JPH11211727A - ポリエチレングリコール誘導化生体分子及び不均質検出法におけるその使用 - Google Patents

ポリエチレングリコール誘導化生体分子及び不均質検出法におけるその使用

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JPH11211727A JP10313811A JP31381198A JPH11211727A JP H11211727 A JPH11211727 A JP H11211727A JP 10313811 A JP10313811 A JP 10313811A JP 31381198 A JP31381198 A JP 31381198A JP H11211727 A JPH11211727 A JP H11211727A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 サンプル中の被検体を検出する際の固相への
非特異的結合を減じる方法であって、先行技術の欠点を
少くとも部分的に回避することが可能な新規な方法を提
供する。 【解決手段】 被検体の検出方法あるいはそのような方
法の適した試薬キットにおけるポリアルキレンオキシド
修飾試薬の使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中の被検
体の検出方法及びそのような方法に適する試薬キットに
係わる。
【０００２】
【従来の技術】固相を使用するサンプル中の被検体の検
出方法は、不均質試験形式と呼ばれている。そのような
方法における問題は、サンプルまたは試験試薬の成分が
非特異的に固相に結合することが多く、これにより誤っ
た試験結果が生じることである。この非特異的結合は、
体液、例えば血清や血漿からのサンプルにおいて特によ
く見られる。この非特異的結合を抑制するために、例え
ばTween 20のような界面活性物質を試薬に加えることが
できる(WO 88/07683)。さらに、金属表面(Whitesides
ら、Science 252 (1991), 1164-1166)、及び酸化物表面
(EP-A-0 664 452)を、反応性ポリエチレングリコール誘
導体で官能化し、表面の非特異的結合を最小限にできる
ことが知られている。
【０００３】非特異的結合を減らすために使用される先
行技術の表面活性物質は、それらが固相受容体のような
固相に結合する分子を置換し、それにより試験の機能を
損なうという欠点を有する。さらに、工業的規模で生産
された洗剤表面活性剤は不均質な組成を有し、不純物を
含むこともあるが、このようなものが通常は表面活性物
質として使用される。結果として生じるバッチの変動に
より、干渉や再現性のない結果が往々にして生じる。さ
らに、タンパク質のような感受性がある固相分子の構造
は表面活性物質によって撹乱され得、そしてそれらは最
終的に変性され得る。
【０００４】先行技術により知られるポリエチレングリ
コールによる金属または酸化物表面の官能化は、ある種
の表面に限定される一方、固相表面に適用される生体分
子の層に対する非特異的結合を防止するのに十分でない
という面もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、サンプル中の被検体を検出する際の固相への非特異
的結合を減少させる方法であって、先行技術の欠点を少
くとも部分的に回避することが可能な新規な方法を提供
することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の形態は、
(a) 固定された形態で、被検体特異的固相反応物と、ポ
リ(C2-C3)-アルキレンオキシドに結合された被検体非特
異的生体分子とを含む固相を製造し、(b) サンプルを前
記固相及び試験試薬とインキュベートし、(c) サンプル
中の被検体の存在及び／又は量を検出する段階を含む、
サンプル中の被検体を検出する方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】ポリアルキレンオキシド、特に、
ポリエチレングリコール修飾被検体非特異的生体分子で
固相をブロックすることにより、同時に有意に試験の感
度を劣化させることなく、固相へのサンプル成分の非特
異的結合がかなり減少された。ブロッキング試薬は、固
相反応物の固定化の間及び／又は後に加えることができ
る。被検体特異的固相反応物で予備的にコーティングさ
れた固相を、特に好ましくは後に被検体非特異的生体分
子でブロックする。
【０００８】「規定された試験」領域、即ち不活性な領
域により他の試験領域から空間的に隔てられた、固相反
応物でコーティングされた規定された領域を有する固相
を使用することによって良好な結果が得られた。被検体
非特異的プレコーティング、例えばストレプトアビジン
で領域全体がコーティングされ、1つの被検体特異的固
