JPWO2009025364A1 - 非特異反応抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
C.等の文献(非特許文献1)においては、Fab’にポリエチレングリコールを化学修飾した、抗腫瘍剤の実施例が報告されている。更に、特許文献3においては、Fab’のチオール基を介して薬剤およびポリマーを結合させた抗腫瘍剤が開示されている。
すなわち、ある程度の分子サイズがなければ、非特異反応因子に結合可能であっても、非特異反応因子による非特異反応を抑制することができない可能性が示唆された。そこで、本発明者は、Fab’に様々な高分子を結合させ、巨大化し、非特異抑制効果を回復するのかを検討した。その結果、高分子を修飾する際の結合様式は問わず、ポリエチレングリコール、デキストラン、ウシ血清アルブミン(BSA)、ポリグルタミン酸のいずれにおいても該高分子の修飾を施すことにより、Fab’の非特異抑制効果が回復した。この事実より、Fab’が非特異抑制効果を消失する原因は後者の仮説(2)が主因であることが明らかとなった。特にポリエチレングリコールを結合させたFab’は、IgGやF(ab’)2に比し、1/5ないし1/10程度少量の添加で非特異抑制効果を示すことがわかった。また、免疫比ろう反応を生じにくい性質を示すことが明らかとなった。
M
.J.等の総説(Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54, 459-476)やFrancesco M.等の総説(Biomaterials 2001, 22, 405-417)にその主要な方法が記載され
ている。例えば、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖のアミノ基、システイン残基のチオール基、カルボキシル基末端のカルボキシル基、またはアミノ基末端のアミノ基、セリン残基又はスレオニン残基等のヒドロキシル基を標的として、ポリマーを結合する方法が挙げられている。また、抗体あるいは抗体断片へポリマーを結合させる方法も公知技術である。特に抗体を化学修飾する場合には、抗体活性、すなわち、抗原に結合する能力を消失させない方法で、化学修飾体を調製することが有用と考えられている。Andrew
P.等の総説(Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 531-545)に記載されてい
るように、アミノ基やカルボキシル基は抗原認識部位にも存在するため、それらの官能基を標的としてポリマーを結合させた場合、抗原の認識部位がポリマーによりマスクされ、結果として化学修飾により抗体活性を低減するケースが多い。こうしたポリマー修飾による不利益を回避する目的で、例えばFab’のヒンジ部のチオール基、または還元したIgGのチオール基を標的としてポリマーを結合させる方法がある。実際、Slinkin
M.A.等の文献(Bioconjug Chem. 1992, 3(6), 477-483)では、抗体断片のFab’のチオール基へポリマーを結合させた実施例が報告がされている。また、Delgado
C.等の文献(Br J Cancer. 1996, 73(2), 175-182)においては、Fab’にポリエチレングリコールを化学修飾した、抗腫瘍剤の実施例が報告されている。更に米国特許5,541,297号明細書においては、Fab’のチオール基を介して薬剤およびポリマーを結合させた抗腫瘍剤が開示されている。
すなわち、本発明は、「非特異反応抑制剤」としての新たな用途を提供するものであり、かつ従来の非特異反応抑制技術より優れた効果を示すものである。
本発明は、非特異反応因子に特異的に結合する抗体又はその断片と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定用の非特異反応抑制剤に関する。
また、本発明の非特異反応抑制剤の別の好ましい態様によれば、前記高分子化合物の分子量が200Da〜1000kDaである。
本発明の非特異反応抑制剤の更に別の好ましい態様によれば、抗体断片が、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、L鎖、H鎖、又は還元型IgG(rIgG)である。
本発明の非特異反応抑制剤の更に別の好ましい態様によれば、抗体又はその断片と高分子化合物との結合が、チオール基、アミノ基、ヒドロキシル基、若しくはカルボキシル基を利用する化学修飾、又はビオチン−アビジン結合によるものである。
