させた
ラテックス試薬）を100μL添加して反応させ、各々の試
料中のミオグロビン濃度を測定した。その結果、表１に
示すように試料Ａのミオグロビン濃度は抗ＩｇＭ抗体を
含まない第１試薬を用いた場合と抗ＩｇＭ抗体を含んだ
第１試薬を用いた場合とでほぼ同様の測定値であった
が、試料Ｂのミオグロビン濃度は抗ＩｇＭ抗体を含まな
い第１試薬を用いた場合、試料Ａに比較して非常に高い
値を示した。しかし、抗ＩｇＭ抗体を含んだ第１試薬を
用いた場合の試料Ｂのミオグロビン濃度は試料Ａと同様
の測定値であった。抗ＩｇＭ抗体を含まない第１試薬を
用いた場合の試料Ｂのミオグロビン濃度が試料Ａに比較
して非常に高い値を示したのは、非特異因子の添加によ
るものであり、抗ＩｇＭ抗体を含んだ第１試薬を用いた
場合の試料Ｂのミオグロビン濃度が試料Ａと同様の測定
値であったのは、第１試薬に抗ＩｇＭ抗体を添加するこ
とにより非特異因子の非特異反応を抑制したためであ
る。このことは、抗ＩｇＭ抗体の添加により非特異因子
による非特異反応を抑制し、その結果、ミオグロビンの
正確な定量測定ができることを意味している。

【００１８】

【表１】

【００１９】

【発明の効果】本発明の免疫学的測定法によれば、非特
異因子を含む試料についても、該非特異因子により生じ
る非特異反応を抑制して、抗原を正確に測定することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた非特異反応のある試料また
は非特異反応の無い試料の希釈系列とミオグロビン濃度
の測定値との関係を示した図である。

【図２】非特異因子に対する抗体を添加した場合の非特
異反応のある試料または非特異反応の無い試料の希釈系
列とミオグロビン濃度の測定値との関係を示した図であ
る。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中に存在する非特異因子に対する抗
   体を免疫測定系に添加することにより、該非特異因子に
   よる非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測
   定法。
2. 【請求項２】 非特異因子がＩｇＭ型またはＩｇＧ型の
   自然抗体である請求項１記載の免疫学的測定法。
3. 【請求項３】 非特異因子に対する抗体が抗ヒトＩｇＭ
   抗体である請求項１または２記載の免疫学的測定法。
4. 【請求項４】 非特異因子に対する抗体が抗ヒトＩｇＧ
   抗体である請求項１または２記載の免疫学的測定法。
5. 【請求項５】 免疫学的測定法が、ラテックス凝集光学
   的測定法である請求項１〜４のいずれかに記載の免疫学
   的測定法。
6. 【請求項６】 試料中に存在しうる非特異因子に対する
   抗体を含む免疫学的測定用キット。