相反応物上に固定された少くとも1つの空間的に限定さ
れた試験領域を含む固相が特に好ましい。規定された試
験領域は、好ましくは10μm〜10 mmの直径を有する。10
μm〜2 mmの直径を有する小型化された試験領域が特に
好ましい。さらに固相は、異なる被検体特異的固相反応
物を含み得る、アレーシステムとも呼ばれる複数の試験
領域を有するものが好ましい(例えばアメリカ特許第5,4
32,099号、第5,516,635号、及び第5,126,276号を参
照)。これらのアレーシステムは、1つのサンプルで複数
の被検体の測定を同時に行なうことを可能とする。
【０００９】本発明の方法における固相は、任意の支持
体を含み、プラスチック、ガラス、金属あるいは金属酸
化物表面を有する支持体のような非多孔性の支持が好ま
しい。また、試験ストリップのような多孔性の支持体も
適している。被検体特異的固相反応物、即ち、測定され
る被検体、あるいは競争的な試験形式の場合には測定さ
れる被検体の類似体と特異的に相互作用することができ
る生体分子を固相上に固定する。被検体特異的固相反応
物の例としては、抗体、抗原、ペプチド、ハプテン、核
酸、核酸類似体、糖タンパク質、糖、リポタンパク質、
その他の生体分子等が挙げられる。
【００１０】固相反応物は、公知の方法、例えば、直接
の吸着結合、共有結合、あるいは好ましくは高アフィニ
ティ結合対により固定することができる。このために
は、固相を最初に高アフィニティ結合対の第一のパート
ナーで被覆し、そしてこの上に、結合対の第二のパート
ナーとの固相反応物の抱合体を固定する。適当な高アフ
ィニティ結合対の例としては、ストレプトアビジンある
いはアビジン/ビオチンあるいはビオチン誘導体(例え
ば、デスチオビオチン、イミノビオチン、アミノビオチ
ン、あるいはストレプトアビジンもしくはアビジンに対
して高いアフィニティで結合できるその他の物質)、抗
体/ハプテン(例えば、ジゴキシゲニン、フルオレセイン
等)、抗体/抗原(例えば、ペプチドあるいはポリペプチ
ド)、レクチン/糖、及び受容体/リガンド(例えば、ホル
モン受容体/ホルモン)等が挙げられる。ストレプトアビ
ジンまたはアビジン/ビオチンは高アフィニティ結合対
として特に好ましく使用される。
【００１１】本発明の方法は、好ましくは、ブロッキン
グ物質として作用するアルキレンオキシド修飾結合分子
とインキュベートすることにより被検体特異的固相反応
物で既に被覆された固相上の非特異的結合部位をブロッ
キングすることを含む。インキュベートの持続期間と温
度は広い範囲内で変化させることができ、例えば4℃〜4
0℃のインキュベーション温度及び1分〜1時間のインキ
ュベーション時間とすることができる。
【００１２】適するブロッキング物質は、固相に結合が
でき、検出方法に干渉しない被検体非特異的または不活
性生体分子であり、例えばアルブミンのようなタンパク
質、非特異的抗体もしくはその断片、あるいはデキスト
リンのような多糖類等である。ブロッキング物質は、吸
着または共有結合による相互作用で固相に結合されるこ
とができる。しかし、高アフィニティ結合対による結合
が好ましい。特に、高アフィニティ結合対によって固定
された固相反応物を含む固相の場合、例えば１以上のポ
リアルキレンオキシド残基を含むビオチン化されたタン
パク質のような結合対の第二のパートナーを含むブロッ
キング物質が好ましく使用される。あるいは、１以上の
ポリアルキレンオキシド残基が結合対の第二のパートナ
ーに直接結合されたブロッキング物質を使用することも
好ましい。
【００１３】好ましいブロッキング物質は、一般構造式
(Ia)または(Ib)： Pr-(AOn)T]m (Ia) Pr-I-[-(AOn)T]m (Ib) の抱合体である。式中、Pは高アフィニティ結合対のパ
ートナーであり、Iは生体分子であり、rは1から10の数
であり、AOは(C2-C3)アルキレンオキシド基であり、nは
5から500の数であり、Tは好ましくはOH、C1-C4アルコキ
シ及びアシルから選択される末端基であり、mは1〜10の
数である。
【００１４】Pは、好ましくはハプテン、ビオチンまた
はビオチン誘導体である。Pは、特に好ましくはビオチ
ンまたはビオチン誘導体である。Iは、好ましくはポリ
ペプチドまたは糖である。式(Ia)の抱合体中、rは好ま
しくは1である。AOは、(C2-C3)アルキレンオキシド基、
即ちエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシド基
とすることができる。AOは好ましくはエチレンオキシド
基であるが、エチレンオキシドとプロピレンオキシド基
の組み合わせも適している。nは好ましくは10〜250の数
であり、特に好ましくは20〜200である。
【００１５】Tは、その他の試験及びサンプル成分と適
合する、即ち望ましくない反応を有意に導入しない末端
基(ポリオキシアルキレン単位の末端O原子を含む)であ