本発明の免疫学的測定方法の好ましい態様によれば、免疫学的測定方法が、ラテックス凝集光学的測定法、エンザイムイムノアッセイ、免疫比ろう法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、又は放射免疫測定法である。
本明細書における「非特異反応因子」とは、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法において非特異的な反応を惹起する物質である。具体的な因子としては、ヒト体液を試料とする場合、ヒトIgM、ヒトIgG、ヒトIgA、ヒトIgE、ヒトIgDおよび当該抗体に結合する因子、例えば、補体、リウマチ因子、Fc受容体等が挙げられ、ヒト以外の動物の体液を試料とする場合は、当該動物のIgM、IgG、IgA、IgE、および当該抗体に結合する因子等が挙げられる。非特異反応因子に対する抗体は、例えば、IgM型の非特異反応因子の場合には、抗ヒトIgM抗体である。またIgA型の非特異反応因子の場合は、抗ヒトIgA抗体である。本発明の非特異反応抑制剤を免疫測定試薬へ添加する場合であって、複数の非特異反応因子が非特異反応を起こすと想定する場合、例えば、IgM、IgG、IgAが非特異反応因子であると想定する場合は、抗IgM抗体、抗IgG抗体、抗IgA抗体から調製した本発明の非特異反応抑制剤を添加することが望ましい。従って、1種類のみの非特異反応抑制剤を添加するように限定はしない。
チオール基を標的とする修飾で使用される「反応性誘導体」とは、例えば、マレイミド類やビニルスルホン類などのチオール基選択的な反応基を含む。また、ポリマーに直接反応性誘導体が結合したものを利用してもよいし、反応性誘導体を含む架橋剤を利用してもよい。
アミノ基を標的とする修飾で使用される「反応性誘導体」とは、例えば、N−ヒドロキシスクシニミド(NHS)エステルやN−ヒドロキシスルフォスクシミド(Sulfo−NHS)エステル等を含む。また、アルデヒド基を含有する化合物(例えば、グルタルアルデヒド)や、ポリマーであって予めアルデヒド基を含有するポリマー等がある。
カルボキシル基を標的とする修飾では、例えば、カルボジイミド(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride)を触媒としてアミノ基と反応させる方法で得られる複合体を含む。
ヒドロキシル基を標的とする修飾では、例えば、イソシアン酸誘導体を含有する化合物を用いて調製することができる。
なお、反応性誘導体が導入されたポリマーは、市販品(例えば、日油株式会社)として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
また、ビオチンとアビジンの様に、抗体とポリマーの結合様式が共有結合による結合ではないが、高い親和性を有する結合様式を利用する方法も本発明に含む。
上記多糖類には、例えば、デキストラン、デキストリン、アガロース、カルボキシメチル(CM)−セルロース、ヘパリン、可溶性澱粉等を含む。多糖類は直鎖であっても分技鎖を有するものであっても構わない。多糖類を用いてタンパク質に修飾するには、従来から知られている過ヨウ素酸酸化法、臭化シアン法、カルボジイミド法、塩化シアヌル法、エピクロルヒドリン法、SPDP(N-Succinimidyle 3-[2-pyridyldithio]propionate)試薬法、活性エステル法などを使用することができる。なお、反応性誘導体が導入された多糖類は市販品として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
[目的]
抗非特異反応因子のIgGやF(ab’)2は良好な非特異抑制効果を有するが、Fab’においてはその効果が弱い。その原因として、(1)非特異抑制効果を示すには1分子中に複数の抗原認識部位が必要である可能性、(2)非特異反応抑制剤の分子サイズが抑制効果に影響する可能性が考えられた。本実施例は、これらの仮説を検証する目的で実施した。Fab’のように抗原認識部位が1つであっても、非特異抑制効果を示せば、(1)の可能性を否定することができる。また、後者については、様々な大きさの高分子の修飾を施し、非特異抑制効果を検討すれば検証が可能である。