る。好ましくは、Tはヒドロキシ基、C1-C4アルキルエー
テル基、特にメトキシ、あるいはC1-C4アシル基、例え
ばアセチル基である。構造式(Ia)の抱合体中、mは好ま
しくは1である。
【００１６】構造式(Ia)及び(Ib)の抱合体は、検出法に
おけるブロッキング試薬として好ましく使用される。固
相上への固定化の後、それらは好ましくはサンプルまた
は試験試薬中の溶解した生体分子に成分Pを介して高い
アフィニティで結合することができなくなるものであ
る。本発明の別の主題は、1以上の抱合体(Ia)及び／又
は(Ib)と好ましくは被検体特異的固相反応物を含むコー
ティングを有する固相である。本発明の抱合体を使用し
て、例えば免疫学的方法あるいは核酸ハイブリダイゼー
ション法におけるような、被検体の検出方法における固
相への非特異的結合を減少させることができる。本発明
の第一の形態の別の主題は、他の試験成分に加えて本発
明の抱合体あるいは本発明の固相を含む、被検体の検出
のための試薬キットである。
【００１７】特に好ましい態様においては、1つの鎖端
においてビオチン残基で官能化されたPEG鎖であるビオ
チンポリエチレングリコール化合物を使用する。他の鎖
端は、好ましくはヒドロキシルまたはメトキシ基を有す
る。ビオチン-PEG抱合体は、ビオチン化被検体特異的固
相反応物、例えば抗体の後あるいは同時に、ストレプト
アビジン固相に適用される。抱合体は、依然として接近
できるストレプトアビジン固相の遊離のビオチン結合部
位に結合する。非結合ビオチン-PEG抱合体は洗浄によっ
て除去することができる。得られる固相は、機能を害す
ることなくこの状態で乾燥することができる。本発明の
抱合体で処理された表面の非特異的結合は、未処置の表
面と比較して、あるいは非アルキレンオキシド修飾ブロ
ッキング物質で処理された表面と比較して大きく減少す
る。別の利点は、本発明の固相がブロッキング抱合体で
処理することもでき、従って固相反応物の適用の後に所
望の特性を与えることができることである。規定された
試験領域と連続的なプレコーティングを有する固相にお
いては、試験領域のみならずそれらの試験領域の外部
(例えば、空のストレプトアビジン固相)において、非特
異的結合がかなり減少する。固相の被検体を結合する能
力は、驚くほど影響を受けていないままに残る。
【００１８】本発明の二番目の形態は、(a) ポリ(C2-
C3)-アルキレンオキシドに結合した修飾固相反応物を使
用して固相反応物が固定された固相を製造し、(b) サン
プルを固相及び試験試薬とインキュベートし、(c) サン
プル中の被検体の存在及び／又は量を検出する段階を含
む、サンプル中の被検体を検出する方法である。
【００１９】本発明のこの二番目の形態によれば、ポリ
アルキレンオキシド-修飾された固相反応物を固相上に
固定する。一方で、修飾固相反応物は、汎用性のある固
相反応物、即ち被検体と特異的に反応することができな
いが、固相上に共有結合、吸着、あるいは高アフィニテ
ィ結合対により固定された別の固相反応物と反応できる
反応物とすることができる。汎用性のある固相反応物の
例としては、例えば、ビオチン化されたあるいはハプテ
ン-抱合被検体特異的な別の固相反応物と反応すること
ができる、ストレプトアビジンあるいは抗ハプテン抗体
が挙げられる。また、他方、あるいはその上に、被検体
特異的固相反応物はポリアルキレンオキシド-修飾固相
反応物とすることができる。
【００２０】汎用性のある修飾固相反応物は、例えば高
アフィニティ結合対のパートナーあるいは高アフィニテ
ィ結合対のパートナーとの被検体非特異的生体分子の抱
合体とすることができる。それ自体が高アフィニティ結
合対のパートナーである汎用性のある固相反応物の例と
しては、ストレプトアビジン、アビジン、ハプテン特異
的抗体、レクチン、それらのポリマー抱合体等のような
ポリペプチドが挙げられる。一方、高アフィニティ結合
対のパートナーとの被検体非特異的生体分子の抱合体、
例えばビオチン、ビオチン誘導体、ハプテンあるいは糖
に結合された不活性なポリペプチドあるいは多糖を、汎
用性のある固相反応物として使用することもできる。
【００２１】被検体特異的修飾固相反応物を使用する場
合でも、これが高アフィニティ結合対のパートナーとの
抱合体であることが好ましい。そのような被検体特異的
修飾固相受容体の例としては、被検体特異抗体、抗原、
核酸、核酸類似体、レクチン等が挙げられる。本発明の
二番目の形態の1つの態様においては、一般構造式(I
I)： F[-(AOn)T]m (II) の抱合体を使用する。式中、Fはレクチン、ストレプト
アビジン、アビジン及び抗体から選択されるポリペプチ
ドであり、rは1から10の数であり、AOはC2-C3-アルキレ
ンオキシド基であり、nは5から500の数であり、Tは好ま
しくはOH、C1-C4アルコキシ及びC1-C4アシルから選択さ
れる末端基であり、mは1〜10の数であり、前記抱合体
は、好ましくは、固相上への抱合体の固定化の後もなお