ヒトIgMに結合するIgGの抗体の断片(Fab’)を用い、ポリエチレングリコール修飾による非特異抑制効果を検討する目的で、ポリエチレングリコール修飾Fab’(以下、Fab’Malと称する)の調製を実施した。ポリエチレングリコールの修飾様式は、1分子のFab’に、ヒンジ部のチオール基を介して1分子のポリエチレングリコールを結合させることとした。これは、ポリエチレングリコールがFab’の抗原認識部に結合する状況を回避するためである。Fab’の動物種はウサギを選択し、片側の末端のみにマレイミド基を有するポリエチレングリコールを修飾剤として用いることとした。更に、修飾するポリエチレングリコールの長さ(分子量)の違いによる非特異抑制効果の違いを調べる目的で、2kDa、5kDa、12kDa、20kDa、30kDaの各長さのポリエチレングリコールを修飾剤として用い、各種分子量のFab’Malを調製した。陰性コントロールとしては、Fab’からF(ab’)2への可逆反応を阻止する目的で、チオール基をN−エチルマレイミドにて封鎖したFab’(以下、チオール基封鎖Fab’と称する)を利用することとした。チオール基封鎖Fab’、2kDaのFab’Mal、5kDaのFab’Mal、12kDaのFab’Mal、20kDaのFab’Mal、30kDaのFab’Malの各々についてその非特異抑制効果を調べることとした。
ウサギ抗ヒトIgMポリクローナルIgG(自家製)をペプシンにて消化し、F(ab’)2を調製した。F(ab’)2は、150mmol/L NaCl含有200mmol/Lトリス(ヒトロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH8.2)にて5mg/mLに調製した。F(ab’)2は、10mmol/L 2−メルカプトエチルアミンにて37℃で30分間還元し、5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)をランニングバッファーとしてゲルろ過し、Fab’分画を回収した。5mg/mL Fab’溶液に、マレイミド基が結合した30kDaのポリエチレングリコール(日油社製)を加え、4℃で4時間攪拌しながら反応させた。反応液はゲルろ過し、Fab’Malの分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。同方法により、2kDa、5kDa、12kDa、20kDaの各分子量のFab’Malを調製した。
ウサギ抗ヒトIgMポリクローナルIgG(自家製)をペプシンにて消化し、F(ab’)2を調製した。F(ab’)2は、150mmol/L NaCl含有200mmol/Lトリス(ヒトロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH8.2)にて5mg/mLに調製した。F(ab’)2は、10mmol/L 2−メルカプトエチルアミンにて37℃で30分間還元し、5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)をランニングバッファーとしてゲルろ過し、Fab’分画を回収した。5mg/mL Fab’溶液に、5mmol/L N−エチルマレイミド(シグマアルドリッチ社製)を4℃で4時間攪拌しながら反応させた。反応液はゲルろ過し、チオール基封鎖Fab’の分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。
Fab’Mal及びチオール基封鎖Fab’による非特異抑制効果をラテックス凝集光学的測定法により検討した。利用した測定抗原はDダイマーであり、Dダイマー測定試薬[エルピアエースDダイマーII;三菱化学メディエンス]において上記記載の非特異反応を呈するヒト血漿であって、非特異反応物質がIgMであることを特徴とする2種類の試料(試料A及びB)を披検試料として用いた。測定は自動分析装置のHITACHI7170(日立ハイテクノロジー社製)によるオートメーション操作で実施した。HITACHI7170による測定においては、主に2つの操作を実施させた。第一操作では、測定対象の試料を第一試薬(以下、R1と称する)により希釈させた。第二操作では、Dダイマーに反応する抗体が固相化されたラテックス粒子を含有することを特徴とする第二試薬(以下、R2と称する)を前記反応液に添加させ、ラテックスの凝集反応を生じさせた。当該凝集反応を光学的にモニターすることで、披検体中のDダイマーあるいは非特異反応因子を定量することとした。本実施例においては、R1にFab’Mal又はチオール基封鎖Fab’を添加し、第一操作中に非特異反応物質を吸収することとした。R1にはFab’Mal又はチオール基封鎖Fab’が100mg/Lとなるように添加した。なお、本実施例にて用いたFab’Mal及びチオール基封鎖Fab’は、アフィニティークロマトグラフィーにより、フィブリン分解産物(Dダイマーを含む)に反応する成分を除去する操作を施した。測定試料、R1、R2の混合比は、7μL:125μL:125μLとした。ラテックスの凝集は800nmの波長で検出した。測定値は濃度既知のDダイマーを測定して得られた検量線から、吸光度の比較により測定値を算出した。
三菱化学メディエンス株式会社が販売する体外診断用試薬「エルピアエースDダイマーII」の構成試薬のラテックス試薬をR2試薬として用いた。当該製品は、Dダイマーに対し特異的な結合能を有するモノクローナル抗体を化学結合により結合された不溶性担体を構成成分とする試薬である。
結果を表1に示す。表1に示すように、何れの分子量のFabMal’でも非特異反応の抑制効果を示した。また、Fab’Malによる効果は分子量の大きさに依存する結果を示し、ポリエチレングリコールの修飾を施す場合、高分子のポリエチレングリコールを修飾させるほど非特異抑制効果が高いことが明らかとなった。
[目的]
実施例1の結果から、Fab’のように抗原認識部位が1つであっても、ポリエチレングリコールによる修飾を施すと非特異抑制効果を示すことが明らかとなった。また、修飾する分子量が大きい程、該効果は増強した。そこで本実施例においては、高分子を抗体断片に修飾すると、修飾しない場合に比し、非特異抑制効果が増すかを検討する目的で実施した。
非特異反応因子に反応するF(ab’)2を用い、スクシミド基を片側末端に含有する20kDaのポリエチレングリコールで化学修飾した、ポリエチレングリコール修飾F(ab’)2[以下、F(ab’)2Sucと称する]を調製した。同様にチオール基封鎖Fab’に、同ポリエチレングリコールで化学修飾した複合物(以下、Fab’Sucと称する)を調製した。抑制効果の比較は、本発明品であるF(ab’)2Suc、Fab’Suc、及びFab’Malと、F(ab’)2とを比較して実施した。なお、本実施例にて用いた抗体断片あるいは化学修飾を施した抗体断片は、同一のロットの抗体より調製した。
ウサギ抗ヒトIgMポリクローナルIgG(自家製)をペプシンにて消化し、F(ab’)2を調製した。また、実施例1記載の方法により、チオール基封鎖Fab’を調製した。F(ab’)2及びチオール基封鎖Fab’は、5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)を外液として透析を実施した。5mg/mL F(ab’)2又はチオール基封鎖Fab’溶液に、スクシミド基が結合した20kDaのポリエチレングリコール(日油社製)を加え、4℃にて12時間攪拌しながら反応させた。反応液はゲルろ過し、目的物であるF(ab’)2Suc及びFab’Sucの分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。
実施例1記載のアッセイ条件と同様の方法にて、ポリエチレングリコール修飾を施した抗体断片と、施さないF(ab’)2を比較することで非特異抑制効果を検討した。但し、本実施例においては、非特異反応抑制剤の添加濃度が0mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/LのR1において効果の評価をした。また、被検体として、実施例1で用いたのと同じ試料A及びBを使用した。
結果を図2(試料A)及び図3(試料B)に示す。図2に示すように、修飾を施さないF(ab’)2に比べ、20kDaのポリエチレングリコールを施したF(ab’)2Suc、Fab’Suc、及びFab’Malにおいては、著しく非特異抑制効果が増すことが明らかとなった。
[目的]
実施例2の結果が示すように、抗体断片をポリエチレングリコールにて修飾を施した場合、施さない場合に比べ顕著に非特異抑制効果が増強することが明らかとなった。そこで本実施例は、従来技術であるIgGの添加による効果と比較し、本発明の効果を明確にすることを目的とする。
20kDaのFab’Mal、IgG、F(ab’)2とで抑制効果の比較を実施した。上記3種類の物質は、同一のロットのIgGより調製した。
実施例1記載のアッセイ条件と同様の方法にて、非特異反応抑制効果の検討を実施した。但し、実施例3においてはIgG、F(ab’)2、20kDaのFab’Malをそれぞれ50mg/Lの濃度でR1へ添加し、検討に用いることとした。
結果を図4に示す。図4に示すように、高分子を修飾したFab’Malは、IgGやF(ab’)2に比べ、非特異抑制効果は著しく高いことが判明した。このことより、本発明品は少なくとも従来技術の、修飾されていないIgGよりも、非特異抑制効果の能力が高いことが示された。
[目的]
本発明の非特異反応抑制剤であるFab’Malは、IgGやF(ab’)2より非特異抑制効果が高いことが明らかとなった。次に従来技術で問題となった、免疫比ろう反応について検討することを目的として実施した。