高いアフィニティで可溶性反応物に結合することができ
る少なくとも１つの結合部位を有するものである。
【００２２】さらに別の好ましい態様においては、一般
構造式(III)の抱合体を使用する。 P'r'Fr[-(AO)n-T]m (III) 式中、P'は高アフィニティ結合対のパートナーであり、
r'は1から10の数であり、Fは生体分子であり、rは1から
10の数であり、AO、n、T及びmは構造式(II)の抱合体に
ついて定義した通りである。
【００２３】構造式(II)及び(III)の抱合体は、検出法
において汎用性のあるあるいは被検体特異的な固相反応
物として好ましく使用される。また、本発明の二番目の
形態は、一般構造式(II)及び／又は(III)の抱合体を含
むコーティングを有する固相に係わる。抱合体は、例え
ば免疫学的な方法あるいは核酸ハイブリダイゼーション
法のような被検体の測定方法における固相に対する非特
異的結合を減少させるために使用することができる。本
発明の二番目の形態はさらに、他の試験成分に加えて一
般構造式(II)及び／又は(III)の抱合体、またはそのよ
うな抱合体でコーティングされた固相を含む、被検体の
検出用の試薬キットに関する。
【００２４】本発明の三番目の形態は、(a) 被検体特異
的固相反応物を固定した固相を製造し、(b) サンプルを
前記固相、及びポリ(C2-C3)-アルキレンオキシドに結合
した被検体特異的修飾可溶性反応物を含む試験試薬とイ
ンキュベートし、(c) サンプル中の被検体の存在及び／
又は量を検出する段階を含む、サンプル中の被検体を検
出する方法に関する。
【００２５】本発明のこの形態においては、修飾された
可溶性の被検体特異的反応物、即ち、測定される被検体
及び／又は被検体類似体に特異的に結合することができ
る生体分子を使用する。修飾された可溶性の反応物は直
接標識することができ、即ち、例えば酵素、蛍光、電気
化学発光標識基を有することができる。一方、可溶性の
反応物は間接的に標識することもでき、即ち検出可能な
標識基と反応する基を有するものであり、例えば標識抗
ハプテン抗体と反応できるハプテンを有するものとす
る。
【００２６】修飾された可溶性の反応物は、好ましくは
抗体、抗原、核酸、核酸類似体及びレクチンから選択さ
れる。本発明のこの三番目の形態によれば、一般構造式
(IV)の抱合体が好ましく使用される。 Ms-F"-[-(AO)nT]m (IV) 式中、Mは標識基または標識基と反応することができる
基であり、sは１〜10の数であり、F"は特に、抗体、抗
原、核酸、核酸類似体及びレクチンから選択される可溶
性の生体分子であり、AO、n、T及びmは構造式(II)の抱
合体について定義した通りである。
【００２７】これらの抱合体は、被検体を測定するため
の方法、特に、免疫学的測定方法、核酸ハイブリダイゼ
ーション法あるいは糖-レクチン測定法において、固相
に対する非特異的結合を減少させるために使用すること
ができる。さらに、本発明のこの三番目の形態は、他の
試験成分に加えて一般式(IV)の抱合体を含む被検体の検
出用の試薬キットに関する。
【００２８】本発明の四番目の形態は、ポリ(C2-C3)-ア
ルキレンオキシドに結合された物質を含む少くとも1種
の試薬を使用することを特徴とする、サンプル中の被検
体を検出する方法において固相に対する非特異的結合を
減少させる方法に関する。ポリ(C2-C3)-アルキレンオキ
シドに結合される物質は、好ましくは、(i) ブロッキン
グ物質、(ii)汎用性のある固相反応物、(iii) 被検体特
異的固相反応物、及び(iv)可溶性反応物から選択され
る。
【００２９】前記方法においては1種より多い物質のア
ルキレンオキシド修飾種を使用することが好ましい。本
発明のこの四番目の形態の一つの主題は、好ましくは前
に挙げた物質種の1種から選択されるポリ(C2-C3)-アル
キレンオキシドに結合された物質を含む少くとも1種の
試薬を含む、被検体の検出のための試薬キットである。
【００３０】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
【００３１】
【実施例】1.ビオチン-ポリエチレングリコール(PEG)抱
合体(MW 3499)の合成
【００３２】
【化１】
【００３３】550 mgの1-アミノ-PEG(Shearwater Polyme
rs Co.)を10 mlのジオキサンに溶解した。60 mgのトリ
エチルアミンをこの溶液に加え、その後、100 mgのビオ
チン-OSu-エステル(Boehringer Mannheim)を加えた。混
合物を2.5時間室温で攪拌した。その後生成物をカラム
クロマトグラフィーによって精製した。収量は30%であ
った。 2.ビオチン-メトキシポリエチレングリコール抱合体(MW
5000)の合成
【００３４】
【化２】
【００３５】150 mgのアミノメトキシ-PEG(Sigma Co.)