免疫比ろう反応は、抗原とその抗体が高濃度で共存した場合に発生し易い。本実施例では、抗原としてヒトIgM(自家製)を用い、抗体に相当するものとして20kDaのFab’Malを用いることとした。IgGまたはFab’Malを、Dダイマー測定試薬のR1へ200mg/Lの濃度で添加した。一方、測定試料は、図5に示すように、ヒトIgMを0.99mg/mL〜5.9mg/mLの範囲で含む試料を用いた。一般に健常人のIgM濃度は1.00mg/mL〜1.5mg/mLとされている。本実施例では実際にヒト血漿あるいは血清を測定する場合に想定されるIgM濃度領域を含有する。免疫比ろう反応の影響はHITACHI7170にて800nmの波長で光学的に測定した。
HITACHI7170にて、試料、R1、R2をそれぞれ10μL、180μL、180μLの割合で反応させ、800nmの波長で検出し、吸光度の上昇を測定した。
結果を図5に示す。図5には、被検体の試料とR1液の混和開始からR2液が添加される直前までの吸光度の変化を示した。本条件では、吸光度の上昇が認められた場合に免疫比ろう反応が生じていると判断できる。
なお、800mg/Lの高濃度のFab’Malにおいても吸光度の上昇は認められないことを確認した。
[目的]
実施例4より、Fab’Malは免疫比ろう反応が生じにくいことが明らかとなった。次に本発明の保存に対する持続性について検討した。
1分子のF(ab’)2は2分子のFab’へ分解する。特にF(ab’)2をR1へ添加して保存した場合、容易にFab’へ分解される為、問題となる。Fab’は非特異抑制効果が弱く、非特異反応を起こす検体を測定した場合、経時的な値の上昇を認めるからである。実施例5においては、Fab’Malの保存安定性を明らかにする目的で、37℃で保存した場合の非特異抑制効果を検討した。一般に免疫学的測定用試薬は、4℃にて保存するのが適切な保存方法である。試薬を37℃で保存した場合、非特異抑制効果の劣化は4℃保存に比し,短時間で観察することが可能である。これは、30℃ないしは40℃においてはFab’への分解が加速されやすい為である。該温度域では、Fab’化の主要な因子である、プロテアーゼ様因子ないしは酸化還元反応の影響を受けやすい為である。本実施例においては、F(ab’)2の分解が特に顕著であり、実際試薬の劣化で問題となる要因となる、37℃での保存条件を選択し、Fab’Malの安定性を検討した例を示す。
F(ab’)2またはFab’Malを含有するR1試薬を調整し、当該R1試薬を37℃にて保存した場合の非特異反応の抑制効果を検討した。該抑制効果は前記試料Aの測定値を測定することにより評価した。
200mg/LのF(ab’)2またはFab’Malを含有させたR1を調整し、37℃で保存した場合の差を検討した。
本実施例においては、R1試薬を37℃にて17日間保存し、0日、5日、10日、17日の保存時点で試料Aを測定した。試料Aの測定はHITACHI7170にて、実施例1記載の条件と同様に実施した。
結果を図6に示す。図6に示すように、F(ab’)2はR1へ添加し37℃で保存した場合には試料Aの測定値が経時的に上昇した。一方,Fab’Malにあっては、17日まで測定値の経時的な上昇は認められなかった。このことより、Fab’MalはF(ab’)2で問題であった、保存性については安定であることが明らかとなった。
[目的]
Fab’Mal以外の実施例について検討する目的で、BSAをFab’のヒンジ部チオール基を介して結合させた複合体(以下、Fab’BSAと称する)を調製し、非特異抑制効果を検討した。
BSAの表面アミノ基を介して、マレイミド基とスクシミド基を構造に含む架橋剤であるEMCS(DOJIN社製)を反応させた。次に、Fab’に、EMCS化を施したBSAを結合させた。効果の測定は実施例1に記載の方法を準用した。但し、Fab’BSAは、0mg/L、33mg/L、66mg/L、133mg/Lで添加したR1を使用した。
BSA(SIGMA社製)を5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で5mg/mLに調製し、これに5mmol/LとなるようにEMCS(Dojin社)を添加した。37℃で1時間反応させ、ゲルろ過によりBSA分画を回収した。ゲルろ過のランニングバッファーは、200mmol/L Tris,150mMmol/L NaCl含有のトリス緩衝液(pH8.2)を用いた。抗ヒトIgM抗体からのFab’の調製は、実施例1記載の方法により実施した。EMCS修飾させたBSAと5mg/mLのFab’を混和し、4℃で16時間攪拌しながら反応させた。反応液はゲルろ過し、目的物であるFab’BSAの分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。ゲルろ過のランニングバッファーは5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)により調製した。
結果を表2に示すように、本発明の実施例の1つであるFab’BSAは濃度依存的に非特異抑制効果を示した。このことにより、Fab’はポリエチレングリコール特有の効果でなくBSAを結合させた場合においても同様の効果が得られることが明らかとなった。
[目的]
Fab’Mal、Fab’BSA以外の実施例について検討する目的で、ポリグルタミン酸をFab’のヒンジ部チオール基を介して結合させた複合体(以下、Fab’PGと称する)を調製し、非特異抑制効果を検討した。
ポリグルタミン酸のアミノ基末端のアミノ基を介して、マレイミド基とスクシミド基を構造に含む架橋剤であるEMCS(DOJIN社製)を反応させた。次に、Fab’に、EMCS化を施したポリグルタミン酸を結合させた。効果の測定は、実施例1に記載の方法を準用した。但し、Fab’PGは、0mg/L、5mg/L、50mg/L、100mg/Lで添加したR1を使用した。
分子量15kDa〜50kDaのポリグルタミン酸(SIGMA社製より購入)を5mg/mLで5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解し、これに5mmol/LとなるようにEMCS(Dojin社)を添加した。37℃にて1時間反応させ、ゲルろ過によりポリグルタミン酸の分画を回収した。ゲルろ過のランニングバッファーには200mmol/L Tris,150mmol/L NaCl含有のトリス緩衝液(pH8.2)を用いた。抗ヒトIgM抗体からのFab’の調製は実施例1記載の方法により実施し、濃度が5mg/mLになるように、5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で調製した。EMCS修飾させたポリグルタミン酸とFab’を混和し、4℃で16時間攪拌しながら反応させた。反応液はゲルろ過し、目的物であるFab’PGの分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。ゲルろ過のランニングバッファーは5mmol/L EDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)を用いた。
結果を表3に示す。表3に示すように、本発明の実施例の1つであるFab’PGは、濃度依存的に非特異抑制効果を示した。このことにより、非特異抑制効果の獲得はポリエチレングリコール、BSAに特有の効果でなくポリグルタミン酸を結合させた場合においても同様の効果が得られることが明らかとなった。
[目的]
Fab’Mal、Fab’BSA、Fab’PG以外の実施例について検討する目的で、多糖類であるデキストランをFab’のアミノ基を介して結合させた複合体(以下、Fab’DXとする)を調製し、非特異抑制効果を検討した。
デキストランの官能基の一部をアルデヒド基に活性化された市販品を用い、当該アルデヒド基とチオール基封鎖したFab’のアミノ基を結合させ、Fab’DXを調製した。効果の測定は実施例1に記載の方法を準用した。ただしFab’DXは、0mg/L、27mg/L、53mg/L、80mg/L、101mg/L、133mg/L、195mg/Lで添加したR1を使用した。
分子量40kDaの活性化デキストランのカップリングキット(ピアス社製)を購入し、推奨されたプロトコールに準じてFab’とのカップリングを実施した。チオール基封鎖のFab’は実施例1記載の方法にて調製した。10mgの活性化デキストラン(リン酸緩衝液で5mg/mL溶解)と、5mgのチオール基を封鎖したFab’(リン酸緩衝液で5mg/mL溶解)と、0.4mLシアノボロハイドライド溶液(Cyanoborohydride solution)とを混和した。37℃で24時間攪拌反応させ、Trisが終濃度200mmol/Lとなるように、1mol/L Tris緩衝液(pH7.2)を添加し、37℃で1時間反応させた。反応液は、ゲルろ過し、目的物であるFab’DXの分画を回収し、5mg/mL程度まで濃縮した。ゲルろ過のランニングバッファーは5mmol/L MEDTA含有50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)を用いた。