を100 mlのジオキサンに溶解し、その後60 mlのDMFに溶
解した2 gのビオチン-OSuエステルを加えた。40 mgのト
リエチルアミンを添加した後、3時間室温で、その後さ
らに3時間70℃で攪拌した。溶媒をその後除去し、生成
物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量
は57%であった。 3.ビオチン-PEG固相の製造 TSHに対するビオチン化抗体を、約0.1 mmの直径の領域
の形態で、微細投与法によりストレプトアビジン固相
(熱重合されたウシ血清アルブミン(BSA)に結合したスト
レプトアビジンでコーティングされたp-スチレン)に適
用した。抗体領域の適用の後、この固相を50μg/mlのBi
-PEGを含むリン酸バッファーpH 7.5で再処理した。これ
を2分間インキュベートした後、再洗浄し、乾燥した。 4. Bi-PEGでコーティングされた固相に対する非特異的
結合の分析 実施例３に記載した方法によって製造した固相を下記の
ようにして評価した。被検体を含まないサンプル物質(p
24-非含有ヒト血清あるいはEnzymun(登録商標)-TSH 0標
準)とのインキュベート及びその後の洗浄段階の後、ヒ
ト血清とインキュベートした固相を、ジゴキシゲニン化
検出試薬とともにインキュベートした(p24-Dig抱合体、
及び抗ヒトIgG-抗体-Dig抱合体と)。これらのジゴキシ
ゲニン化試薬はTSH抗体に対して特異的でなく、即ちそ
れらは被検体を含まないが、非特異的結合のレベルの標
識を有する。洗浄段階の後、抗Dig抗体で標識した蛍光
染色ラテックスにより非特異的結合を測定した。蛍光顕
微鏡法により得られたシグナルを光学画像評価によって
定量化し、カウント/秒として表した。試験領域内(ビオ
チン化されたTSH抗体を含む)、及び試験領域の外側(抗
体コーティングのないバックグラウンド)の蛍光強度を
測定した。
【００３６】
【００３７】
【表２】
【００３８】全ての場合において、Bi-PEGの添加により
固相上の非特異的結合がかなり減少した。 5.ストレプトアビジン-ポリエチレングリコール抱合体
の合成 ストレプトアビジン及びPEG-OSuをリン酸バッファーに
溶解し、それぞれの場合について所望の化学量論、好ま
しくは1：１〜１：５で添加して合わせた。2時間の室温
での反応後(?)、反応混合物を0.05%アジ化ナトリウムを
含むリン酸バッファーに対して透析し、4℃で貯蔵し
た。 6.汎用性のあるストレプトアビジン-PEG固相の製造 100μg/mlの濃度のビオチン化キャリアータンパク質(BS
A-ビオチンまたはサーモ-BSA-ビオチン)を含む溶液で反
応容器を満たし、5分間室温でインキュベートした。そ
の後溶液を吸引し、コーティングされた反応容器をリン
酸バッファーで洗浄し、再度吸引した。その後、ストレ
プトアビジン-PEGを1% BSAを含むリン酸バッファー中50
μg/mlの濃度で加え、15分間インキュベートした。その
後溶液を吸引し、1%BSA及び2%スクロースを含むリン酸
バッファーを加えて洗浄した。再度吸引し乾燥した後、
固相を気密の包装中で4℃で貯蔵した。 7.特異的なストレプトアビジン-PEG固相の製造 100μg/mlの濃度のビオチン化キャリアータンパク質を
含む溶液で反応容器を満たし、5分間室温でインキュベ
ートした。溶液を吸引し、リン酸バッファーで洗浄し、
再度吸引した。その後、1% BSAを含むリン酸バッファー
中のストレプトアビジン-PEG(50μg/ml)を加え、15分間
インキュベートした。溶液を吸引し、リン酸バッファー
で洗浄し、再度吸引した。
【００３９】その後、例えばモノクローナル抗TSH抗体F
ab'2断片(5μg/ml)のようなビオチン化抗体を加え、15
分間インキュベートした。溶液を吸引し、1%BSA及び2%
スクロースを含むリン酸バッファーを加えて洗浄し、再
度吸引した。乾燥した後、固相を気密の包装中で4℃で
貯蔵した。 8.1 ストレプトアビジン-PEG固相の評価 実施例6または7からの固相を含む反応容器を、予備希釈
した被検体非含有サンプル(ローディングバッファー50
mMトリス/HCl pH 7.5、0.5% BSA、0.05% Tween20、0.9%
NaClで１：１に希釈したウマ血清)とともに20分間室温
でインキュベートした。洗浄の後、それをシグナル抗体
(ローディングバッファー中1μg/mlのモノクローナル抗
TSH抗体IgG-ジゴキシゲニン抱合体)の存在下に20分イン
キュベートし、再度洗浄した。
【００４０】検出試薬(モノクローナル抗ジゴキシゲニ
ン抗体IgGでコーティングしたフルオロビーズの0.01%溶
液)を添加した後、20分インキュベートし、洗浄し、蛍
光シグナルを測定した。
【００４１】
【表３】 8.2 バッファー成分の非特異的結合 実施例6または7からの固相を含む反応容器を、実施例8.