結果を表4に示す。表4に示すDダイマーの測定値の単位はμg/mLである。表4に示すように、本発明の実施例の1つであるFab’DXは濃度依存的に非特異抑制効果を示した。このことにより、非特異抑制効果の獲得はポリエチレングリコール、BSA、ポリエチレングリコールに特有の効果でなくデキストランを結合させた場合においても同様の効果が得られることが明らかとなった。また、結合方法においてもFab’のアミノ基を標的としてポリマーを結合させた場合であっても効果を示すことができることを確認できた。
[目的]
実施例1〜8では、IgMに起因する非特異反応について実施例を示した。本実施例ではIgAに起因する非特異反応における本発明品の効果を検討した。非特異反応抑制剤には、ヒトL鎖に親和性を示す抗体より得られたFab’をポリエチレングリコールにて修飾して得られる抗体断片複合体[以下、Fab’(L)Malとする]を用いた。ヒト免疫グロブリンのL鎖は、IgG、IgM、IgA、IgE型のいずれもの構成ドメインとして共通に保持されているため、ヒトL鎖への結合能を示す抗体は前記ヒト免疫グロブリンの何れにも結合し得る。従って、抗ヒトL鎖抗体は、IgM、IgG、IgA等に起因する非特異反応の何れをも阻害することが期待される。本実施例においては、抗IgM抗体以外の抗体を使用した場合の発明の実施例を示すと共に、当該抗体断片をポリエチレングリコールにより修飾することで、当該抗体断片による阻害効果が向上することの確認を行うことを目的とした。
Fab’(L)Malは、抗ヒトL鎖抗体のFab’から、実施例1記載のFab’Malの調製方法と同様の方法を使用して調製した。IgA型の非特異検体におけるFab’(L)Malの抑制効果は、Fab’(L)Malの調製に用いた抗体断片のF(ab’)2による効果と比較して検討した。測定試薬はDダイマーとし、当該試薬のR1へ50mg/Lの濃度で抗体タンパク質を添加し、非特異抑制効果の比較をした。測定試料には、IgAに起因する非特異反応を生じる試料Eを用いた。
結果を表5に示す。表5に示すDダイマーの測定値の単位はμg/mLである。本発明の実施例の1つであるFab’(L)Malは試料Eに対し、非特異抑制効果を示した。またこの抑制効果は、同タンパク質量のF(ab’)2を添加した場合と比較すると、著しく強い効果を示すことが明らかとなった。本実施例において、抗IgM抗体以外の抗体より得られる本発明品であっても非特異抑制効果を示すことが明らかとなった。また従来技術より強い抑制効果を示すことが確認できた。試料EのDダイマーの真値は、試料を予め抗IgA抗体と接触させ、非特異反応の原因である抗体因子を除去したうえでDダイマー値を測定し、得られた値を示す。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (8)
- 非特異反応因子に特異的に結合する抗体又はその断片と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定用の非特異反応抑制剤。
- 前記高分子化合物が、多糖類、タンパク質、及び有機高分子重合体からなる群から選んだ化合物である、請求項1に記載の非特異反応抑制剤。
- 有機高分子重合体がポリエチレングリコールである、請求項1又は2に記載の非特異反応抑制剤。
- 前記高分子化合物の分子量が200Da〜1000kDaである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の非特異反応抑制剤。
- 抗体断片が、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、L鎖、H鎖、又はrIgGである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の非特異反応抑制剤。
- 抗体又はその断片と高分子化合物との結合が、チオール基、アミノ基、ヒドロキシル基、若しくはカルボキシル基を利用する化学修飾、又はビオチン−アビジン結合によるものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の非特異反応抑制剤。
- 非特異反応因子に特異的に結合する抗体又はその断片と高分子化合物との複合体を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法。
- 免疫学的測定方法が、ラテックス凝集光学的測定法、エンザイムイムノアッセイ、免疫比ろう法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、又は放射免疫測定法である、請求項7に記載の免疫学的測定方法。
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