2において記載したウマ血清サンプルで満たし、洗浄し
た。その後ローディングバッファー中の0.2μg/mlのp24
-ジゴキシゲニンを加え、20分間インキュベートし、洗
浄した。そして検出試薬(8.1参照)を加え、再び20分間
インキュベートし、洗浄し、蛍光シグナルを測定した。
結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】 8.3 ヒトIgG抗体の非特異的結合 実施例6及び7で製造した固相を含む反応容器を、実施例
8.1に記載したサンプルで満たし、洗浄した。サンプル
はローディングバッファーで1：19に希釈したヒト血清
であった。
【００４３】その後、ローディングバッファー中1.0μg
/mlのモノクローナル抗ヒトIgG抗体-ジゴキシゲニン抱
合体を加え、洗浄した。次いで検出試薬を加え、20分間
インキュベートし、再び洗浄し、蛍光シグナルを測定し
た。結果を下記表５に示す。
【００４４】
【表５】 9.抗体-PEG抱合体の製造 ストレプトアビジンの代わりにビオチン化抗体を使用し
たことを除いて実施例5に記載したようにPEG-抗体抱合
体を製造した。 10. PEG-抗体抱合体で被覆した固相の製造 反応容器に100 μg/mlのビオチン化キャリアータンパク
質(BSA-ビオチンまたはtBSA-ビオチン)を含む溶液を入
れ5分間インキュベートした。その後溶液を吸引し、リ
ン酸バッファーで洗浄し、再度吸引した。
【００４５】その後1% BSAを含むリン酸バッファー中の
50μg/mlのストレプトアビジンを加え、15分間インキュ
ベートした。溶液を吸引し、リン酸バッファーで洗浄
し、再度吸引した。その後5μg/mlのビオチン化IgG抗
体、例えばモノクローナル抗TSH-Fab'2抗体断片を加
え、15分間インキュベートした。溶液を吸引し、1%BSA
及び2%スクロースを含むリン酸バッファーで洗浄する段
階を行った。再度吸引した後、容器を乾燥し気密の包装
中で4℃で貯蔵した。 11. 評価 11.1ブランク値 実施例10で製造した固相のブランク値を実施例8.1に記
載したように測定した。結果を表6に示す。
【００４６】
【表６】 11.2バッファー成分の非特異的結合 実施例10で製造した固相に対するバッファー成分の非特
異的結合を実施例8.2に記載したように測定した。結果
を表7に示す。
【００４７】
【表７】 11.3ヒト抗体(IgG)の非特異的結合の測定 実施例10で製造した固相に対するヒトIgG抗体の非特異
的結合の測定を実施例8.3に記載したように行った。結
果を表8に示す。
【００４８】
【表８】 実施例12 <HIV I>試験のための手順と陰性サンプルによる試験結
果 HIV Iウイルスのgp41を提示する抗原を、ポリスチレン
支持体上の約100μmの直径の試験領域に適用した。サン
プルバッファーで予備希釈した30μlのサンプルを試験
領域上にピペットで取り、震盪しながら室温で20分間イ
ンキュベートした。サンプルを吸引し、洗浄バッファー
で試験領域を洗浄した後、HIV I抗原を提示するDig-標
識されたgp41を含む30μlの試薬溶液をピペットで加
え、それを震盪しながら再度室温で20分間インキュベー
トした。試薬溶液を吸引し、洗浄バッファーで試験領域
を洗浄した後、30μlの検出試薬を試験領域上にピペッ
トで加えた。抗-Dig抗体で共有結合により被覆された10
0 nmのサイズの蛍光染色ラテックス粒子が検出試薬とな
る。
【００４９】次にこの検出試薬を震盪しながら20分間室
温でインキュベートし、その後吸引し、洗浄し、吸引に
より乾燥した。試験領域を633 nmの波長のHeNeレーザー
により照射し、波長670 nmの蛍光をCCDカメラで測定し
た。以下の試験-特異的試薬を使用した。 固相抗原：gp41ペプチドからなるポリハプテン 検出抗原：Digにより標識されたgp41ペプチドからなる
ポリハプテン 以下の測定値(カウント)を測定した。
【００５０】
【表９】
【００５１】上記の表は、特異性試験から抽出したもの
を示す。約240の<HIV I>陰性サンプルをこの試験におい
て測定した。大部分のサンプル(例えば陰性サンプル1〜
4)は試験領域上で反応を示さず、従って明らかに陰性で
あった。しかし、4つのサンプル(陰性サンプル5〜8)が
試験領域上で強い非特異的反応を示したことが見出さ
れ、従って偽陽性として検出された。 実施例13 PEG-誘導化固相抗原による特異性の改良 この実験においては<HIV I>試験を実施例12と同様に行
った。それに対し、1：1の化学量論的割合のPEG 500に
より誘導化された同じ抗原をHIV I抗原の次に同じ試験
支持体にさらに適用した。
【００５２】以下の測定値が得られた。
【００５３】
【表１０】
【００５４】この結果は、<HIV I>試験領域における干
渉サンプルの非特異的結合が、新規なPEG-誘導化抗原を
使用することによって実質的に減少され、全ての4つの
干渉サンプルが陰性となっていることを示している。驚
くべきことに、PEG-誘導化はさらに陽性サンプルのシグ
ナルの強い増加をもたらすこともできた(陽性対照及び
陽性サンプル1を参照)。 14. HBs-抗原の検出 HBs抗原に対するモノクローナル抗体を、ポリスチレン
支持体上の約100μmの直径の試験領域に適用した。PEG
抱合体(製造実施例9)の形態の同じ抗体を別の試験領域
に適用した。サンプルバッファーで予備希釈した30μl
のサンプルを試験領域上にピペットで加え、震盪しなが
ら20分間室温でインキュベートした。サンプルを吸引
し、洗浄バッファーで試験領域を洗浄した後、ジゴキシ
ゲニン標識した抗HBsAg抗体を含む30μlの試薬溶液をピ
ペットで加え、それを震盪しながら20分間室温で再度イ
ンキュベートした。溶液を吸引し、洗浄バッファーで試
験領域を洗浄した後、30μlの検出試薬(実施例8.3)を試
験領域上にピペットで加えた。
【００５５】検出は実施例8.1に記載したようにして行
った。陽性標準、陰性標準、並びにHBsAgを含まないが
それにもかかわらず固相との被検体非特異的相互作用に
よりこの試験において有意な陽性シグナルを示す5つの
陰性血清について調べた。これらの実験の結果を表11に
示す。PEG誘導化抗体の非特異的結合が未処理の抗体の
ものよりも非常に低いことが明らかに判る。
【００５６】
【表１１】
【００５７】
【発明の効果】本発明により、サンプル中の被検体の検
出方法及びそのような方法に適する試薬キットが提供さ
れる。本発明の方法によれば、サンプル中の被検体を検
出する際の固相への非特異的結合を減じることができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター スルカ ドイツ連邦共和国 ディー−82362ヴァイ ルハイム，シュトラーセ−アナ ヴェク 17 (72)発明者 ヨハン カール ドイツ連邦共和国 ディー−82380パイセ ンベルグ，ベルト−シュラツルセール−シ ュトラーセ ７ (72)発明者 ヘルムット レンズ ドイツ連邦共和国 ディー−82327トゥツ ィング，ボン−クールマン−シュトラーセ 14 (72)発明者 ウォルフガング マター ドイツ連邦共和国 ディー−82347ベルン リード，アム ニューランド ７

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 固定された形態で、被検体特異的固
    相反応物と、ポリ(C 2-C3)-アルキレンオキシドに結合さ
    れた被検体非特異的生体分子とを含む固相を製造し、
    (b) サンプルを前記固相及び試験試薬とインキュベート
    し、(c) サンプル中の被検体の存在及び／又は量を検出
    する段階を含む、サンプル中の被検体を検出する方法。
  2. 【請求項２】 少くとも1つの規定された試験領域を有
    する固相を使用する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 高アフィニティ結合対の第一のパートナ
    ーにより被覆され、この上に結合対の第二のパートナー
    との被検体特異的固相反応物の抱合体を固定した固相を
    使用する請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 結合対の第二のパートナーを含むブロッ
    キング物質を使用する請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 １以上のポリアルキレンオキシド残基が
    結合対の第二のパートナーに直接結合されたブロッキン
    グ物質を使用する請求項３または４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 一般構造式(Ia)または(Ib)： Pr-(AOn)T]m (Ia) Pr-I-[-(AOn)T]m (Ib) （式中、Pは高アフィニティ結合対のパートナーであ
    り、Iは不活性キャリアーであり、rは1から10の数であ
    り、AOは(C2-C3)アルキレンオキシド基であり、nは5か
    ら500の数であり、Tは好ましくはOH、C1-C4アルコキシ
    及びC1-C4アシルから選択される末端基であり、mは1〜1
    0の数である）の抱合体。
  7. 【請求項７】 Pがビオチンまたはビオチン誘導体であ
    る請求項６に記載の抱合体。
  8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の抱合体を含む
    コーティングを有する固相。
  9. 【請求項９】 被検体の検出方法における固相への非特
    異的結合を減少させるための請求項６または７に記載の
    抱合体の使用。
  10. 【請求項１０】 他の試験成分に加えて請求項６または
    ７に記載の抱合体あるいは請求項８に記載の固相を含
    む、被検体の検出のための試薬キット。
  11. 【請求項１１】 (a) ポリ(C2-C3)-アルキレンオキシド
    に結合した修飾固相反応物を使用して固相反応物が固定
    された固相を製造し、(b) サンプルを固相及び試験試薬
    とインキュベートし、(c) サンプル中の被検体の存在及
    び／又は量を検出する段階を含む、サンプル中の被検体
    を検出する方法。
  12. 【請求項１２】 一般構造式(II)： F[-(AOn)T]m (II) （式中、Fはレクチン、ストレプトアビジン、アビジン
    及び抗ハプテン抗体から選択される高アフィニティ結合
    対のパートナーである生体分子であり、rは1から10の数
    であり、AOはC2-C3-アルキレンオキシド基であり、nは5
    から500の数であり、Tは好ましくはOH、C1-C4アルコキ
    シ及びC1-C4アシルから選択される末端基であり、mは1
    〜10の数である）の抱合体。
  13. 【請求項１３】 一般構造式(III)： P'r'Fr[-(AO)n-T]m (III) （式中、P'は高アフィニティ結合対のパートナーであ
    り、r'は1から10の数であり、Fは生体分子であり、rは1
    から10の数であり、AO、n、T及びmは請求項12に定義し
    た通りである）の抱合体。
  14. 【請求項１４】 請求項12または請求項13の抱合体を含
    む、コーティングを有する固相。
  15. 【請求項１５】 被検体の測定方法における固相に対す
    る非特異的結合を減少させるための請求項12または13に
    記載の抱合体の使用。
  16. 【請求項１６】 他の試験成分に加えて請求項12または
    13に記載の抱合体、または請求項14に記載の固相を含
    む、被検体の検出用の試薬キット。
  17. 【請求項１７】 (a) 被検体特異的受容体を固定した固
    相を製造し、(b) サンプルを前記固相、及びポリ(C2-
    C3)-アルキレンオキシドに結合した被検体特異的修飾可
    溶性反応物を含む試験試薬とインキュベートし、(c) サ
    ンプル中の被検体の存在及び／又は量を検出する段階を
    含む、被検体を検出する方法。
  18. 【請求項１８】 一般式(IV)： Ms-F"-[-(AO)nT]m (IV) （式中、Mは標識基または標識基と反応することができ
    る基であり、sは１〜10の数であり、F"は測定される被
    検体に特異的に反応することができる可溶性の生体分子
    であり、AO、n、T及びmは請求項12に定義した通りであ
    る）の抱合体。
  19. 【請求項１９】 被検体を測定方法における、固相に対
    する非特異的結合を減少させるための請求項18に記載の
    抱合体の使用。
  20. 【請求項２０】 他の試験成分に加えて請求項19に記載
    の抱合体を含む、被検体の検出用の試薬キット。
  21. 【請求項２１】 ポリ(C2-C3)-アルキレンオキシドに結
    合された物質を含む少くとも1種の試薬を使用する、サ
    ンプル中の被検体を検出する際の固相に対する非特異的
    結合を減少させる方法。
  22. 【請求項２２】 ポリ(C2-C3)-アルキレンオキシドに結
    合された物質を含む少くとも1種の試薬を含む、被検体
    の検出のための試薬キット。
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